蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用

范春博楊永菊關(guān)雪峰*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110032)

1 骨性關(guān)節(jié)炎

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是全球最常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病，也是一種致殘率較高的疾病[1]。多見(jiàn)于中老年人群，主要表現(xiàn)為受損關(guān)節(jié)疼痛，可伴關(guān)節(jié)腫脹。畸形和活動(dòng)受限等，病理特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨破壞。軟骨下骨硬化。骨贅形成和滑膜炎癥[2]。其發(fā)病機(jī)制尚未清楚，目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有任何治療手段能夠顯著控制其發(fā)展。同時(shí)也缺乏早期診斷方法[3]。因此尋找OA的發(fā)病原因。致病因子等成為了學(xué)者們研究的重點(diǎn)方向。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteome)的概念是1994年在意大利召開(kāi)的雙向電泳會(huì)議上澳大利亞學(xué)者Pandey和Mann[4]首次提出來(lái)的“一個(gè)基因組所表達(dá)的蛋白質(zhì)”，1996年再次提出“在一定條件下，在某一個(gè)生命體系中由基因組編碼的全部蛋白質(zhì)，即某一物種、個(gè)體、器官、組織乃至細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)”。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和特異功能影響著生命個(gè)體的活動(dòng)機(jī)制及外在表現(xiàn)。很多生物基因組中的蛋白質(zhì)編碼基因已被人類識(shí)別，但是蛋白質(zhì)的表達(dá)并不穩(wěn)定，蛋白質(zhì)合成過(guò)程中產(chǎn)生了大量的蛋白質(zhì)變體(proteoform)[5]，隨著科學(xué)研究的深入蛋白質(zhì)的研究方式已經(jīng)無(wú)法滿足科學(xué)活動(dòng)要求，蛋白質(zhì)組理念的提出以及一系列技術(shù)的發(fā)展則為蛋白質(zhì)的研究提供了基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)組學(xué)主要由蛋白質(zhì)的分離技術(shù)、生物質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)組成[6]，新一代的抗體蛋白芯片技術(shù)也在逐步被研究者們所認(rèn)可。當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅速，為人類了解疾病的發(fā)生及發(fā)展的過(guò)程提供了新途徑，新方法。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在OA發(fā)生機(jī)制研究中的應(yīng)用

3.1 蛋白質(zhì)分離技術(shù) 蛋白質(zhì)分離技術(shù)主要包括二維電泳技術(shù)、同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)、高效液相色譜技術(shù)[7]。

3.1.1 二維電泳技術(shù) 早期的蛋白質(zhì)分離技術(shù)是二維電泳技術(shù)，原理比較簡(jiǎn)單是利用蛋白質(zhì)分子量及等電點(diǎn)的不同，進(jìn)行二次雙向電泳蛋白質(zhì)分離，但缺點(diǎn)也很明確，不能分離分子量很大或者很小的蛋白質(zhì)同時(shí)技術(shù)難度大。工作周期長(zhǎng)[8]。其中將二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)與等電聚焦技術(shù)相結(jié)合所形成的二維電泳是目前分離分析蛋白質(zhì)最有效的一種電泳手段。廖偉雄[9]通過(guò)行關(guān)節(jié)鏡診治的12例KOA患者與12例非KOA膝關(guān)節(jié)疾病患者(半月板損傷10例，盤(pán)狀半月板2例，均無(wú)明顯關(guān)節(jié)軟骨損傷)關(guān)節(jié)滑液標(biāo)本，應(yīng)用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)組織相容性白細(xì)胞抗原-DR(HLA-DR)、結(jié)合珠蛋白在KOA中表達(dá)上調(diào)，且與病情嚴(yán)重程度高度相關(guān)。Henrotin[10]等采用2D-DIGE技術(shù)對(duì)年輕健康志愿者與晚期關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行對(duì)比研究.分析樣本數(shù)據(jù)，在OA組發(fā)現(xiàn)了13種差異蛋白，運(yùn)用免疫測(cè)定法發(fā)現(xiàn)Fib3-1、Fib3-2血清水平明顯高于健康對(duì)照組，由此推斷Fib3肽類是OA的潛在的標(biāo)志物。

3.1.2 同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tag for relative absolutequantitation，iTRAQ)，則通過(guò)將蛋白質(zhì)酶解為肽段，利用iTRAQ試劑與肽段的氨基或Lys的ε-氨基發(fā)生反應(yīng)等量混合，再將標(biāo)記的樣本互相混合后，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分離鑒定[11]。梁海波[12]收集膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者60例，參照Kellgren-Lawrence(K-L)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，分為 k-L0、I I、IV級(jí)的亞組，每個(gè)亞組隨機(jī)選取10例男性與10例女性進(jìn)行穩(wěn)定同位素116、117、118的 iTRAQ標(biāo)記。通過(guò)對(duì)不同樣品的iTRAQ膚段實(shí)驗(yàn)標(biāo)記共篩選出有意義差異蛋白169個(gè)。Fernández-Puente等[13]采用iTRAQ聯(lián)合(MALDI)-TOF/TOF的方法，通過(guò)比較正常對(duì)照人群和OA中的血清樣本，發(fā)現(xiàn)了300余種重復(fù)性和特異性很高差異蛋白，其中262種差異蛋白可以量化并計(jì)算其iTRAQ比，發(fā)現(xiàn)OA潛在生物標(biāo)志物包括如脂蛋白、血管性血友病因子、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白和四連接素等。

3.1.3 高效液相色譜技術(shù) 液相色譜技術(shù)得到了全面發(fā)展，氣相色譜、液相色譜相互結(jié)合使用，可以高效的分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合物及肽段，造就了了自動(dòng)化、高通量的檢測(cè)手段，在蛋白質(zhì)組學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，但在OA研究中此項(xiàng)技術(shù)還未普及，將來(lái)可以列入OA炎性因子的篩選。對(duì)于完整蛋白質(zhì)的分離與鑒定，Kelleher[14-15]所建立的四維離線分離平臺(tái)就是利用蛋白等電位點(diǎn)的差異，通過(guò)對(duì)凝膠洗脫液相離截留電泳的離線分離，Ljiljana[16-17]則使用弱陽(yáng)離子交換結(jié)合親水交互液相色譜的在線分離方法也實(shí)現(xiàn)了完整蛋白質(zhì)的高通量分離。

3.2 生物質(zhì)譜技術(shù) 生物質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，其中離子化技術(shù)和質(zhì)譜儀是質(zhì)譜技術(shù)的核心。高速運(yùn)轉(zhuǎn)的待測(cè)樣本中的離子擁有不同的質(zhì)荷比(m/z)進(jìn)而分離和檢測(cè)目標(biāo)離子或片段，然后依據(jù)保留時(shí)間、豐度值進(jìn)行定性和定量[18]。20世紀(jì)后期，電噴霧離子化(electrospray ionization，ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸附離子化(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)兩大生物大分子離子化技術(shù)在電離時(shí)能夠保持分子的完整性，由此大規(guī)模的蛋白質(zhì)機(jī)械化鑒定成為可能，兩者成了質(zhì)譜離子化的重要手段，生物質(zhì)譜技術(shù)也因此成為了蛋白質(zhì)組學(xué)的一項(xiàng)支撐技術(shù)[19]。相比較這兩種離子化技術(shù)各有千秋，ESI-MS與液相色譜聯(lián)用則可用于分析復(fù)雜樣品而MALDI適用于分析簡(jiǎn)單的肽混合物。質(zhì)譜的質(zhì)量分析器包括四種分析器都有自己的特點(diǎn)，根據(jù)不同的科研要求，各種質(zhì)量分析器相互雜交形成了串聯(lián)質(zhì)譜儀。余光書(shū)[21]等采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)軟骨組織標(biāo)本取材于70-75歲行膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)的骨性關(guān)節(jié)炎患者的膝關(guān)節(jié)軟骨組織，并提取線粒體。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到294個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的蛋白質(zhì)有ATP合酶、超氧化物歧化酶、谷氨酸脫氫酶1等14種蛋白質(zhì)存在于此線粒體對(duì)軟骨細(xì)胞線粒體中的蛋白質(zhì)作全面的定性觀察。SINZ[22]等運(yùn)用質(zhì)譜測(cè)定法(MS)研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液和血漿，發(fā)現(xiàn)只在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液中存在鈣粒蛋白B，而血清淀粉蛋白A也只在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血漿和滑膜液中被發(fā)現(xiàn)。MATSUO[23]等使用雙向和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)相聯(lián)合在骨性關(guān)節(jié)炎患者血清中鑒定出fibulin-4蛋白。

3.3 生物信息學(xué)技術(shù) 生物信息學(xué)是由計(jì)算機(jī)科學(xué)與應(yīng)用數(shù)學(xué)、生物學(xué)等多種學(xué)科相互融合而形成的。它把DNA序列信息分析作為源頭，對(duì)蛋白質(zhì)的序列分析。結(jié)構(gòu)分析。功能分析、點(diǎn)突變的設(shè)計(jì)及家族鑒定等進(jìn)行研究。在獲得蛋白質(zhì)編碼區(qū)的信息后進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模擬和預(yù)測(cè)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行存儲(chǔ)及加工，然后利用先進(jìn)的數(shù)據(jù)庫(kù)分析，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證，從而獲取數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的生物學(xué)信息[24]。當(dāng)今生物信息技術(shù)在OA方面研究還不夠深入，研究者沒(méi)還沒(méi)有充分利用此學(xué)科進(jìn)行OA的研究，OA的病因還未明確，所獲得蛋白質(zhì)的種類還未具體，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)還不夠完善，這使OA的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究遇到了瓶頸。但是隨著科技的進(jìn)步，計(jì)算機(jī)算法及軟件的快速更新、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善都為OA蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)展提供了動(dòng)力，綜合各個(gè)方面的生物信息學(xué)必將成為揭示OA蛋白質(zhì)密碼的金鑰匙。

3.4 抗體蛋白芯片技術(shù) 抗體蛋白芯片技術(shù)是新的蛋白檢測(cè)技術(shù)。是建立在蛋白組學(xué)基礎(chǔ)上的，應(yīng)用抗體芯片(alltibody microarray，抗體微陣列)檢測(cè)生物樣品中蛋白表達(dá)模式的新方法[25]。抗體芯片技術(shù)的目的主要是通過(guò)檢測(cè)不同病理組織的差異蛋白，通過(guò)發(fā)現(xiàn)的差異蛋白逆向推測(cè)疾病的演變過(guò)程，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥及疾病的診斷與預(yù)防?？贵w蛋白芯片技術(shù)的基本原理是將有需要的抗體固定于各種載體上作為待檢測(cè)的芯片，之后用用標(biāo)記了特定熒光抗菌素體的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片發(fā)生反應(yīng)[26]，漂洗洗去未能與芯片上蛋白質(zhì)互相結(jié)合的成份，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)，測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，通過(guò)熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到測(cè)定各種蛋白質(zhì)功能的目的[27]?？贵w芯片中的抗體有單克隆抗體和重組抗體。目前，比較普及的新一代的抗體蛋白芯片產(chǎn)品和技術(shù)，包括膜式和玻片式蛋白芯片，以及成套的ELISA試劑。蛋白芯片分為膜式和玻片式蛋白芯片，前者可以使用和Western blot相同的成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，極大的降低了蛋白芯片的使用門檻。玻片式蛋白芯片還有可定量的類ELISA的蛋白芯片，可在普通的激光可聚焦掃描儀上使用，可以極大的降低細(xì)胞因子的檢測(cè)成本，適合于多指標(biāo)(幾十個(gè)到上百個(gè)指標(biāo))，小樣本或者中等樣本的檢測(cè)。柴藝匯等[28]使用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)黃芪多糖對(duì)MC-3T3-E1成骨細(xì)胞CYP24A，CYP27B蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)示黃芪多糖的質(zhì)量濃度在0.1，1，10mg-1時(shí)可以提高M(jìn)C-3T3-E1成骨細(xì)胞的繁殖率且在48h促增殖作用最佳。新一代的抗體蛋白芯片適用方便，檢測(cè)率高。目前在OA方面研究應(yīng)用還不太廣泛未來(lái)可廣泛應(yīng)用于OA的研究中。

4 總結(jié)與瞻望

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，潛能巨大，緊隨著蛋白質(zhì)譜技術(shù)的創(chuàng)新進(jìn)步，準(zhǔn)確性、靈敏性及覆蓋性方面均在不斷提升。盡管目前蛋白質(zhì)組學(xué)仍存在著，如研究芯片造價(jià)高、質(zhì)譜結(jié)合率低等問(wèn)題，但仍然是OA研究中新興的技術(shù)方法。未來(lái)以蛋白質(zhì)組學(xué)為手段研究OA的疾病過(guò)程會(huì)更加的普遍。同時(shí)蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)OA研究應(yīng)該以臨床大樣本為對(duì)象，從大樣本進(jìn)行分析篩選驗(yàn)證，從而尋找OA明確的生物標(biāo)志物。同時(shí)單一的蛋白質(zhì)組學(xué)難以解決更深層次OA的相關(guān)問(wèn)題，將蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等分子生物學(xué)結(jié)合可以更加立體直觀的了解OA的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。因此應(yīng)以蛋白質(zhì)組學(xué)做為橋梁，尋找OA的發(fā)病原因，以分子生物學(xué)做為基礎(chǔ)深入研究，可在未來(lái)為人來(lái)研究OA的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制提供更多的途徑與方法。