HPLC法用于測定丁桂散中丁香酚含量研究

劉丹丹

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬漳州市中醫(yī)院，福建省漳州市 363000

丁桂散的組成成分主要包括兩種，分別為丁香以及肉桂細(xì)粉，其被記載于1991年版的中國人民解放軍醫(yī)療單位制劑規(guī)范中，其具備散寒止痛的功能，可對機體出現(xiàn)腸胃受寒、腹痛便瀉的患者進(jìn)行有效治療[1]。中國人民解放軍醫(yī)療單位制劑規(guī)范中只對丁桂散的藥物形狀、鑒別方法以及散劑一般檢查項目進(jìn)行記載，并未對丁桂散中的丁香酚含量測量方法進(jìn)行有效的記錄，從而使得無法對丁桂散所具備的內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行有效檢測[2]。在對丁香和丁香制劑含量開展測量時，以往有學(xué)者通過研究報道稱，可采用的方法為高效液相色譜法[3]。但對于丁桂散中的丁香酚含量測定，目前醫(yī)學(xué)報道中尚無相關(guān)記載[4]。本次研究就通過對實驗進(jìn)行設(shè)計，從而使丁桂散中丁香酚含量得到有效測定，報告如下。

1 儀器與材料

本次研究所應(yīng)用的測量儀器為高效液相色譜儀(荷蘭Philips公司生產(chǎn)，型號HDK5500型)，包括6447型手動進(jìn)樣器，6933液相色譜泵以及紫外光檢測器；DK630色譜數(shù)據(jù)工作站由上海林鑫醫(yī)療設(shè)備儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)。所應(yīng)用的丁香酚對照品是由省生物制品檢定所提供，批號為4581-68462。丁桂散的制備單位為市第一醫(yī)院，批號分別為20186748、20186750、20186781。

2 檢測方法和結(jié)果

2.1 色譜條件以及系統(tǒng)適用性試驗 本次研究所應(yīng)用的色譜柱生產(chǎn)廠家為上海季羅普儀器設(shè)備有限責(zé)任公司，型號為DHA-H2分析色譜柱，色譜柱的大小為4.6mmID×250mm，粒徑大小為10μm；所應(yīng)用的C18保護柱的大小為4.6mmID×5mm，粒徑大小為10μm；所應(yīng)用的流動相為甲醇-10%甲醇(44:56)，流速控制為0.7ml/min，檢測光的波長控制為280nm。在對色譜參數(shù)進(jìn)行正確設(shè)置后，對丁香酚對照品、丁桂散色譜圖以及丁桂散不含丁香的陰性樣品所對應(yīng)的色譜圖進(jìn)行測量，通過測量取得的色譜圖可知，丁香酚所具備的保留時間為18min，所具備的理論板數(shù)為7 500，和丁香酚相鄰峰所具備的分離度超過1.5。

2.2 線性關(guān)系以及最低檢出濃度 首先應(yīng)用534.7mg的丁香酚對照品，對其進(jìn)行精確的測量，將其加入到量瓶中，量瓶的容量為100ml，然后向量瓶中加入乙醇，對丁香酚對照品進(jìn)行溶解，并將其稀釋到制定的刻度，所取得的溶液就是丁香酚對照品儲備液，每毫升丁香酚對照品儲備液中所具備的丁香酚含量為5.347mg，然后采用5ml丁香酚對照品儲備液，將其放入到量瓶中，量瓶的容量為100ml，采用流動相對其開展稀釋，使其稀釋值達(dá)到267.4μg/ml，然后將量瓶進(jìn)行搖晃，使瓶中的液體被充分搖勻。采用不同量的混合液加入到液相色譜儀中，加入量分別為2μl、4μl、8μl、12μl以及16μl，所出現(xiàn)的譜峰面積進(jìn)行有效記錄，根據(jù)峰面積對進(jìn)樣量X開展線性回歸，丁香酚所應(yīng)用的回歸方程為：Y=3.068E+0.7X-1.763E+0.6，r=0.999 9，線性范圍為0.523 6～4.399μg。然后稀釋對照品溶液，稀釋完成后采用相同方式進(jìn)行進(jìn)樣，根據(jù)基線噪音2倍開展計算可知，丁香酚的最低檢出量為0.01μg左右。

2.3 精密度以及重復(fù)性試驗 通過將相同的對照品開展5次重復(fù)進(jìn)樣，對丁香酚所具備的色譜峰面積進(jìn)行記錄可知，RSD為0.83%。通過對相同的供試品溶液開展5次重復(fù)進(jìn)樣，對丁香酚所具備的色譜峰面積進(jìn)行記錄可知，RSD為1.79%。通過對相同的丁桂散開展5次重復(fù)進(jìn)樣，對丁香酚所具備的色譜峰面積進(jìn)行記錄可知，RSD為2.39%。

2.4 穩(wěn)定性試驗 通過對試品溶液進(jìn)行測量，測量頻率為每隔1h開展1次測量，共開展5次測量，期間共間隔4h，對丁香酚所具備的色譜峰面積進(jìn)行記錄，對含量開展計算，最終結(jié)果顯示RSD的值為2.48%。

2.5 加樣回收率試驗 首先采用0.2g的丁桂散，樣品量的測量必須十分精確，然后根據(jù)樣品測定方法，對供試液進(jìn)行制備，并將其當(dāng)做開展回收測定所應(yīng)用的空白樣品。再另外選用0.1g丁桂散，對其進(jìn)行精確的測量，然后采用25ml丁香酚對照品溶液進(jìn)行加入，由于每毫升丁香酚對照品溶液中丁香酚的含量為0.267 4mg，因此25ml丁香酚對照品溶液中所含量的丁香酚劑量為6.685mg，根據(jù)樣品測定方法，對供試液進(jìn)行測量，將供試液作為回收測量所應(yīng)用的樣品，并按照相同的方法，對其他的回收測量所應(yīng)用的樣品進(jìn)行制備，制備總數(shù)為6份。各個樣品全部根據(jù)樣品測定項所應(yīng)用的方法，開展丁香酚含量測定，并對平均回收率開展計算，最終計算的結(jié)果為平均回收率為103.0%，RSD為1.19%。

2.6 樣品測定 首先對對照品溶液開展制備，制備方法為：選用200mg的丁香酚對照品，對其劑量進(jìn)行精確測定，然后將其加入到量瓶中，量瓶容量為100ml，采用乙醇溶液進(jìn)行加入，對丁香酚對照品開展稀釋，直至達(dá)到指定的刻度，然后將混合液進(jìn)行充分搖勻。選用5ml混合液，將其加入到量瓶中，量瓶容量為50ml，采用流動相對其開展稀釋，直至其達(dá)到指定的刻度，然后將其進(jìn)行充分搖勻，也就制得所需要的對照品溶液，每毫升對照品溶液含有200μg丁香酚。然后對供試品溶液開展制備，制備的方法為：采用0.1g丁桂散，然后將其加入到錐形瓶中，錐形瓶的容量為100ml，采用50ml乙醇進(jìn)行加入，然后開展精密稱定，采用水浴的方式對錐形瓶進(jìn)行加熱，開展60min時間提取，然后將其放置在室溫下進(jìn)行冷卻，等到其冷卻至室溫后，將加熱過程中蒸發(fā)損失的溶劑進(jìn)行補足，然后將溶液進(jìn)行混勻，采用濾膜開展過濾，濾膜的孔徑為0.45μm，也就可得到供試品溶液。然后開展測定，采用10μl對照品溶液以及10μl供試品溶液，將其加入到液相色譜儀中，對顯示的色譜峰面積進(jìn)行記錄，應(yīng)用外標(biāo)法對含量進(jìn)行計算。本次研究共開展3個批號樣品的測量，最終結(jié)果顯示丁桂散中所具備的丁香酚含量分別為97.4mg/g、99.27mg/g以及101.33mg/g。

3 討論

丁桂散出自《外科傳薪集》，丁桂散可發(fā)揮有效的溫化痰濕、散寒止痛作用，其可對頭痛癥狀進(jìn)行有效治療[5]?！肚嗄颐貍鳌分杏邢嚓P(guān)記載稱，其無形寒濕，附骨流注[6]。臨床上主要應(yīng)用丁桂散對出現(xiàn)陰疽腫痛、腹瀉、腹痛等臨床癥狀的患者開展治療，同時患者自身機體畏寒、肢冷，屬寒相征[7]。

丁香酚所具備的分子式為C10H12O2，其為一種液體，顏色表現(xiàn)為無色或是蒼黃色，其具備的丁香香氣十分濃烈，其無法在水中進(jìn)行溶解[8]。其主要應(yīng)用于抗菌以及降血壓治療中。臨床上在對其開展藥物分析時，主要應(yīng)用高效液相色譜法對藥物中所存在的丁香酚含量開展測量，測量方法是通過采用無水乙醇對含有丁香酚的藥物開展定容，然后將其進(jìn)行浸泡，浸泡時間為24h，然后將其進(jìn)行搖勻，搖勻后開展過濾[9]。在過濾完成后應(yīng)用高效液相色譜分析儀開展色譜分離，應(yīng)用紫外吸收檢測器，確定檢測波長為280nm，然后對丁香酚吸收值開展檢測，并由此將丁香酚的含量進(jìn)行有效計算[10]。丁香酚所具備的作用包括：(1)抗菌作用：當(dāng)丁香酚的濃度保持在1∶(8 000～16 000)時，其可有效抑制致病性真菌；而當(dāng)濃度保持在1∶(2 000～8 000)時，其可有效抑制金黃色葡萄球菌、志賀菌、大腸桿菌、結(jié)核桿菌等病菌[11]。(2)健胃作用：有資料報道稱，5%的丁香酚乳劑可有效增加機體胃黏液分泌，且同時不會增加胃黏液的酸度，從而可發(fā)揮有效的健胃作用[12]。

HPLC法也被稱之為高壓液相色譜法、近代株色譜法、高分離度液相色譜法等，其屬于色譜法中的一個重要分支，其是依靠液體作為流動相，應(yīng)用高壓輸液系統(tǒng)，將具備不同極性的單一溶液，或是不同比例的混合溶液，緩沖液等流動相，依靠外力作用，將其加入到色譜柱中，色譜柱中具有固定相，在色譜柱中，各類成分之間發(fā)生分離，從而將色譜柱放入到檢測器中開展檢測，由此達(dá)到分析試樣的目的。其所具備的特點主要表現(xiàn)為“四高一廣”，首先為高壓：流動相屬于液體，其在色譜柱中進(jìn)行流動時，其會受到較大的阻力，而若其需要以較快的速度流過色譜柱，則需要對載體施加較高的壓力。其次為高速：分析速度較快，同時載體液的流動速度也較快，因此完成檢測的速度也較快，在對一個樣品開展分析時，通常所需的時間僅為15～30min，部分樣品的分析時間僅需5min，通常情況下一個樣品分析時間都不會超過1h。其次為高效：該方法具備較高的分離效能，可選擇固定相以及流動相，從而使分離效果達(dá)到最佳，因此其所具備的分離效能相較于工業(yè)精餾塔以及氣相色譜明顯更高。其次為高靈敏度：高效液相色譜的紫外檢測器靈敏度可達(dá)到0.01ng，進(jìn)樣量精確度可達(dá)到μl數(shù)量級。最后為應(yīng)用范圍廣：高效液相色譜分析可對超過70%的有機化合物開展檢測。丁香酚最大吸收波長在230nm，次強吸收波長在280ml，選用280nm作為側(cè)定波長，有利于排除其他組分干擾。

綜上所述，HPLC法可有效測定丁桂散中丁香酚含量，效果顯著。