MuSK重癥肌無力小鼠模型的建立*

劉潺潺 李 婷

(中國科學院大學深圳醫(yī)院(光明)，深圳 518000)

重癥肌無力(MG)是一種神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫性疾病，早在1973年在MG患者身上發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿受體抗體(AchR-Ab)，2001年在MG患者中才又發(fā)現(xiàn)了一種新的抗體，肌肉特異性受體酪氨酸激酶抗體(MuSK-Ab)。乙酰膽堿受體(AchR)和MuSK抗體陽性的MG是具有獨立免疫學靶點的自身免疫性疾病。與神經(jīng)肌肉接頭功能障礙的機制不同，兩者臨床表現(xiàn)與治療差別很大[1]，比如MuSK MG經(jīng)常呈現(xiàn)近端肩胛肌和面部肌無力的特征性臨床表現(xiàn)，更多的肌無力危象和呼吸衰竭，長期預后較差。在突觸形成過程中，MuSK能調節(jié)AchR聚集，所以MuSK能維持AchR的正常空間結構，從而保障突觸功能。國外報道AchR抗體陰性的患者，MuSK抗體陽性占 38%～47%左右，相當于所有MG患者中的10%左右。MuSK-MG患者胸腺增生少見，胸腺瘤罕見，而且胸腺切除術后MuSK抗體血清保持不變，所以胸腺切除對MuSK患者療效較差，構建MuSK-Ab小鼠模型有利于該疾病的研究[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：6～8周的雌性C57BL/6小鼠,購于華中科技大學實驗動物中心，生產(chǎn)單位為三峽大學實驗動物中心，許可證號SCXK(鄂)2017-0012。

1.1.2試劑：MuSK-弗氏佐劑(Difco，Detroit，MI，USA),鼠源肽，CFA完全費氏佐劑。

1.2 方法

1.2.1MuSK小鼠模型的制備

雌性C57BL/6小鼠40只，分成實驗組和對照組，每組各20只小鼠。通過胰島素注射器從尾靜脈給藥2次對小鼠進行免疫。第1次實驗組20只小鼠麻醉并用30μg的MuSK-弗氏佐劑免疫，對照組20只小鼠僅用CFA免疫。28 d后進行第2次免疫：實驗組給予MuSK-弗氏佐劑，對照組給予等量PBS。適應飼養(yǎng)1周后進行造模。造模第1天在 4個位置(兩只后腳和肩部)分別注射免疫抗原(每個部位50 μL，含12.5ug鼠源肽，CFA完全費氏佐劑)；造模第30及50天再次在上述4個位置(兩只后腳和肩部)分別注射免疫抗原(每個部位50 μL，含12.5ug 鼠源肽，CFA不完全費氏佐劑)[2]。參照文獻要求[1]，實驗組第2次免疫后每周測抓力，做翻籠試驗，每天測臨床評分和體質量，第70天后每天對發(fā)病情況進行評分。

1.2.2臨床檢查：臨床檢查是先將小鼠在平臺上放置3 min，觀察小鼠的精神狀態(tài)，有無虛弱，脫水，小鼠的活動情況，四肢肌力，有無癱瘓等，以便與鍛煉后情況進行對照。對小鼠按下面的標準進行評分。

(1)按國際重癥肌無力小鼠臨床評分標準進行評分(Clinical scores)[2]:首先進行標準鍛煉，放置金屬網(wǎng)格，輕抓小鼠的尾巴，小鼠抓住金屬網(wǎng)格時，再將老鼠提起，如此重復20次，然后讓小鼠自由行走并進行測分：

1)0分，鍛煉前活動正常，沒有虛弱或疲勞的跡象。在標準鍛煉后，老鼠似乎比正常情況下不太活躍，或顯示出其他輕微疲勞虛弱的跡象，

2)1分，鍛煉前活動正常，但在標準的鍛煉方案后，它會俯臥不動，下巴著地，不能抬頭，縮成一團，活動性減少，頭部和尾巴擱在工作臺上(懸掛時間小于60 s)。當小鼠達到這個等級時，應將柔軟、潮濕的食物放在籠子的地板上。

3)2分，鍛煉前小鼠即出現(xiàn)活動性減少，常俯臥不動，頭部及尾巴擱在工作臺上，縮成一團，但未出現(xiàn)脫水，癱瘓，很大程度上保持著腦袋不動和尾巴休息(懸掛時間小于30 s)。

4)3分，小鼠即非常虛弱，脫水，癱瘓，體質量明顯下降。評分為3分的小鼠出現(xiàn)脫水和癱瘓，體質量下降達15%(懸掛時間=0)。

5)4分，小鼠死亡。

(2)抓力試驗和翻籠試驗

1)抓力試驗(Grip strength)

輕抓小鼠的尾巴，當小鼠懸起時，下面放金屬網(wǎng)格，老鼠抓住金屬網(wǎng)格時，將老鼠提起，重復20次后測拉力。

一端固定在拉力器上，測力器做成前端網(wǎng)格形。抓住小鼠尾巴，讓小鼠抓住測力器的前端，用力拉小鼠的尾巴，當小鼠力量不夠抓住測力器前端時，此時測力器顯示為抓力。

2)翻籠試驗(Inverted screen test)

翻籠試驗是用來定量評估四肢肌力的測試方法。小鼠被放在了網(wǎng)格的中心后立即旋轉到倒立位置，穩(wěn)定地保持在軟墊上方50 cm。記錄小鼠掉下的時間,觀察時間限定在300 s。

1.3 統(tǒng)計分析

使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析,MuSK-MG小鼠建模成功率采用卡方檢驗，以P<0.05為統(tǒng)計學有意義。

2 結果

評分結果見表1，評分為≥1提示造模成功，建模成功率50%；3分和4分的小鼠抓力試驗和翻籠試驗明確減退，有利于下一步藥物試驗。評分為1至4分為造模成功，成功率為50%，P=0.00026，見表1。

表1 評分結果Table 1 Mouse clinical score results

3 討論

AchR自身抗體主要在免疫球蛋白G(IgG)IgG1和IgG3亞型中，直接阻斷受體功能。相比之下，MuSK抗體主要是IgG4，不激活補體，而是抑制MuSK在終板誘導AchR的正常聚集[3]。肌肉活檢和上肢肌肉的電生理研究沒有顯示任何AchR減少或補體沉積在MuSK陽性的MG中。MuSK-Abs的致病性已經(jīng)通過患者純化IgG被動轉移到實驗動物上得到證實[4]。與正常對照相比，MuSK-Ab 陽性的MG患者輔助性T細胞(Th)Th 1和Th17水平更高，而B10細胞百分比更低。由于B細胞10是免疫耐受和免疫激活調節(jié)的基礎，這些結果與Th1 /Th17介導的炎癥反應和自身抗體產(chǎn)生是一致的，是 MuSK-MG的主要機制[5]。

MuSK-MG的小鼠模型中最近研究結果表明，吡斯的明加劇了終板AchR損失，而3,4-二氨基吡啶增強了神經(jīng)肌肉傳遞[6]。

C57BL/6、AJ 和 bm12小鼠容易造模，但是BALB/c不適合用來做MuSK小鼠模型。A/WySnJ,A/J,DBA/2,FVB/N小鼠更適合作為造模小鼠，具體原因不明[7]。必須定期監(jiān)測動物，并防止不必要的痛苦。在開始治療前幾天開始的被動免疫注射過程中，每天都要進行體質量和疲勞虛弱的測量，以使動物熟悉操作人員。主動免疫研究的時間較長(4至11周)。對于這類研究，在第2次免疫接種之前，可以接受較不頻繁的例行檢查，到第2次免疫接種時應開始每日檢查。由于老鼠有一個晝夜節(jié)律的活動周期，一個有規(guī)律的12小時的光/暗周期應該在每天的同一時間進行，最好是上午10點到下午1點[8-9]。

本研究按照國外文獻制備MuSK-MG的小鼠模型，統(tǒng)一測評方法，與現(xiàn)有研究結果一致，造模方法可行。有利于重癥肌無力疾病的進一步研究。