實驗動物常見支原體熒光定量PCR檢測方法建立

辛聞婷 楊媛媛 王馨宇 吳 東 李靈恩

(江蘇集萃藥康生物科技有限公司，南京 210061)

支原體(Mycoplasma)屬于柔膜體綱(Mollicutes)，支原體目(Mycoplasmatales)，支原體科(Mycoplasmataceae)，是能夠在無生命培養(yǎng)基上生長的最小微生物[1]。迄今為止，很多研究表明支原體對實驗動物和細胞有不同程度的污染[2-6]，給科研、教學、生產領域相關的實驗結果造成了很大的影響。

目前針對支原體的檢測方法有多種[7-8]，主要有病原分離鑒定法、血清學檢測方法(間接免疫熒光法、酶聯免疫吸附試驗、免疫組化方法、間接血凝試驗等)和分子生物學檢測方法(PCR、熒光定量PCR、環(huán)介導等溫擴增技術等)。其中，病原分離鑒定方法所需周期較長(2～3周)、技術要求高；而免疫學方法容易和其它病原發(fā)生交叉反應，特異性和敏感性較差；因此分子生物學方法是實驗室檢測支原體的首選方法。

本研究建立了支原體熒光定量PCR檢測方法，具有快速、特異、靈敏、可大批量檢測的特點，并可根據測序結果判斷支原體類型，為實驗室多種常見支原體的快速診斷提供了依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和樣品

肺支原體(Mycoplasmapulmonis)與豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis)為實驗室分離保存。小腸結腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)CMCC(B)52204、假結核耶爾森菌(Yersiniapseudotuberculosis)CMCC 53504、沙門氏菌(Salmonella)ATCC 14028、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)CMCC (B)46117、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 27853、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 6538購自環(huán)凱微生物科技有限公司，嗜肺巴斯德桿菌(Pasteurellapneumotropica)ATCC 35149、鼠棒狀桿菌(Corynebacteriumkutscheri)ATCC 15677購買自美國菌種保藏中心(ATCC)。

不同來源的60份小鼠肺臟、60份細胞培養(yǎng)物經冷鏈運輸至本單位后凍存于-20 ℃冰箱中。

1.2 主要試劑與儀器

AceQ U+Probe Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白酶K購自上海鼓臣生物技術有限公司；EDTA與Tris-HCl購自BIOSHARP公司。

Roche LightCycler 96購自羅氏診斷產品(上海)有限公司；柏恒GE9612T智能梯度PCR儀器購自杭州柏恒科技有限公司；天能EPS300電泳儀及電泳槽購自上海天能科技有限公司；Quawell Q5000 超微量紫外分光光度計購自美國QUAWELL科技公司。

1.3 引物設計與合成

通過比對Genbank上多種大、小鼠易感支原體的16 s rRNA基因中較保守的區(qū)域，用Primer Express 3.0設計引物和探針序列，再使用Primer 5與Oligo 7軟件排除引物二聚體及錯配后，最終確定引物(Myco FP、Myco RP)與探針(Myco P)的序列，預計擴增目的片段大小為168 bp。引物和探針的序列見表1，由北京擎科新業(yè)生物科技有限公司合成。

1.4 質粒標準品的構建

將目的片段的序列交由北京擎科新業(yè)生物科技有限公司合成含目的片段的質粒標準品pUC57-myco。使用載體pUC57的通用測序引物M13 F、M13 R對得到的質粒標準品進行PCR擴增，送北京擎科新業(yè)生物科技有限公司測序。

1.5 熒光定量PCR反應體系及條件的優(yōu)化

以質粒標準品為模板，根據熒光定量PCR試劑盒說明書配置10 μL反應體系：2× AceQ U+mix 5 μL，Myco FP 1 μL，Myco RP 1 μL，Myco P 1 μL，模板 1 μL，超純水補至10 μL。采用上述的反應體系，將引物和探針的濃度分別配制成250、350、450、550 nmol/L，每個引物和探針濃度的組合做兩個重復，利用矩陣法對引物濃度和探針濃度進行優(yōu)化。

用確定的引物、探針濃度及反應體系，將退火溫度設置為58～65 ℃之間的8個隨機溫度梯度，每個溫度梯度做兩個重復，以優(yōu)化退火溫度。

表1 引物和探針序列Table 1 The sequence of primers and probe

1.6 標準曲線的繪制

用超微量紫外分光光度計測量質粒標準品的濃度，根據公式：待測質?？截悢?copies/μL)=(6.02×1023×樣品濃度(ng/μL)×10-9)/(模板長度×660)，計算質粒標準品的拷貝濃度。以10倍倍比稀釋至5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100copies/μL的質粒標準品為陽性模板，超純水為陰性對照，用已優(yōu)化好的程序進行熒光定量PCR擴增，繪制標準曲線。

1.7 熒光定量PCR敏感性檢測

以5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100copies/μL 6個濃度梯度的質粒標準品為陽性模板，超純水為陰性對照，分別進行熒光定量PCR和普通PCR檢測，比較兩種檢測方法的靈敏性。

1.8 熒光定量PCR特異性檢測

用支原體熒光定量PCR方法對肺支原體、豬鼻支原體、小腸結腸炎耶爾森菌、假結核耶爾森菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球、綠膿桿菌、鼠棒狀桿菌進行檢測。若產生擴增曲線，對其進行測序。

1.9 熒光定量PCR重復性檢測

以5×105、5×104、5×103、5×102copies/μL 4個濃度梯度的質粒標準品為模板進行組內和組間重復性實驗。組內重復性實驗為每個濃度梯度的模板設置4個重復；組間重復性實驗為每個濃度梯度的模板獨立進行4次。將檢測結果進行統(tǒng)計學分析，以評價本支原體熒光定量PCR的重復性。

1.10 臨床樣品檢測

1.10.1樣品處理

肺臟樣品處理：剪取針尖大小的小鼠肺臟組織，放入滅菌后的1.5 mL Eppendorf管，加入500 μL含有蛋白酶K的消化液，在56 ℃培養(yǎng)箱中消化過夜。次日早晨將消化液12 000 r/min離心10 min后，取300 μL上清加入300 μL異丙醇，上下顛倒幾次后12 000 r/min離心10 min，棄去管內液體充分晾干后，加100 μL超純水后即得樣品DNA。

細胞樣品處理：吸取細胞及培養(yǎng)液1 mL至Eppendorf管內，12 000 r/min 5 min離心以收集底部細胞。棄上清后加入200 μL超純水吹打細胞，用恒溫混勻儀37 ℃孵育1 h后95 ℃ 300 r/min振搖使細胞裂解，即得基因組DNA。

1.10.2臨床樣品檢測：使用本研究建立的支原體熒光定量PCR方法和普通PCR方法對120個臨床樣品DNA進行檢測，并比較兩種方法的檢出率。若產生擴增曲線，對其進行測序。

2 結果

2.1 質粒標準品的鑒定

對質粒標準品進行PCR擴增后，將擴增產物送測序，NCBI上進行序列比對。結果顯示，目的片段與支原體屬中多種支原體的基因同源性達98%，表明標準品質粒構建成功。

2.2 熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化

通過矩陣法優(yōu)化引物與探針的最佳濃度組合發(fā)現，當上、下游引物均為450 nmol/L，探針為250 nmol/L時，擴增效率最佳。同時優(yōu)化退火溫度，確定熒光定量PCR反應程序如下(其中包含降落PCR程序以增強特異性)：95 ℃ 2 min；前10個循環(huán)降落PCR：95 ℃ 10 s，65～60 ℃ 30 s(每循環(huán)下降0.5度)，72 ℃ 30 s；后30個循環(huán)普通PCR：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；最后37 ℃孵育30 s。

2.3 熒光定量PCR的標準曲線

使用超微量紫外分光光度計測得質粒標準品濃度為158.97 ng/μL，根據1.6中公式計算可得質粒標準品的拷貝濃度為5×1010copies/μL。將質粒標準品10倍倍比稀釋至5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100copies/μL。用已優(yōu)化好的體系及程序進行熒光定量PCR，繪制的標準曲線如圖1所示。標準曲線公式為y=-3.3679x+38.24，擴增效率E=98.11%，相關系數R2=0.9972，表明該熒光定量PCR方法在5×100～5×106copies/μL之間能進行高效擴增且有很好的線性關系。

圖1 熒光定量PCR標準曲線Fig.1 The standard curve of the real-time PCR

2.4 熒光定量PCR的靈敏性

用熒光定量PCR方法和普通PCR方法對不同濃度的質粒標準品進行檢測。結果顯示，熒光定量PCR方法能夠檢出質粒標準品的最低濃度為5 copies/μL(圖2)，PCR方法能夠檢出質粒標準品的最低濃度為5×102copies/μL(圖3)，表明本研究建立的支原體熒光定量PCR的檢測靈敏性是常規(guī)PCR方法的100倍。

圖2 熒光定量PCR靈敏性檢測注：6～1：質粒標準品的濃度分別為5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100 copies/μL；0：陰性對照Fig.2 Sensitivity test of the real-time PCRNote:6～1:The concentration of standard plasmid was 5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100 copies/μL,respectively;0:negative

圖3 普通PCR靈敏性檢測注：M：DL 2000 DNA Marker；1～6：質粒標準品的濃度分別為5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100 copies/μL；7：陰性對照Fig.3 Sensitivity test of the conventional PCRNote:M:DL 2000 DNA Marker;1～6:The concentration of standard plasmid was 5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100 copies/μL,respectively;7:negative control

2.5 熒光定量PCR的特異性

用該熒光定量PCR方法對多種常見病原進行檢測。結果如圖4所示，肺支原體與豬鼻支原體有擴增曲線，且測序結果均為支原體。而其他病原菌：小腸結腸炎耶爾森菌、假結核耶爾森菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球、綠膿桿菌、鼠棒狀桿菌均無明顯擴增曲線。

2.6 熒光定量PCR的重復性

選擇4個濃度的質粒標準品檢測本研究所建立的熒光定量PCR方法的重復性。結果如表2所示，組內重復試驗的變異系數低于1%，組間重復試驗的變異系數低于2%，表明該熒光定量PCR方法的重復性好，穩(wěn)定性高。

2.7 臨床樣品的檢測

用兩種方法分別對60份小鼠肺臟和60份細胞樣品進行檢測，檢測結果表明，支原體熒光定量PCR方法檢測小鼠支原體陽性率為3.33%(2/60)，普通PCR方法檢測陽性率為1.67%(1/60)，測序均為肺支原體；支原體熒光定量PCR方法檢測細胞樣品支原體陽性率為5%(3/60)，與普通PCR方法檢測結果一致，測序結果分別為豬鼻支原體(M.hyorhinis)、發(fā)酵支原體(M.fermentans)、精氨酸支原體(M.arginina)。本次臨床樣品檢測結果也證明該熒光定量PCR方法的檢測靈敏性高于普通PCR方法。

圖4 熒光定量PCR特異性檢測注：1：肺支原體與豬鼻支原體；2：其他參與檢測的病原菌與陰性對照Fig.4 Specific test of the real-time PCRNote:1:Mycoplasma pulmonis and Mycoplasma hyorhinis;2:the other pathogenic strains participated in this test and negative control

表2 熒光定量PCR重復性試驗結果Table 2 Reproducibility test results of the real-time PCR

3 討論

大、小鼠是常用的實驗動物之一，有資料表明實驗用大、小鼠廣泛存在支原體感染[2-3]，常見的有肺支原體(M.pulmonis)、關節(jié)炎支原體(M.arhrititis)、溶神經支原體(M.neurolyticum)等。其中，肺支原體是對實驗動物危害最大的一種支原體。肺支原體在大、小鼠中多呈隱性感染，導致動物的繁殖能力降低；在受到應激或免疫系統(tǒng)受到抑制時發(fā)病，并表現為咳嗽、肺炎等癥狀[9]。盡管支原體感染后多無明顯的臨床癥狀，但是病原的存在會對免疫學、老年病學、營養(yǎng)學、行為學等實驗造成一定干擾[10]。

目前國內外常用的支原體檢測方法為病原培養(yǎng)法、免疫學方法和分子生物學方法，每種方法各有利弊[7-8,11-12]。其中，分子生物學方法以其快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點吸引了越來越多的關注。常用的分子生物學檢測方法主要是常規(guī)PCR和熒光定量PCR，但熒光定量PCR的靈敏性遠高于常規(guī)PCR，且具有快速和高通量的優(yōu)勢，適合對大批量樣品進行快速定量檢測。武昱孜等[13]用常規(guī)PCR、套式PCR以及熒光定量PCR方法檢測同一批樣品，結果顯示檢出率分別為18.0 %、53.9 %和55.1 %。何曼莉等[14]研究顯示，實時熒光定量PCR具有快速、準確和易標準化等優(yōu)點，能夠代替顏色變化單位(color change unit,CCU)法和濁度法對綿羊支原體進行定量。

本研究針對多種大、小鼠易感支原體的16 s rRNA基因中較保守的區(qū)域設計引物和探針，建立了支原體熒光定量PCR檢測方法。該熒光定量PCR方法的標準曲線相關系數R2=0.9972，擴增效率E=98.11%，具有良好的線性關系，且當模板濃度在5×100～ 5×106copies/μL之間時能進行高效擴增。該方法特異性強，與小腸結腸炎耶爾森菌、假結核耶爾森菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球、綠膿桿菌、鼠棒狀桿菌無交叉反應；靈敏性高，最低檢測限為5copies/μL，靈敏性較常規(guī)PCR方法高100倍，同時還能通過測序鑒定支原體亞型；穩(wěn)定性好，組內和組間重復性試驗的變異系數均低于2%。用該方法進行小鼠和細胞兩種樣品的臨床檢測，結果證實了該方法可用于小鼠的臨床樣品檢測，同時檢測結果與已報道的支原體流行率相符[2]。

另外，值得關注的是，該方法也可用于細胞易感支原體的檢測。細胞對于各種生物制品、科研實驗來說是必不可少的實驗材料之一。自從Robinson等在1956年從一株Hela細胞培養(yǎng)液中分離出支原體以來，國內外有關支原體污染細胞的報道屢見不鮮。目前已報道的能夠污染細胞的支原體有二十多種，常見的有發(fā)酵支原體(M.fermentans)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)、精氨酸支原體(M.arginina)、人型支原體(M.hominis)等[15-17]。支原體感染后的細胞往往生長狀態(tài)不佳[18]，且細胞的DNA、RNA和蛋白的表達可能發(fā)生變化[19]，降低實驗結果的準確性。本研究建立的支原體熒光定量PCR檢測方法能夠同時檢測實驗動物及細胞易感支原體，提升了其應用價值。

綜上所述，本研究成功建立了實驗室多種常見支原體的熒光定量PCR檢測方法，具有高特異性、高靈敏性、高穩(wěn)定性、高通量及快速準確等優(yōu)勢，為實動物常見支原體的快速檢測提供了方法。