38例HIV抗體陽性馬爾尼菲藍狀菌的分離鑒定體會

熊勁芝 張 林 袁紅霞

南華大學附屬郴州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心微生物室，湖南省郴州市 423000

馬爾尼菲藍狀菌(Talaromyces marneffei， TM)，原名馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei，PM)，是青霉菌屬中一種溫度依賴性雙相型條件致病性真菌，主要通過竹鼠傳播，流行于東南亞和我國南方地區(qū)[1]。艾滋病以及免疫力極其低下的患者常合并馬爾尼菲青霉感染。近年來感染PM患者也隨著 AIDS患者的增加而日益增多，重視并早期診斷意義重大。其在 25℃ 時呈菌絲相生長，產紅色素，37℃ 時呈酵母相生長，當人體感染PM后，PM以具有致病能力的酵母相寄生于宿主細胞內。而分離培養(yǎng)出具有雙相型的TM是診斷馬爾尼菲藍狀菌病的金標準[2-3]。現(xiàn)對我院2010年6月—2017年12月收治的 38 例HIV抗體陽性的馬爾尼菲藍狀菌病患者的體液及組織雙相培養(yǎng)鑒定情況總結報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組38例，均經體液或組織真菌培養(yǎng)并鑒定為TM感染，其中血培養(yǎng)陽性33例，骨髓培養(yǎng)陽性5例。男性26例，女性12例，年齡24～76歲，平均年齡52.4歲。均為ELISA初篩試驗及 Western-blot 確認陽性的 HIV感染者。

1.2 培養(yǎng)鑒定方法 培養(yǎng)基為BACT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀配套的培養(yǎng)瓶(由法國生物梅里埃公司提供)，沙保羅瓊脂平板與血瓊脂平板培養(yǎng)基購自法國生物梅里埃公司。將患者血標本或骨髓標本注入血培養(yǎng)瓶，在BACT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀中孵育。陽性報警后，涂片染色鏡檢考慮為真菌后轉種兩塊沙氏培養(yǎng)基，分別置于25℃和37℃中培養(yǎng)，每24h后觀察1次菌落生長情況，分別取兩種環(huán)境下孵育的菌落進行涂片、固定、革蘭染色，并在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征。

2 結果

經BACT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀增菌培養(yǎng)，均在5d內出現(xiàn)陽性報警，其中24～48h報陽1株(2.6%)，48～72h報陽6株(15.8%)，72～96h報陽28株(73.7%)，96～120h報陽3株(7.9%)。接種于沙保羅培養(yǎng)基，分別于25℃和37℃中培養(yǎng)。結果：(1)25℃培養(yǎng)菌落呈霉菌相，生長迅速，2d左右可見灰白色絨毛狀霉菌樣菌落；1周左右菌落呈淡黃色絨狀，中央可見黃綠色，培養(yǎng)基呈玫瑰紅色，且隨培養(yǎng)時間延長而逐步加深并彌散至整個培養(yǎng)基。染色后鏡下可見菌絲細長分隔，大量帚狀枝，兩輪生多見，少數(shù)單輪生，分生孢子呈卵圓形或圓形，光滑，可見明顯孢間連體；(2)37℃ 培養(yǎng)菌落呈酵母相，生長緩慢，3～4d可見邊緣光滑整齊的圓形、灰白色乳酪樣菌落，無色素產生。2 周后菌落增大、干扁、周圍皺褶不齊。染色后鏡下可見大量類圓形長形酵母樣孢子，光滑，部分呈臘腸樣，有少量短菌絲。

3 討論

TM是青霉菌屬中唯一具有致病性的條件致病菌，1973年被Diaalvo等發(fā)現(xiàn)，多見于東南亞及我國廣西、廣東等南方地區(qū)，是一種易引起全身播散性損害的條件致病菌，多發(fā)生在免疫低下的人群中，在艾滋病人群中更常見，TM感染率高達18.6%，是東南亞地區(qū)艾滋病患者中僅次于結核分枝桿菌和新生隱球菌的第三大機會性致病菌[4]。

TM在培養(yǎng)過程中的不溶血、不渾濁、產酸量極少等特征，導致難以肉眼觀察確認菌落生長，而全自動血培養(yǎng)儀能根據(jù)培養(yǎng)中產氣量異常做出菌落生長的陽性報警提示，現(xiàn)通常采用全自動血培養(yǎng)儀進行培養(yǎng)。TM在血培養(yǎng)瓶生長較慢，自動血培養(yǎng)儀培養(yǎng)陽性報警峰值為4d(1.5～7d)[5]，本組TM陽性瓶報警73.7%在72～96h。建議對于遲緩報警的轉種后繼續(xù)室溫下靜置觀察上清液變化，若出現(xiàn)白色顆?；蛎扌鯛钗铮科瑱z查更易找到TM特征菌，是確認TM簡單有效的方法，具有重要的臨床意義。

TM在體內主要侵犯人體的單核巨噬細胞系統(tǒng)，包括骨髓、肝、脾、肺、淋巴組織及腸道淋巴結等，其感染后只有免疫力低下的少數(shù)人發(fā)病，臨床常表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰等呼吸道癥狀，納差、腹痛、腹瀉、肝脾及腹腔淋巴結腫大等消化道癥狀，以及皮膚臍窩樣壞死性丘疹、咽喉部潰瘍假膜等體征[6]。艾滋病合并TM感染時，骨髓培養(yǎng)陽性率最高，接近100%，其次為皮膚活檢(90%)和血培養(yǎng)(76%)，與TM首先在骨髓等單核巨噬細胞系統(tǒng)中大量繁殖，然后部分釋放到血液中這種生物特性有關，提示在早期診斷上，骨髓培養(yǎng)優(yōu)于血培養(yǎng)，可以避免部分因血培養(yǎng)陰性而漏診的患者[7]。HIV陽性者血培養(yǎng)TM陽性率76.7%， HIV陰性率47.1%，HIV 陽性患者較陰性患者TM感染后更容易出現(xiàn)發(fā)熱、脾臟增大、WBC下降、血小板降低、ALT 異常[8]。酵母相為致病相，在活體內可逃避寄生宿主的免疫應答，菌絲相到酵母相的轉變是TM發(fā)病機制的前提，HSP70基因是雙相轉化相關基因。機體抵抗TM入侵主要依靠細胞免疫，組織中出現(xiàn)的起主要作用的是 CD4+T細胞有助于殺滅真菌及使病變局限[9]。

因此，對于HIV陽性患者，出現(xiàn)不明原因發(fā)熱與肺部感染時，應高度重視TM感染可能，及時對其進行血液或骨髓培養(yǎng)。從臨床標本分離培養(yǎng)出具有雙相型的TM仍是診斷馬爾尼菲藍狀菌病的金標準，但近2周的耗時及對檢驗人員經驗技術的高要求所致的診治延遲是其不足之處[10]。