實(shí)驗(yàn)小鼠腎勻漿中肽酶-3樣本穩(wěn)定性分析

王 洪 魏 杰 馮育芳 劉雅丹 項(xiàng)新華 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

能力驗(yàn)證計(jì)劃是通過實(shí)驗(yàn)室間檢測結(jié)果的比對來衡量實(shí)驗(yàn)室能力的活動(dòng)，是實(shí)驗(yàn)室證明其檢測技術(shù)能力水平的一種手段。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制是保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可靠程度的根本手段[1]。通過開展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物領(lǐng)域的能力驗(yàn)證計(jì)劃，可以增加實(shí)驗(yàn)室間的技術(shù)交流，了解各實(shí)驗(yàn)室在肽酶-3項(xiàng)目的檢測技術(shù)水平和能力，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并解決檢驗(yàn)中存在的問題，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室提高檢測水平，從而推動(dòng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)的進(jìn)步?；诖?，中國食品藥品檢定研究院(國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測中心)組織實(shí)施能力驗(yàn)證項(xiàng)目“NIFDC-PT-106 實(shí)驗(yàn)小鼠腎勻漿中肽酶-3的檢測”。原有的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14927.1—2001中推薦使用了13個(gè)用于實(shí)驗(yàn)大鼠和小鼠的遺傳質(zhì)量評價(jià)的生化標(biāo)記位點(diǎn)，國家標(biāo)準(zhǔn)修訂后，更正為14個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)。肽酶-3是國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14927.1—2008修訂時(shí)，新增的位點(diǎn)。國家標(biāo)準(zhǔn)修訂后，廣泛開展肽酶-3位點(diǎn)檢測的實(shí)驗(yàn)室并不多，有必要組織實(shí)施該項(xiàng)目的能力驗(yàn)證活動(dòng)來考察實(shí)驗(yàn)室的檢測能力。

生化標(biāo)記法中14個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)均為蛋白質(zhì)成分，肽酶-3也不例外。肽酶-3對溫度敏感，對保存時(shí)限也有要求。作為能力驗(yàn)證項(xiàng)目，有必要對肽酶-3樣本的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

能力驗(yàn)證樣品的穩(wěn)定性考察是能力驗(yàn)證工作順利開展必不可少的環(huán)節(jié)，同時(shí)也是能力驗(yàn)證計(jì)劃實(shí)施成敗與否的關(guān)鍵因素，更是關(guān)乎能力驗(yàn)證活動(dòng)結(jié)論可信度的重要條件。基于此，本研究針對影響肽酶-3穩(wěn)定性的兩個(gè)主要因素：溫度和時(shí)間，進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以期獲得肽酶-3樣本的保存條件和運(yùn)輸條件，在項(xiàng)目實(shí)施過程中加以利用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：20只SPF級8周齡雄性C57BL/6小鼠和15只SPF級8周齡雌性BABL/c小鼠，均來源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]。20只SPF級8周齡雌性CBA小鼠，來源于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 樣品制備

本次能力驗(yàn)證項(xiàng)目提供的被測樣品為小鼠腎勻漿的凍干樣品。制備方法：采用頸椎脫臼法處死動(dòng)物，剖腹，取小鼠腎臟，加入預(yù)冷的蒸餾水，蒸餾水與腎臟的比例為2∶1(V/W)。用組織勻漿器勻漿，然后置4 ℃低溫高速離心機(jī)中，15 000 r/min，30 min。取上清，加保護(hù)劑，分裝，每瓶裝量70 mg/瓶，用凍干機(jī)凍干。小鼠腎勻漿凍干樣品為紅色固體。加蓋，封口膜封口，封口袋包裝。采用隨機(jī)數(shù)字方式編號。貯藏條件為密封，2～8 ℃冷藏[2-4]。

1.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

1.3.1分別將時(shí)間和溫度設(shè)為橫、縱坐標(biāo)，設(shè)定-20 ℃，4℃，室溫和37℃4個(gè)溫度檢驗(yàn)點(diǎn)，設(shè)定1、2、3、4、5、6、7、14 d和28 d為9個(gè)時(shí)間檢驗(yàn)點(diǎn)，在每個(gè)坐標(biāo)交點(diǎn)，每個(gè)型別的樣品分別隨機(jī)抽取1瓶進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.3.2在取出日期，依據(jù)GB/T 14927.1—2008對樣品進(jìn)行檢測，觀測穩(wěn)定性結(jié)果。所有樣品均需加入70 μL蒸餾水還原。

1.3.3記錄各型別不穩(wěn)定結(jié)果出現(xiàn)的時(shí)間和溫度，當(dāng)不穩(wěn)定點(diǎn)出現(xiàn)后，其之后的時(shí)間溫度觀測點(diǎn)隨之取消，37 ℃的樣本穩(wěn)定性同時(shí)檢測1～6天的結(jié)果。但即使一直穩(wěn)定，本測定的觀測周期也僅為28 d時(shí)長。

1.3.4匯總穩(wěn)定性結(jié)果，填寫各自時(shí)間溫度穩(wěn)定性結(jié)果報(bào)告單。穩(wěn)定用“○”表示，不穩(wěn)定用“×”表示。

1.3.5穩(wěn)定性結(jié)果判定：每觀測點(diǎn)每型別均抽取1瓶，電泳染色。如發(fā)現(xiàn)任何1瓶發(fā)生條帶模糊不可讀，則認(rèn)為在該點(diǎn)樣品的穩(wěn)定性已經(jīng)發(fā)生了變化，即在該時(shí)間溫度條件下該型別樣品不穩(wěn)定。

注：A代表CBA樣本，B代表BALB/c樣本，C代表C57BL/6樣本
Note:A shows CBA samples,B shows BALB/c samples,C shows C57BL/6 samples

2 結(jié)果

肽酶-3樣本選用了3個(gè)品系的小鼠進(jìn)行制備。共制備85份CBA樣本，82份BALB/c樣本，82份C57BL/6樣本。樣本總數(shù)為249份。

肽酶-3樣本在37 ℃觀測至第6天，該樣本僅能穩(wěn)定保存1 d，在保存至第2天時(shí)，條帶模糊，無法辨認(rèn)。2～6 d均為模糊條帶。在4 ℃、室溫和-20 ℃可以穩(wěn)定保存至28 d。詳見表2。

表2 肽酶-3樣本的穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of stability detection for PEP3 samples

如圖1所示，在室溫條件下，3個(gè)品系的3類樣本放置1 d和2d的電泳條帶，清晰可見。如圖2所示，在4 ℃條件下，3個(gè)品系的3類樣本放置3 d和4 d的電泳條帶，清晰可見。如圖3所示，在-20 ℃條件下，3個(gè)品系的3類樣本放置5 d和6d的電泳條帶，清晰可見。如圖4所示，在-20 ℃條件下，3個(gè)品系的3類樣本放置14 d和28 d的電泳條帶，清晰可見。

圖1 在室溫條件下放置1 d和2d的肽酶-3樣本電泳圖注：1：A37；2：A93；3：B40;4:B12；5:標(biāo)準(zhǔn)1(b)；6：標(biāo)準(zhǔn)2(a)；7:C46；8:C68Fig.1 Electrophoresis map of 1 day and 2 days at room temperatureNote:1：A37；2：A93；3：B40;4:B12;5:Marker1(b)；6：Marker2(a);7:C46;8:C68

圖2 在4 ℃條件下 放置3 d和4 d的肽酶-3樣本電泳圖注：1:A20；2:A99；3:B70；4：B89；5:標(biāo)準(zhǔn)1(b)；6:標(biāo)準(zhǔn)2(a)；7:標(biāo)準(zhǔn)3(a)；8:C72；9:C54Fig.2 Electrophoresis map of 3 dasy and 4 days at 4 ℃Note:1:A20；2:A99；3:B70；4：B89；5:Marker 1(b)；6:Marker 2(a)；7:Marker 3(a)；8:C72；9:C54

圖3 在-20 ℃條件下放置5～6 d的肽酶-3樣本電泳圖注：1:A27；2:A13；3:B93；4：B83；5:標(biāo)準(zhǔn)1(b)；6:標(biāo)準(zhǔn)2(a)；7:標(biāo)準(zhǔn)3(a)；8:C43；9:C74Fig.3 Electrophoresis map of 5 days and 6 days at -20 ℃Note:1:A27；2:A13；3:B93；4：B83；5:Marker 1(b)；6:Marker 2(a)；7:Marker 3(a)；8:C43；9:C74

圖4 C樣本在室溫，4 ℃，-20 ℃條件下放置14 d和28 d的肽酶-3樣本電泳圖注：1:C86；2:C92；3:C69；4：C60；5:標(biāo)準(zhǔn)1(b)；6:標(biāo)準(zhǔn)2(a)；7:標(biāo)準(zhǔn)3(a)；8:C39；9:C14Fig.4 Electrophoresis map of C sample in 14 days and 28 days at room temperature,4 ℃ and -20 ℃Note:1:C86；2:C92；3:C69；4：C60；5:Marker 1(b)；6:Marker 2(a)；7:Marker 3(a)；8:C39；9:C14

3 討論

3.1 貯存溫度

溫度升高將導(dǎo)致蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性喪失，酶的生物學(xué)功能失效。生化標(biāo)記方法是通過生物化學(xué)方法染色來識別不同品系動(dòng)物在各生化標(biāo)記位點(diǎn)的差異。一旦酶的生物學(xué)功能喪失，將無法通過酶的不同蛋白表型將不同品系的動(dòng)物區(qū)分開來。肽酶-3能力驗(yàn)證活動(dòng)中，各實(shí)驗(yàn)室將獲得3份不同蛋白表型的樣本。因此肽酶-3樣本的穩(wěn)定性尤為重要。在溫度的選擇上，考慮到能力驗(yàn)證樣品在運(yùn)輸，存儲和檢驗(yàn)過程中可能出現(xiàn)的極端條件，本研究選擇了4個(gè)溫度點(diǎn)：37 ℃，室溫，4 ℃和-20 ℃。選擇室溫，而不是設(shè)定為25 ℃，是希望溫度條件盡量接近真實(shí)情況。北京1～2月的室溫在20 ℃左右，肽酶-3樣品可穩(wěn)定保存至28 d?？紤]到南北方的氣候差異，北方的室溫10 ℃，南方可能是40 ℃。所以，室溫的存放時(shí)間應(yīng)因地域而異。在4 ℃和-20 ℃，肽酶-3樣本可以穩(wěn)定保存至28 d。因此，在樣本制備完成到發(fā)放樣品之前，樣本應(yīng)保存在-20 ℃條件下；樣本的運(yùn)輸應(yīng)保存在4 ℃以下的容器中；如果條件允許，最好也存放于-20 ℃條件下；接收樣本的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)在第一時(shí)間將樣本轉(zhuǎn)移至低溫冰箱。溫度是導(dǎo)致肽酶-3樣本不穩(wěn)定的首要因素，因此，樣本的貯存和運(yùn)輸必須嚴(yán)格控制溫度。

3.2 貯存時(shí)間

依據(jù)能力驗(yàn)證項(xiàng)目的實(shí)施周期，包括運(yùn)輸和檢驗(yàn)的時(shí)間，可在28 d內(nèi)全部完成。所以沒有進(jìn)行更長期的穩(wěn)定性檢驗(yàn)。肽酶-3樣本在37 ℃條件下僅能穩(wěn)定保存1 d，在其他3個(gè)溫度檢驗(yàn)點(diǎn)可以穩(wěn)定保存至28 d。因此，樣本應(yīng)新鮮制備，如果長期存放，應(yīng)進(jìn)行長期穩(wěn)定性考察[5-6]。接收樣本的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在接收樣品后盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果不能及時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)在第一時(shí)間將樣本轉(zhuǎn)移至低溫冰箱保存。因?yàn)閰⒓訉?shí)驗(yàn)室遍布全國各地區(qū)，對于路途較遠(yuǎn)，交通不便的地區(qū)，樣本應(yīng)區(qū)別對待，應(yīng)采取更多的控溫措施，例如：保證足夠數(shù)量的干冰。樣本保存的時(shí)間越長，穩(wěn)定性出現(xiàn)偏差的風(fēng)險(xiǎn)越大。尤其應(yīng)縮短樣本在室溫的保存時(shí)間。

3.3 肽酶-3位點(diǎn)的特殊性

國家標(biāo)準(zhǔn)中的14個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)，對溫度的敏感程度各不相同，不同位點(diǎn)應(yīng)采取不同的保存條件。不同位點(diǎn)需要分別做穩(wěn)定性檢驗(yàn)。肽酶-3是對溫度較為敏感的一個(gè)位點(diǎn)，應(yīng)采取有效措施保證運(yùn)輸途徑和貯存條件的低溫狀態(tài)。在能力驗(yàn)證提供者認(rèn)可評審以及監(jiān)督評審中，樣本的穩(wěn)定性檢驗(yàn)都是重要的考察項(xiàng)[7-9]。

通過本研究發(fā)現(xiàn)肽酶-3樣本在室溫，4 ℃和-20 ℃，可以穩(wěn)定保存至28 d，而在37 ℃僅能穩(wěn)定1 d。說明肽酶-3是一類對溫度較為敏感的蛋白質(zhì)。依據(jù)能力驗(yàn)證樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)可以為肽酶-3項(xiàng)目的順利實(shí)施提供技術(shù)保障。在該項(xiàng)目的實(shí)施過程中，有必要嚴(yán)格控制肽酶-3樣本的保存條件和運(yùn)輸條件。