魚腥草提取物去甲頭花千金藤二酮B對H2O2誘導的海馬神經(jīng)元損傷的作用及可能機制

曹桂花，李娟，王曉明，賈新*

(空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院，1老年病科，2神經(jīng)外科，西安 710032)

氧化應激與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病如腦卒中、帕金森病、阿爾茲海默病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1，2]。氧化應激所導致的機體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，可引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA過氧化修飾，繼而引發(fā)線粒體功能障礙，導致細胞損傷或死亡,而腦組織的氧代謝率極高，其抗氧化活性較低，且再生能力差，對氧化應激更為敏感，因此保護腦細胞、抵抗氧化損傷具有重要意義[3，4]。去甲頭花千金藤二酮B (norcepharadione B,NB)是提取自傳統(tǒng)中草藥魚腥草的一種阿樸菲型生物堿。既往研究表明，NB具有諸多器官保護功效，其在抗氧化、改善心肌缺血、改善神經(jīng)功能方面作用顯著；除此之外，NB還有較強的抗病毒、抗炎及抗血小板聚集功效[5]。但目前關(guān)于NB是否具有抗氧化及抵抗氧化應激損傷的神經(jīng)保護作用還未可知。因此，本實驗采用H2O2誘導小鼠海馬HT22神經(jīng)細胞制備氧化損傷模型，探討NB發(fā)揮神經(jīng)元保護作用的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HT22細胞系由空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經(jīng)外科實驗室饋贈。NB(純度>98%)購自中國武漢天植生物技術(shù)公司；DMEM培養(yǎng)基及PBS緩沖液購自美國Corning公司；胎牛血清購自英國Gibco公司；DMSO及H2O2購自美國 Sigma公司；CCK-8試劑盒購自美國MCE公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自廣州碧云天生物技術(shù)研究所；乳酸脫氫酶(lactate dehydro-genase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde malonic dialdehyde,MDA)及谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)和PI3K抑制劑Ly294002購自碧云天生物技術(shù)研究所；蛋白激酶B(protein kinase,Akt)、磷酸化的Akt(p-Akt)、B細胞淋巴瘤/白血病-2原癌蛋白(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體購自美國Cell Signaling 公司；β-actin及血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

將HT22細胞置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱，用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基(含 1%青鏈霉素)培養(yǎng)，隔天換液一次。當細胞成長融合至80%以上時用0.25%胰蛋白酶消化傳代；當細胞進入對數(shù)生長期即可進行后續(xù)加藥處理。將細胞分為正常對照組、H2O2處理組、NB干預組(H2O2+ NB)、單獨NB組和陽性藥物對照組(H2O2+ NAC，NAC是一種含巰基的抗氧化劑，具有基于巰基功能的抗氧化特性，能保護機體免受氧化應激損傷，亦可抑制神經(jīng)細胞凋亡)。根據(jù)預實驗結(jié)果，H2O2組是加入終濃度為300 μmol/L的H2O2與細胞共孵育24 h；H2O2+ NB組是于H2O2處理前2小時加入100 μmol/L的NB共孵育24 h；H2O2+ NAC組是H2O2處理前2小時預先給予5 mmol/L的NAC共孵育24 h，然后進行下一步實驗。

1.3 細胞形態(tài)觀察及細胞活性檢測

HT22細胞以5×103個/ml、100 μl每孔接種于96孔板，經(jīng)過不同處理后，各組細胞置于相差顯微鏡下觀察細胞生長情況及形態(tài)變化。細胞的存活率用CCK-8試劑盒檢測，酶標儀震蕩溶解后于490 nm波長下測各孔光密度值。

1.4 細胞上清指標檢測

將各處理組細胞吸掉培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞，待其收縮變圓時終止消化，移入EP管中，加入適量細胞裂解液于冰上裂解20 min，4℃ 12 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，將上清液移至預冷的離心管中，嚴格按照試劑盒說明書操作，測定反映細胞損傷的指標LDH，及氧化應激指標(MDA、SOD 及 GSH)水平。

1.5 細胞凋亡率檢測

將各處理組的HT22細胞培養(yǎng)基吸棄，加入PBS 清洗2～3遍后，加0.25%的胰酶消化細胞，待其收縮變圓時終止消化，加入PBS重懸細胞，制成 3×105/ml的細胞懸液，用Annexin V-FITC/PI標記細胞(根據(jù)試劑盒說明操作)，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.6 Western blotting檢測相關(guān)蛋白

將HT22細胞接種于6孔培養(yǎng)板上，密度為5×106個/孔，各組處理完畢后，每孔加入100 μl含有10%蛋白酶抑制劑(100 mmol/L)的RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min，然后將細胞用細胞刮收集至離心管，4℃、12 000轉(zhuǎn)/分，離心15 min，收集上清蛋白溶液。BCA蛋白定量法定量后用于檢測。蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyviny-lidene fluoride, PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉，37℃孵育1 h，分別加入稀釋的兔抗鼠一抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2(1∶800))、Bax(1∶800)，及相關(guān)信號通路蛋白Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000)，4℃過夜；再加上山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h。采用化學發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)進行圖像分析。應用β肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 5組細胞損傷情況比較

本試驗通過檢測細胞存活率、LDH釋放量，并通過相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，評價NB對HT22細胞的保護作用。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，H2O2組細胞存活率明顯下降，細胞上清中LDH含量顯著增加，細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯皺縮、空泡變性及細胞減少。而NB或NAC干預可顯著增加細胞活性、減少LDH釋放，細胞形態(tài)的破壞得到明顯改善。而單純使用NB(NB組)并未對細胞造成影響，提示NB確實對H2O2誘導的HT22細胞損傷具有一定的保護作用(圖1)。

圖1 5組HT22細胞損傷情況比較Figure 1 Comparison of cell injury among 5 groups (n=5) A: cell activity by CCK-8; B: LDH release level; C: cytomorphology (×200). NB: norcepharadione B; LDH: lactate dehydrogenase. Compared with control group, *P<0.05; compared with H2O2 group, #P<0.05.

2.2 5組細胞SOD、MDA及GSH水平比較

與正常對照組比較，H2O2組細胞MDA水平顯著增加，SOD及GSH活性顯著降低；與H2O2組比較，加入NB或NAC干預后，細胞MDA漏出量顯著降低，SOD、GSH活性顯著升高；而單純NB處理與正常對照組比較差異不顯著，提示單純NB對細胞SOD、MDA及GSH水平影響不大(表 1)。

2.3 5組細胞凋亡情況比較

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示(圖2A，2B)，與正常對照組比較，H2O2組細胞凋亡率明顯增高，加入NB或NAC處理后，與H2O2組比較，細胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blotting檢測結(jié)果顯示(圖2C-2E)，與正常對照組比較，H2O2處理組Bcl-2表達顯著下降，Bax水平顯著升高；與H2O2處理組比較，給予NB或陽性藥物NAC處理的細胞Bcl-2顯著升高，Bax水平顯著下降；而NB單獨處理組對細胞凋亡率無明顯影響。

2.4 NB對H2O2誘導的HT22細胞PI3K/Akt/HO-1信號通路的調(diào)節(jié)

為進一步探討NB發(fā)揮神經(jīng)保護的潛在機制，本研究采用Western blotting技術(shù)檢測了磷脂酰肌醇-3激酶/Akt/HO-1(phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/HO-1,PI3K/Akt/HO-1)信號通路在H2O2誘導細胞損傷中相關(guān)蛋白的表達。與正常對照組比較，H2O2組p-Akt水平升高，提示一定劑量的H2O2可誘導Akt的磷酸化；與H2O2組相比，給予NB處理后的細胞p-Akt水平有顯著升高，表明NB可明顯增強Akt的磷酸化水平(P<0.05)；而單純NB處理組與正常組相比，p-Akt水平變化不明顯(圖3A；P>0.05)。我們還檢測了抗氧化酶HO-1蛋白的表達，結(jié)果顯示，H2O2處理組細胞HO-1水平較正常對照組顯著升高，加入NB處理后，與H2O2處理組比較，HO-1表達亦顯著升高，同時H2O2+ NAC組的HO-1表達水平稍低于H2O2+ NB處理組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；單純NB處理組與模型組比較差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05；圖3B)。為了明確PI3K/Akt/HO-1途徑是否參與了NB的神經(jīng)保護作用，我們對細胞給予PI3K抑制劑Ly294002預處理30 min，然后加入NB及H2O2共孵育24 h。結(jié)果顯示(圖3C)，加入Ly294002的細胞p-AKT及HO-1表達水平均較H2O2+ NB處理組顯著降低，提示PI3K/Akt/HO-1信號通路確實參與了NB的神經(jīng)保護作用。

表1 NB對H2O2誘導細胞氧化損傷指標的影響

Table 1 Effect of NB on oxidative damage indicators

GroupSOD(U/mg)MDA(nmol/mg)GSH(nmol/mg)Control11.26±0.670.25±0.0732.08±2.07H2O26.21±0.56?0.56±0.09?17.58±3.21?H2O2+NB9.08±0.78#0.35±0.08#27.66±2.67#NB12.01±0.660.27±0.0831.01±2.18H2O2+NAC10.12±0.75#0.31±0.06#28.89±1.79#

NB: norcepharadione B; SOD: superoxide dismutase; MDA: malondialdehyde malonic dialdehyde; GSH: glutathione. Compared with control group,*P<0.05; compared with H2O2group,#P<0.05.

圖2 5組細胞凋亡情況比較Figure 2 Comparison of apoptosis among 5 groups (n=3)

A: detection of apoptosis rate by flow cytometry; B: quantitative analysis of the percentage of apoptotic cells by histogram; C-E: quantitative analysis of Bax and Bcl-2 expression by Western blotting. NB: norcepharadione; Bcl-2: B-cell lymphoma/leukemia-2; Bax: Bcl-2 associated X protein. Compared

with control group,*P<0.05; compared with H2O2group,#P<0.05.

圖3 NB通過激活PI3K/Akt/HO-1信號途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用Figure 3 Role of NB in neuroprotection through PI3K/Akt/HO-1 signaling pathway (n=3) A: expression and quantitative analysis of p-Akt and total Akt; B: expression and quantitative analysis of HO-1; C: effect of PI3K inhibitor Ly294002 on expression of p-Akt and HO-1. NB: norcepharadion B; Akt: protein kinase B; p-Akt: phosphorylated Akt; HO-1: heme oxygenase-1. Compared with control group, *P<0.05; compared with H2O2 group, #P<0.05; compared with H2O2 +NB group, △P<0.05, △△P<0.01.

3 討 論

魚腥草是一種傳統(tǒng)中草藥，具有廣泛的生物活性和較高的食用價值，在臨床上具有廣闊的應用前景。NB是從魚腥草中提取的一種生物堿。既往研究表明，NB具有較強的抗菌、抗炎、抗病毒和抗血小板聚集作用，其中抑制血小板聚集的潛在機制可能與NB抑制了環(huán)氧合酶的活性有關(guān)[6-8]。最近的研究表明，魚腥草提取物可以改善癡呆、帕金森病和癲癇患者的記憶功能[9]，為NB在神經(jīng)系統(tǒng)的作用研究提供了理論支持。本實驗采用H2O2誘導HT22海馬神經(jīng)細胞制備氧化損傷模型，首次闡明了NB這一生物堿的抗氧化、抗凋亡的神經(jīng)保護作用，為天然類中藥提取物的臨床應用提供了理論依據(jù)。

氧化應激損傷在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的神經(jīng)損傷中起著重要作用，如腦缺血-再灌注損傷、腦外傷和阿爾茲海默病等。氧化應激損傷發(fā)生后，神經(jīng)元細胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)可被大量消耗，引起細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)失衡，繼而引起神經(jīng)元細胞的損傷死亡，因此減少自由基產(chǎn)生、減輕氧化應激損傷是降低上述疾病危害的重要途徑[10-11]。SOD和GSH 是機體內(nèi)的主要自由基清除酶，前者能通過歧化作用清除病理狀態(tài)下產(chǎn)生的氧自由基，減輕細胞損害，后者能抑制脂質(zhì)過氧化反應，對腦缺血腦缺氧損傷起到保護作用。MDA能導致細胞功能受損，且細胞受損程度與MDA 含量成正比,因此上述三者能有效反映細胞受損程度[12，13]。在本實驗中，我們首先觀察了NB對H2O2作用下HT22細胞形態(tài)、存活率及凋亡率的影響，結(jié)果顯示，H2O2作用于細胞24 h后，鏡下可見細胞形態(tài)出現(xiàn)細胞皺縮、空泡變性及細胞減少，而給予NB處理后細胞受損形態(tài)明顯減輕，細胞數(shù)目減少不明顯。細胞活力及凋亡率結(jié)果顯示，與H2O2組比較，給予NB或NAC處理后細胞存活率顯著增加，細胞凋亡率顯著減少，并且LDH 釋放減少。為明確NB對氧化應激所致細胞損傷的作用，我們檢測了細胞內(nèi)SOD、GSH及MDA的變化。結(jié)果顯示，H2O2刺激可誘導細胞內(nèi)SOD活性及GSH水平明顯降低，MDA 含量顯著增加；而給予NB或NAC處理后MDA水平顯著降低，SOD、GSH活性較H2O2組升高。同時，我們也觀察了抗氧化酶HO-1蛋白的變化，結(jié)果顯示，H2O2處理組細胞HO-1的表達水平較正常對照組升高，加入NB處理后，HO-1的表達亦顯著升高，表明NB可以對抗氧化應激產(chǎn)生的損傷。而在本實驗中，H2O2+ NAC組HO-1的表達稍低于H2O2+ NB處理組，這可能與不同的實驗條件有關(guān)。

線粒體凋亡途徑主要通過Bcl-2家族和Caspase家族進行調(diào)控，Bcl-2作為Bcl-2家族蛋白的抗凋亡蛋白，存在于線粒體外膜上，以保護線粒體膜的完整性，抑制神經(jīng)元的凋亡[14,15]。為進一步明確NB發(fā)揮抗凋亡的潛在機制，我們檢測了Akt下游信號通路蛋白Bcl-2和Bax的變化，結(jié)果表明，H2O2處理組Bax的表達明顯升高，而Bcl-2的水平顯著下降，給予NB處理可減輕H2O2誘導的神經(jīng)元損傷，上調(diào) Bcl-2的蛋白表達，下調(diào)Bax表達，提示NB可能通過抑制線粒體凋亡保護受損神經(jīng)元。

PI3K/Akt是重要的細胞存活信號通路，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的保護機制密切相關(guān)，可通過促使凋亡相關(guān)因子磷酸化而失活、磷酸化Bcl-2家族成員、影響轉(zhuǎn)錄因子家族(Forkhead、核因子κB、cAMP反應元件結(jié)合蛋白、p53等)、阻止線粒體釋放細胞色素C等方面發(fā)揮抗凋亡的調(diào)控作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，依達拉奉可通過激活PI3K/Akt信號傳導抑制氧化反應、清除自由基及降低腦水腫途徑, 發(fā)揮拮抗細胞凋亡的作用[17]。此外，大量研究表明，PI3K/Akt信號通路參與了Nrf2的活化和核轉(zhuǎn)位過程，可促使下游一系列抗氧化酶基因的表達，如過氧化氫酶(catalase,CAT)、SOD、GST以及HO-1等[18-20]。NB是否通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路來發(fā)揮抗氧化的神經(jīng)保護作用呢？我們采用Western blotting方法進一步探討相關(guān)分子蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2可誘導HT22細胞的Akt磷酸化水平，而加入NB后可進一步增強Akt的磷酸化程度；且下游HO-1表達明顯升高。為了進一步驗證NB是否增強了Akt的磷酸化水平，我們給予PI3K抑制劑Ly294002預處理30 min，然后給予NB及H2O2共培養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示，抑制劑處理后的細胞p-Akt表達明顯降低，HO-1表達顯著下降，提示PI3K/Akt/HO-1信號通路參與了NB的神經(jīng)保護作用。

綜上所述，NB對H2O2誘導損傷的海馬神經(jīng)元細胞具有良好的保護作用，其作用機制可能通過激活PI3K/Akt/HO-1信號通路而抑制了氧化應激、增強了機體抗氧化能力及減少了細胞凋亡。