牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-1)熒光定量PCR檢測方法的建立及應用*

王 吉 付 瑞 李曉波 王淑菁 王莎莎 李 威 秦 驍 黃宗文 鞏 薇 岳秉飛 賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 國家實驗動物微生物遺傳檢測中心，北京 100050)

牛皰疹病毒I型(Bovine herpesvirus type 1,BHV-1)主要引起牛傳染性鼻氣管炎，又稱牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)。BHV-1屬皰疹病毒科，甲型皰疹病毒亞科[1-3]。BHV-1感染又稱紅鼻病或牛傳染性壞死性鼻炎，是一種急性接觸性傳染病，臨床特征為呼吸困難和發(fā)熱，有鼻炎、鼻竇炎、喉炎和氣管炎為特征[4-7]。除能引起呼吸道疾病外，還可引起結膜炎、流產(chǎn)、腦炎和全身性感染[8-9]。OIE將其列為(通報疾病)B類疫病，在我國將其列為二類動物疫病，是我國進出境動物和國際動物貿易中規(guī)定的重點檢疫對象[10-11]。病毒主要存在于鼻、眼、陰道分泌物和排泄物中[12-13]。本病主要由飛沫經(jīng)呼吸道傳播，吸血昆蟲(軟殼蜱等)也可傳播本病。在自然條件下，各種年齡和品種的牛均易感，一般發(fā)病率為20%～100%，死亡率為1%～12%[2，14-15]。在國內外的養(yǎng)牛場廣泛流行,大部分省份的奶牛、肉牛、牦牛等均有不同程度感染,是一種嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)的傳染病[11，16]。

隨著牛源性生物制品開發(fā)利用的日益增多，人們對牛源性制品是否潛在病毒污染，對潛在病毒是否會通過直接或間接途徑對人造成危害或者傳染病的擴散也越來越關注[17]。為保障人民用藥的安全及避免傳染病的擴散，最大限度地降低使用牛源性生物制品而引起牛皰疹病毒1型傳播的風險，實驗建立了特異、敏感，操作快速、簡便的BHV-1 實時熒光定量PCR方法，用于開展對牛及人用牛源性生物制品及原輔材料可能潛在的BHV-1 的檢測，對保證牛源性材料及牛源性制品的使用安全性、保障人民的用藥安全至關重要。

1 材料與方法

1.1 病毒及樣品

牛皰疹病毒1型(Bovine herpesvirus type 1,BHV-1)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type3,BPIV3)、牛病毒性腹瀉病毒1型(Bovine viral diarrhea virus type 1，BVDV1)、貓皰疹病毒Ⅰ型(Felid herpesvirus 1，F(xiàn)HV-1)購自美國ATCC(編號分別為VR-188、VR-281、VR-1422、VR-636)；豬偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、單純皰疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus 1，HSV-1)：本室保存；BHV-1 pGEM-T Easy-pol質粒標準品：委托寶生物工程(大連)有限公司合成；145份牛血漿樣本(編號分別為X1～X145)：來自內蒙古自治區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場和北京市某奶牛和肉牛飼養(yǎng)單位；36批次人用牛源樣本(編號：Ny1-Ny36)：國內7省市11個廠家和國外2個廠家提供。

1.2 主要試劑及主要儀器

RNA快速提取試劑盒購自Qiagen公司；逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司；Taq DNA聚合酶和100 bp DNA marker均購自TaKaRa公司；TaqMan Gene Expression Master Mix：美國ABI公司；PCR儀：美國Bio-RAD公司；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀：美國Bio-RAD公司PwerPac Basic；凝膠成像分析儀：美國 Kodak公司 GL212Pro；熒光定量PCR儀：美國Applied Biosystems公司7500fast Real-Time PCR System。

1.3 引物及探針的設計合成

分析已報道的BHV-1基因組序列，將不同株進行比對，根據(jù)GenBank中登陸的BHV-1gB基因(序列號：AJ004801.1)，采用ABI PrimerExpress 3.0實時熒光定量PCR引物設計軟件，設計合成TaqMan探針及引物。探針的熒光標記選擇FAM(5’端)作為報告發(fā)光基團,NFQ(3’端)為淬滅基團，引物和探針由美國ABI公司合成。序列如下(見表1)：

表1 用于擴增gB基因的引物與TaqMan探針序列Table 1 The sequences of primers and TaqMan probes to used for amplification gB gene

1.4 病毒DNA/RNA提取

按照DNA/RNA快速提取試劑盒操作方法，對正常牛腎細胞(Bovine kidney cells，MDBK細胞)、BHV-1感染MDBK細胞毒、BPIV3、BVDV1、PRV、FHV-1、HSV-1進行DNA/RNA提取。提取的DNA樣本凍存于-70 ℃冰箱備用。提取的RNA樣本立即進行cDNA合成。

1.5 實時熒光定量PCR擴增體系及標準曲線的建立

1.5.1通過優(yōu)化在熒光定量PCR反應體系中使用的探針和引物濃度，確定最佳反應條件，建立實時熒光定量PCR檢測方法[18-20]。

在96孔板中按以下體系加樣，每個樣品做3個重復：

Mix10μL滅菌水8μL探針+引物1μLDNA1μL總體積20μL

反應條件為：先50 ℃保持2 min；然后95 ℃預變性10 min；最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)，在每個循環(huán)的延伸結束時進行熒光信號檢測。

1.5.2用含有目的片段的BHV-1質粒pGEM-T Easy-pol作為標準品，根據(jù)公式copies /μL=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)，算出BHV-1質粒標準品拷貝數(shù)。將其稀釋為108～100copies/μL凍存?zhèn)溆?。?07～102copies/μL作為模板按上述反應體系及反應條件進行實時熒光定量PCR反應，建立標準曲線[18-19]。

1.6 特異性試驗

分別以BHV-1感染MDBK細胞毒、BPIV3、BVDV1、PRV、FHV-1、HSV-1及正常MDBK細胞的DNA/cDNA為模板，用建立的Q-PCR方法進行擴增，檢測方法的特異性。

1.7 敏感性試驗

取108～100copies/μL標準品用建立的熒光定量PCR進行檢測，每個濃度標準品各做3個復孔。所能檢測的最小濃度梯度的循環(huán)閾值(CT)≤35,拷貝數(shù)(copies)≥10時,此濃度為方法的檢測靈敏度[17-18]。

1.8 重復性和穩(wěn)定性試驗

取107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL 3個不同濃度陽性標準品，用建立的方法分3個不同時間重復檢測3次，計算批間變異系數(shù)，評價本方法的重復性和穩(wěn)定性[18-19]。

1.9 判斷標準的制定

建立的標準曲線參數(shù)Slope在-3～-3.5之間、R2大于或等于0.99、Eff%在90%～110%之間，實驗成立可用于定量檢測。

樣品循環(huán)閾值(CT)≤35,同時拷貝數(shù)(copies)≥10,判定該樣品檢測結果為陽性；循環(huán)閾值(CT)≤35、拷貝數(shù)(copies)<10，或者循環(huán)閾值(CT)>35、拷貝數(shù)(copies)≥10，或者循環(huán)閾值(CT)>35、拷貝數(shù)(copies)<10,此樣品超出檢測限，不能確定被檢樣品是陽性樣品，結果判為陰性[18-19]。

(3)智慧城市市民抱怨、智慧城市預期與智慧城市建設滿意度呈現(xiàn)負相關得到驗證(H5，H6)，且在0.05水平下是顯著的。這表明較高的市民期望值會對智慧城市的建設發(fā)展產(chǎn)生些許的負面影響，如果市民對智慧城市建設的期望太高，市民在享受服務之后的實際心理感知與期望值相比差距較大，那么市民的滿足性預期得不到滿足，市民對智慧城市建設的抱怨就會增多，因而降低了市民的滿意度。

1.10 應用

1.10.1取145份牛血漿樣本(編號為X1～X145)按照DNA快速提取試劑盒操作方法提取樣本DNA，同時設BHV-1、正常MDBK細胞對照。用建立的方法分2次對10倍稀釋的145份血漿樣本DNA進行檢測。

1.10.2取36批次人用牛源生物制品及人用牛源生物制品生產(chǎn)用原材料樣本(編號：Ny1～Ny36)按1.10.1方法進行檢測。36批次牛源生物制品及原材料具體信息見表2。

表2 36批次牛源樣本信息Table 2 The information of 36 bovine origin samples

2 結果

2.1 標準陽性質控品的制備

經(jīng)拷貝數(shù)計算公式copies/μL=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNAlength×660)計算，BHV-1質粒標準品原濃度分別為1.12×1011copies/μL。

2.2 實時熒光定量PCR標準曲線的構建

用含有目的片段的質粒標準品，分別設為1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101copies /μL，作為模板進行實時熒光定量PCR反應。擴增曲線各稀釋梯度間距均勻，線性范圍和標準曲線各參數(shù)結果見圖1。

結果顯示，標準曲線參數(shù)Slope(應在-3～-3.5之間)、R2值(應≥0.99)，擴增效率Eff%(應在90%～110%之間)均優(yōu)于Q-PCR標準規(guī)定范圍，說明建立的方法相關性高，定量結果有效，可用于BHV-1的定量檢測。

圖1 1×107～1×101 copies/μL標準品的標準曲線Fig.1 The amplification curve of 1×107-1×101 copies/μL standard

2.3 實時熒光定量PCR檢測方法的特異性實驗

結果如圖2所示，BHV-1感染MDBK細胞毒有明顯擴增曲線，在標準曲線參數(shù)符合要求的條件下，其循環(huán)閾值CT值為24.721，拷貝數(shù)為2.42×104copies/μL，檢測結果為陽性。BPIV3、BVDV1、PRV、FHV-1、HSV-1及正常MDBK細胞無曲線擴增，檢測結果均為陰性。說明所建方法特異性良好。

圖2 BHV-1 Q-PCR特異性檢測結果注：1：BHV-1；2～7：BPIV3、BVDV1、FHV-1、PRV、HSV-1、MDBK細胞Fig.2 Specific test results of BHV-1 Q-PCRNote：1:BHV-1;2-7:BPIV3,BVDV1,FHV-1,PRV,HSV-1,MDBK cell

2.4 熒光定量PCR檢測方法靈敏度檢測

圖3、圖4可知，標準品稀釋到1.0×101copies時有明顯擴增曲線，CT值為32.139，實際檢測拷貝數(shù)為13.234copies，仍在可信范圍之內；1.0×100copies時有擴增曲線，CT值為35.539，拷貝數(shù)為0.772copies，已超出可信范圍。所以臨界稀釋度為1.0×101時，其對應的拷貝數(shù)為10，因此最低檢測限度為10個copies。說明建立的熒光定量PCR方法具有很高的靈敏度。

圖3 1×108～1×100 copies/μL標準品的標準曲線Fig.3 The standard curve of 1×108-1×100 copies/μL standard

圖4 1×108～1×100 copies/μL標準品的擴增曲線Fig.4 The amplification curve of 1×108-1×100 copies/μL standard

2.5 實時熒光定量PCR方法重復性和穩(wěn)定性實驗

起始濃度分別為1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL的標準品的最終實測值的均值分別為1.083×106、0.9248×105、0.9832×104copies/μL，對應CTSD值及CV值見表3。3個濃度梯度3次重復實驗Ct值的變異系數(shù)(CV)均小于5%，表明方法重復性、穩(wěn)定性良好。

表3 熒光定量PCR檢測方法的重復性和穩(wěn)定性試驗結果Table 3 The repeatability and stability testing results of Q-PCR

2.6 實時熒光定量PCR方法的應用

2.6.1血漿樣本檢測結果

利用建立的方法，對145份牛血漿樣本(編號分別為X1～X145)分2次進行檢測。第1次檢測前64份血漿樣本(編號X1～X64),第2次檢測后81份血漿樣本(編號X65～X145)。

在標準曲線參數(shù)符合要求、陰陽對照成立的條件下，依據(jù)結果判定標準，結果顯示有6份牛血漿樣本(X9、X10、X121、X133、X135、X145)BHV-1核酸陽性。其他139份樣本均為陰性。145份牛血漿樣本檢測結果陽性率為4.14%(6/145)。

表4 熒光定量PCR方法檢測145份血漿樣本陽性結果Table 4 The positive results of Q-PCR to detect 145 plasma samples

樣本X1～X64的擴增曲線見圖5，相應的標準品擴增曲線圖見圖6；樣本X65～X145的擴增曲線見圖7，相應的標準品擴增曲線圖略。2次檢測標準曲線相關參數(shù)見表5。

圖5 64份(X1～X64)血漿樣本擴增曲線Fig.5 The amplification curve of 64 plasma samples

圖6 檢測64份血漿樣本的標準品擴增曲線Fig.6 The standard amplification curve of detection 64 plasma samples

圖7 81份(X65～X145)血漿樣本擴增曲線Fig.7 The amplification curve of 81 plasma samples

2.5.2牛源性樣本檢測結果

在標準曲線參數(shù)符合要求、陰陽對照成立的條件下，結果顯示36份牛源性樣本均為陰性，擴增結果見圖8，相應標準曲線擴增曲線圖略。標準曲線參數(shù)見表5。

圖8 36份牛源性樣本擴增曲線Fig.8 The standard amplification curve of 36 bovine origin samples

表5 3次樣本檢測標準曲線參數(shù)Table 5 The results of Q-PCR to detect positive samples

從表5中可以看出3次樣本檢測標準曲線相關系數(shù)Slope均在-3～-3.5之間、R2值均≥0.99、擴增效率Eff%均在90%～110%之間，說明3次檢測結果定量有效。

3 討論

牛鼻氣管炎病(皰疹病毒Ⅰ型感染)OIE將其列為(通報疾病)B類疫病，我國將其列為二類動物疫病[9-10]，其傳播范圍廣，危害大。目前國內外雖已建立了多種檢測方法，包括血清學及PCR檢測方法等[5-6，9-11,17，21-23]，但未見有針對牛源性制品及牛源制品原輔材料外源BHV-1 檢測的報道，中國藥典亦沒有關于牛源制品及原輔材料檢測的規(guī)定[24]。中國藥典在“新生小牛血清檢測”中雖然有關于新生牛血清用細胞接種法和免疫熒光法檢測病毒的規(guī)定，但沒有更為敏感特異的分子生物學檢測方法，針對人用牛源性材料及人用牛源性生物制品的檢測目前在我國還幾乎是空白[17]。

實驗室在建立BHV-1 PCR檢測方法的基礎上[17]，建立了操作更為簡便、特異、敏感的BHV-1熒光定量PCR檢測方法。其目的主要是用于牛及牛源性材料、人用牛源性生物制品潛在污染BHV-1的檢測。如小牛血清去蛋白注射液、牛肉浸液、牛膽膏、牛骨粉、牛骨源性明膠，及其用于生產(chǎn)上述制品的原材料牛血漿、牛組織等，均可能攜帶外源BHV-1。制品或原材料攜帶的病原體及其代謝產(chǎn)物可能直接感染人或動物引起人和動物本身的危害，或者通過制品或原材料污染傳播疾病，導致傳染性疾病的流行爆發(fā)，或病毒核酸或蛋白可能導致免疫抑制、退行性病變或癌基因的活化等潛在危害[17]。

實驗雖然沒有從國內11個廠家和國外2個廠家的36份牛源性制品及生產(chǎn)制品的原材料血漿中檢測出BHV-1，但是通過對來自內蒙古某飼養(yǎng)場和北京某飼養(yǎng)單位的牛血漿進行檢測，發(fā)現(xiàn)2家單位的牛均有BHV-1感染，而且實驗室之前通過PCR方法也從2家單位的牛樣本中檢測到BHV-1[17]。我們不僅證明了建立的方法確實可以用于牛及牛源樣本BHV-1感染的檢測，同時也證明用于牛源制品生產(chǎn)的原材料血漿中確實存在BHV-1的污染可能，無疑會給人民用藥及傳染病的傳播帶來潛在的風險。甚至有報道從BHV-1自然感染的牛的牛奶中檢測到BHV-1[15]，因此本實驗室建立的方法不僅可以用于牛源生物制品及原輔材料的檢測，還可用于牛奶等牛源性食品的檢測，以保障牛源性食品的安全，防止牛鼻氣管炎病的傳播與擴散。

實驗通過敏感性、特異性、重復性、穩(wěn)定性方法學評價，證明建立的方法可用于牛及牛源性生物制品及其原輔材料攜帶外源病毒的檢測，填補了我國在牛源生物制品檢測技術方面的空白，為試劑盒的研發(fā)及檢測技術的推廣奠定了基礎，為在全國范圍內推動牛源制品及原輔材料外源BHV-1檢測提供了技術支撐，同時也為制定牛源生物制品外源病毒檢測技術操作規(guī)程和相關國家標準奠定了基礎。