武漢地區(qū)禽大腸桿菌的分離、鑒定與耐藥模式探討

邵志勇　陳夏冰　楊文?！『伪蟆抢姟÷櫸暮馈〗馉柟狻￡悵崱±罴蚜铡埓潲?/p>

摘要：為了解武漢地區(qū)禽大腸桿菌（Escherichia coli）對(duì)常用抗生素的耐藥情況，采集疑似患病病雞進(jìn)行大腸桿菌分離與鑒定，并對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物藥敏性分析。結(jié)果表明，從武漢地區(qū)11個(gè)養(yǎng)殖場115份樣品中分離到55株大腸桿菌，對(duì)青霉素（P）、氨芐西林（AMP）的耐藥率達(dá)到100%;對(duì)頭孢拉定（CED）、鏈霉素（STR）、氯霉素（C）、氟苯尼考（FFC）、四環(huán)素（TET）的耐藥率超過80%;對(duì)頭孢吡肟（FEP）、慶大霉素（GEN）、左氧氟沙星（LEV）最為敏感，耐藥率低于10%。55株大腸桿菌有12種耐藥譜，多重耐藥率高達(dá)94.55%，3重耐藥菌株占比為50.91%。

關(guān)鍵詞：禽;大腸桿菌（Escherichia coli）;分離鑒定;耐藥模式

中圖分類號(hào)：R378.2+1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）22-0141-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.033? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation and identification of avian Escherichia coli and its drug

resistance model in Wuhan district

SHAO Zhi-yong1，CHEN Xia-bing1，YANG Wen-hai1，HE Bin1，WU Li-jun1，NIE Wen-hao2，

JIN Er-guang1，CHEN Jie1，LI Jia-lin3，ZHANG Cui-li3

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Sciences，Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430208，China;

2.Hubei Quansheng Ecological Agricultural Development Co.，Ltd.，Tianmen 431728，Hubei，China;

3.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： In order to grasp the resistance of E. coli to common antibiotics in Wuhan district， the suspected diseased chicken samples were collected for E. coli isolation and identification， and the drug isolates were analyzed for drug sensitivity.The results showed that 55 strains of E. coli were isolated from 115 samples from 11 farms in Wuhan， and their resistance rates to penicillin （P） and ampicillin （AMP） reached 100%; for cefradine （CED） and streptomycin （STR）， chloramphenicol （C）， florfenicol （FFC）， tetracycline （TET） resistance rate of more than 80%; for cefepime （FEP）， gentamicin （GEN）， levofloxacin （LEV）. The most sensitive， the resistance rate is less than 10%. There were 12 drug resistance profiles in 55 strains of E. coli， and the multi-drug resistance rate was as high as 94.55%， among which 3 resistant strains accounted for 50.91%.

Key words： avian; Escherichia coli; isolation and identification; drug resistance pattern

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌（Escherichia coli）引起的禽類下痢、呼吸道感染和敗血癥等多種臨床表現(xiàn)的疾病。較常見的病癥有腹膜炎、輸卵管炎、心包炎、肝周炎、氣囊炎等。自1894年Ligniers首次報(bào)道了雞大腸桿菌病，世界養(yǎng)禽發(fā)達(dá)國家和地區(qū)相繼對(duì)該病不同病型進(jìn)行了報(bào)道[1]。隨著集約化養(yǎng)禽業(yè)的迅速發(fā)展，致病性大腸桿菌對(duì)養(yǎng)禽業(yè)所造成的損失日益顯著[2]。

長期以來大腸桿菌病主要依賴抗菌藥物進(jìn)行防控?？咕幬镩L期、大量的使用，導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥性不斷加強(qiáng)，耐藥譜不斷擴(kuò)大，增加了對(duì)禽大腸桿菌病的防控難度。本研究對(duì)武漢地區(qū)疑似患大腸桿菌病的家禽進(jìn)行大腸桿菌分離與鑒定，并對(duì)其進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，以了解禽大腸桿菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況，為指導(dǎo)禽大腸桿菌病的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 病料來源? 病變樣品采集于武漢地區(qū)疑似患大腸桿菌病家禽的病變組織。

1.1.2? 主要藥品與試劑? 青霉素（P）、氨芐西林（AMP）、哌拉西林（TZP）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢哌酮（CFP）、頭孢吡肟（FEP）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢曲松（CRO）、頭孢拉定（CED）、頭孢氨芐（LEX）、慶大霉素（GEN）、鏈霉素（STR）、卡那霉素（KAN）、環(huán)丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LEV）、諾氟沙星（NOR）、洛美沙星（LOM）、氯霉素（C）、氟苯尼考（FFC）、四環(huán)素（TET）藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、MH營養(yǎng)瓊脂、大腸桿菌生化鑒定試劑盒購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 引物的設(shè)計(jì)與合成? 根據(jù)GenBank中大腸桿菌phoA基因序列，使用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)通用引物，序列為phoA-F 5-CGATTCTGGAAATGGCAAA

AG-3，phoA-R 5-CGTGATCAGCGGTGACTATGA

C-3，引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.2.2? 菌株的分離純化與生化特性鑒定? 在無菌條件下，挑取疑似感染大腸桿菌的家禽病變組織接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離，對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色與鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài);同時(shí)，利用大腸桿菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化特性鑒定。

1.2.3? PCR鑒定? 對(duì)分離菌株進(jìn)行菌液PCR鑒定，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min后16 ℃保存。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為720 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察并記錄電泳結(jié)果。

1.2.4? 藥敏試驗(yàn)? 藥敏試驗(yàn)根據(jù)美國臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）推薦的K-B瓊脂法進(jìn)行。取待測菌株，涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基復(fù)蘇，挑取單個(gè)菌落接種于無菌TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，與麥?zhǔn)媳葷峁?.5比濁相同（菌液計(jì)數(shù)約1.5×108 CFU/mL）時(shí)，吸取100 μL菌液，用無菌三角推均勻涂布于MH平板上，每個(gè)平板貼5張藥敏試紙片，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)16～20 h后，觀察并記錄。根據(jù)2018CLSI M100-ED28標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性結(jié)果判定，見表1。

根據(jù)多重耐藥（MDR）、泛耐藥（XDR）、全耐藥（PDR）多重耐藥菌暫行標(biāo)準(zhǔn)[3]，從6類抗菌藥物中各選出1種代表藥物，分別為P、CAZ、GEN、CIP、 C、TET，依據(jù)耐藥情況形成菌株多重耐藥譜進(jìn)行多重耐藥菌株的判斷。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 菌株的分離純化與生化特性鑒定結(jié)果

從115份樣品中分離到55株疑似大腸桿菌菌株，分離菌株在麥康凱瓊脂平板上形成粉紅色、圓形、隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的中等大菌落（圖1a）;在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上形成黑色菌落并帶有金屬光澤（圖1b）。革蘭氏染色鏡檢可見形態(tài)為紅色、兩端鈍圓的短桿菌，分離菌株為革蘭氏陰性菌（圖2）。

55株菌株在生化鑒定中都能發(fā)酵葡萄糖，能分解麥芽糖、乳糖、甘露醇、尿素;部分能夠分解蔗糖;吲哚試驗(yàn)陽性，MR試驗(yàn)陽性，VP試驗(yàn)陰性，不產(chǎn)生H2S，不能利用枸櫞酸鹽;所有分離菌與大腸桿菌的生化特性相符。

2.2? PCR鑒定結(jié)果

對(duì)55株分離菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增目的條帶大小與預(yù)期片段一致，初步判定為大腸桿菌。部分菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。

2.3? 藥物敏感試驗(yàn)

55株大腸桿菌對(duì)20種常見抗菌藥物敏感性結(jié)果見表2。由表2可知，55株大腸桿菌對(duì)P、AMP的耐藥率最高，達(dá)100%;對(duì)CED、STR、C、FFC、TET的耐藥率超過80%;對(duì)FEP、GEN、LEV較為敏感，耐藥率為10%以下。

2.4? 禽大腸桿菌對(duì)6類抗菌藥物的耐藥譜

55株禽大腸桿菌耐藥譜有12類型，多重耐藥（3重及以上耐藥）率達(dá)94.55%（52/55）。其中，3重耐藥菌株占比最大，比例為50.91%（28/55），以P-GEN-TET耐藥譜占比最高，為21.82%（12/55）（表3）。

3? 討論

大腸桿菌廣泛存在于自然界中，作為一種常在菌，當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí)，可引發(fā)大腸桿菌病的暴發(fā)，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)將會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。長期以來，大腸桿菌病主要依賴抗菌藥物進(jìn)行防控，70%獸用抗菌藥物被用作飼料添加劑，導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥性不斷增強(qiáng)，耐藥譜不斷擴(kuò)大，以至于發(fā)病導(dǎo)致無藥可用[4]。

55株禽大腸桿菌對(duì)20種常用抗菌藥物存在不同程度的耐藥，頭孢菌素類（CED除外）、喹諾酮類耐藥率較低，青霉素類、氨基糖苷類（GEN除外）、酰胺醇類、四環(huán)素類耐藥率較高，其中酰胺醇類、四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥率菌高于80%，與劉華棟等[5]和韋慶蘭等[6]對(duì)禽源大腸桿菌耐藥率的分析基本一致。此外，本試驗(yàn)PG的耐藥率達(dá)到100%，但王曉姍等[7]研究結(jié)果表明，禽大腸桿菌對(duì)PG存在較高的敏感，與本試驗(yàn)結(jié)果相反。劉璨穎等[8]對(duì)禽源致病性大腸桿菌的耐藥結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌對(duì)CRO、GEN、CIP、NOR、LOM耐藥率較高，與本試驗(yàn)中上述藥物的耐藥率較低，存在一定差異。大腸桿菌對(duì)多種抗菌藥物存在普遍耐藥，且耐藥率較高，可能是在養(yǎng)殖過程中濫用各類抗菌藥物，導(dǎo)致有效抗菌藥物越來越少;但個(gè)別抗菌藥物的使用其結(jié)果不盡相同，只是針對(duì)當(dāng)?shù)氐拇竽c桿菌敏感，其他區(qū)域可能對(duì)該藥耐藥，分析原因可能是地域差異造成的。

本試驗(yàn)中大腸桿菌對(duì)6類抗菌藥物的耐藥譜進(jìn)行了分析，多重耐藥率高達(dá)94.55%，多重耐藥情況嚴(yán)重，其中以耐3～4種藥物的菌株為主。王佳等[9]對(duì)120株雞源大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，多重耐藥率高達(dá)100%，其中耐17種藥物的菌株占比為20.78%;馬建山[10]對(duì)82株雞源大腸桿菌進(jìn)行耐藥試驗(yàn)，多重耐藥率高達(dá)89.02%，其中耐4種藥物的菌株最多為31.70%，與本試驗(yàn)的多重耐藥率接近。說明禽大腸桿菌耐藥情況比較嚴(yán)重，存在多重耐藥譜且耐藥譜復(fù)雜，臨床可選藥物越來越少，對(duì)大腸桿菌的防控越來越嚴(yán)峻。因此，指導(dǎo)抗菌藥物的科學(xué)使用，促進(jìn)家禽養(yǎng)殖業(yè)向可持續(xù)性方向發(fā)展，保障人民身體健康具有重大意義。

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