不同階段幼齡SD大鼠血液指標差異的探討

孫 超 黃維芝 孫俊梅 李曉菲 湯連升

(1.山東省藥學科學院山東省化學藥物重點實驗室，濟南 250101)(2.山東中醫(yī)藥高等?？茖W校附屬醫(yī)院，煙臺 264199)

隨著臨床對兒科用藥安全理念的加強，兒科藥物非臨床安全性評價和幼齡動物相關試驗越來越受到重視。嬰、幼兒期是一個不斷發(fā)育成長的過程，在生長的不同階段擁有不同的體征，對藥物作用的反饋也存在一定的差異，同樣不同發(fā)育階段的幼齡大鼠對于藥物的不良反應以及毒性表征亦存在差異[1-2]。不同區(qū)域或者GLP條件下成年SD大鼠生物學指標文獻報道較多[3-4]，但GLP條件幼齡大鼠尚無建立一套完整的、規(guī)范的血液學和血清生化學指標背景數(shù)據(jù)[5-6]，本研究在幼齡大鼠的不同發(fā)育時間段，對大鼠的血生化指標及血液學指標進行采集分析，探究不同發(fā)育階段對血液指標影響，以期構(gòu)建本中心幼齡大鼠的背景數(shù)據(jù)，用于試驗結(jié)果異常數(shù)據(jù)的解釋。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

戊巴比妥鈉，由濟南億歐生物科技有限公司分裝提供；SYSMEX XT-2000IV型全自動血球計數(shù)儀，Sysmex Corporation生產(chǎn)；SYSMEX CA1500全自動血凝分析儀，Sysmex Corporation生產(chǎn)；日立7180全自動生化分析儀，日本株式會社日立高新技術生產(chǎn)；SPF級大、小鼠生長繁殖飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)。

1.2 動物與飼養(yǎng)條件

取成年性成熟健康SD大鼠60只(用于繁殖幼齡SD大鼠)，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2012-0001。60只幼齡大鼠來源于不同窩別，雌雄各半，飼養(yǎng)于中心SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)，實驗動物使用許可證號SYXK(魯)2014 0008。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)間控制溫度20～26 ℃，日溫差≤4 ℃，濕度40%～70%，換氣次數(shù)至少8次/h；每籠1只飼養(yǎng)于放有墊料的透明大鼠飼養(yǎng)盒(籠盒尺寸≥500 mm×360 mm×200 mm)，用SPF大小鼠生長繁殖飼料喂養(yǎng)，自由進食和飲水。

1.3 動物分組

將成年雄鼠與雌鼠1∶1合籠，分娩后第4天根據(jù)健康狀況每窩留取雌、雄胎鼠各半，分娩后第15天按照胎鼠體質(zhì)量隨機分成6、12和16周齡組，每組動物20只，雌雄各10只。幼齡大鼠6、12和16周齡分別相當于人類兒童、青少年和成年時期，大體覆蓋了機體發(fā)育特征顯著的三個時間段[7-9]。

1.4 生物樣本的收集和檢測

相應組別分別于6、12和16周齡時禁食12 h，按照40 mg/kg體質(zhì)量劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后腹主動脈取血[10]，然后分別置于添加EDTAK2、枸櫞酸鈉和促凝劑的一次性負壓采血管中，根據(jù)要求處理后置于Sysmex XT-2000iv全自動血液分析儀、SYSMEX CA1500全自動血凝分析儀和日立7180全自動生化分析儀進行檢測。

1.5 統(tǒng)計方法

計算各測定指標參數(shù)的平均值和95%的置信區(qū)間，采用SPSS18.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 幼齡大鼠血常規(guī)及凝血主要指標的測定與分析

參見表1、2，結(jié)果顯示不同周齡間雌性幼鼠的WBC、PLT、APTT、TT和Fbg指標以及雄性幼鼠的LYNPH%、Fbg指標無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。6 周齡組的血常規(guī)和凝血指標多數(shù)指標與12 周齡和16 周齡組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)；12 周齡組僅個別指標與16 周齡組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)。統(tǒng)計分析結(jié)果表明：幼齡SD大鼠前期發(fā)育階段的血常規(guī)及凝血指標與成年時期的SD大鼠指標具有一定差異性。

數(shù)據(jù)分析表明雌雄幼鼠的大部分血常規(guī)及凝血指標呈現(xiàn)一定的時間相關性；12 周齡和16周齡幼鼠的RBC、PLT、HGB指標與6周齡幼鼠相比均出現(xiàn)明顯升高現(xiàn)象，個別數(shù)據(jù)雖無統(tǒng)計學差異，但是亦有升高趨勢；NEUT和EO比例隨著幼鼠周齡的增加呈現(xiàn)升高趨勢，而MONO比例則出現(xiàn)降低趨勢。12周齡和16周齡幼鼠的RET細胞數(shù)與6周齡幼鼠相比均出現(xiàn)明顯降低現(xiàn)象。凝血方面雄性6周齡幼鼠APTT指標出現(xiàn)極顯著性降低，其他6周齡幼鼠部分指標與12周齡、16周齡組相比雖有統(tǒng)計學差異，但是各組的平均值差別不大，無太明顯的離散性。12周齡幼鼠和16周齡大鼠比較，僅個別指標有統(tǒng)計學差異，其余指標均無明顯差異。通過對統(tǒng)計結(jié)果的分析判斷，處于兒童時期的SD幼鼠的血常規(guī)和凝血指標與青少年、成年時期相比有一定的差異性，值得進一步探究，而處于青少年時期的SD大鼠和成年期的指標參數(shù)基本一致，數(shù)據(jù)無明顯的離散性；該發(fā)現(xiàn)對今后幼鼠試驗有一定的參考價值。

表1 雌性幼齡大鼠血常規(guī)及凝血指標數(shù)據(jù)Table 1 Blood Routine and Coagulation Index Data of Young Female Rats

注：6周齡、12周齡組與16周齡組比較*P<0.05，**P<0.01，6周齡組與12周齡組比較，#P<0.05，##P<0.01
Note:The comparison between 6 weeks old group、12 weeks old group and 16 weeks old group，*P<0.05，**P<0.01；The comparison between 12 weeks old group and 16 weeks old group，#P<0.05，##P<0.01

2.2 幼齡大鼠血生化主要指標背景數(shù)據(jù)的測定與分析

結(jié)果參見表3、4，雌性幼鼠的ALT、TC、TG不同周齡間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；雄性幼鼠的ALT、AST、TBIL、TG、CK不同周齡間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。雌雄幼鼠6周齡組的血生化指標大部分數(shù)據(jù)與12周齡、16周齡組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)，而12周齡組僅個別血生化指標與16周齡組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)。表明幼齡SD大鼠的血生化指標在不同時間點是有所差異的。

通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)雌、雄幼鼠的大部分血生化指標具有一定的時間相關性，且相關性無明顯性別差異；雌、雄幼鼠ALP、A/G均呈時間負相關性，TP、TBIL、GLU、BUN、Crea均呈時間正相關性。12周齡幼鼠和16周齡大鼠的ALP、A/G指標與6周齡幼鼠相比均有明顯降低現(xiàn)象。12周齡和16周齡組的TP、TBIL、GLU、BUN、Crea指標與6周齡幼鼠相比均有明顯升高現(xiàn)象，個別數(shù)據(jù)雖無統(tǒng)計學差異，但是亦有升高趨勢。12周齡幼鼠和16周齡大鼠比較，除個別指標有統(tǒng)計學差異外其余指標均無明顯差異。通過對以上統(tǒng)計結(jié)果的分析判斷，SD大鼠兒童時期的血生化指標與青少年、成年時期相比差異性比較明顯，而SD大鼠青少年時期與成年時期相比基本無明顯差別。

表2 雄性幼齡大鼠血常規(guī)及凝血指標數(shù)據(jù)Table 2 Blood Routine and Coagulation Index Data of Young Male Rats

注：6周齡、12周齡組與16周齡組比較*P<0.05，**P<0.01，6周齡組與12周齡組比較，#P<0.05，##P<0.01
Note:The comparison between 6 weeks old group、12 weeks old group and 16 weeks old group，*P<0.05，**P<0.01；The comparison between 12 weeks old group and 16 weeks old group，#P<0.05，##P<0.01

表3 雌性幼齡大鼠血生化指標數(shù)據(jù)Table 3 Blood Biochemical Index Data of Female Young Rat

注：6周齡、12周齡組與16周齡組比較*P<0.05，**P<0.01，6周齡組與12周齡組比較，##P<0.01
Note:The comparison between 6 weeks old group、12 weeks old group and 16 weeks old group，*P<0.05，**P<0.01；The comparison between 12 weeks old group and 16 weeks old group，##P<0.01

表4 雄性幼齡大鼠血生化指標數(shù)據(jù)Table 4 Blood Biochemical Index Data of Male Young Rat

注：6周齡、*P<0.05，**P<0.01，6周齡組與12周齡組比較#P<0.05，##P<0.01
Note:The comparison between 6 weeks old group、12 weeks old group and 16 weeks old group，*P<0.05，**P<0.01；The comparison between 12 weeks old group and 16 weeks old group，#P<0.05，##P<0.01

3 討論

實驗動物的血液學指標和血生化指標是藥效、新藥評價試驗的基礎指標，這些基礎指標在幼齡動物中尤其匱乏。本次試驗得到了本試驗室不同時間段幼齡SD大鼠的血液學和血清生化學常用檢測指標的正常生理波動的大體范圍，初步建立了相應的背景數(shù)據(jù)，為本中心開展兒科藥物的非臨床安全性評價提供數(shù)據(jù)支持。所得數(shù)據(jù)與部分文獻數(shù)據(jù)[11-13]基本相近，但也存在一定的差異性，初步估計是可能主要由于采集血液樣本的動物周齡階段不同所引起的。從本次研究結(jié)果可知，相對于12周齡幼鼠，6周齡幼齡大鼠血液指標與16周齡成年大鼠相比有明顯的差異，推測可能周齡越小幼鼠的血液學和血清生化學指標較成年動物的差異性會更明顯，這應與幼齡時期機體的發(fā)育正處于旺盛階段有必然的聯(lián)系。

目前的試驗數(shù)據(jù)基本建立了本中心幼齡SD大鼠不同發(fā)育階段的血液學和血清生化學數(shù)據(jù)參考范圍，可初步用于本中心血液學結(jié)果的合理解釋。資料顯示幼齡犬標準血液學參數(shù)指標從出生到青春期有一些特殊的差異[14]，本試驗研究結(jié)果表明幼齡大鼠亦存在一定的差異。但是，由于受到樣本量的限制，尚未建立全面完善的幼齡大鼠血液指標的背景數(shù)據(jù)，在此希望各實驗動物中心或研究中心逐步采集和分享幼齡大鼠血液指標的相關數(shù)據(jù)，以期建全幼齡大鼠血液學參考范圍，為今后開展幼齡大鼠試驗的血液學和血清生化學數(shù)據(jù)分析提供參考范圍，為正常生物學變異和兒科新藥的藥效作用判斷提供參考。