凝血因子Ⅸ基因新發(fā)錯(cuò)義突變致乙型血友病一例家系分析

王京偉 李 艷 喬 斌 熊 亮

乙型血友病(Hemophilia B，HB)為凝血因子IX (Coagulation Factor 9，F(xiàn)9)基因缺陷引起的凝血障礙性出血性疾病，呈X連鎖隱性遺傳，男性發(fā)病率約為1/30 000，女性以攜帶者居多。約70%的患者有家族史，30%為散發(fā)病例。F9基因點(diǎn)突變是HB最主要的發(fā)病機(jī)制，占97%左右，大片段插入缺失約占3%。出血傾向的嚴(yán)重性與患者血漿中F9活性(FⅨ:C)水平相關(guān)，根據(jù)血漿中F9活性，HB可分為輕型(>5%)、中型(1%-5%)和重型(<1%)三種類型。輕型患者表現(xiàn)為外傷后出血難止，重型患者表現(xiàn)為自發(fā)性關(guān)節(jié)出血、肌肉出血和內(nèi)臟器官出血等，具有高致殘率和致死率。

HB目前尚無根治手段，臨床多采用F9替代療法，篩查F9基因突變，確定突變位點(diǎn)，可對(duì)HB進(jìn)行快速準(zhǔn)確的基因診斷。對(duì)HB患者及攜帶者進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的基因診斷和產(chǎn)前干預(yù)，是防止新患兒出生、切斷致病基因傳遞、提高人口素質(zhì)，減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)最有效方法。本研究應(yīng)用PCR-Sanger測(cè)序方法對(duì)HB患者進(jìn)行F9基因檢測(cè)，首次發(fā)現(xiàn)一例攜帶變異的HB家系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

先證者，男性，53歲，因牙齦出血就診，曾多次關(guān)節(jié)及皮膚出血，以HB待查收入院。家族無近親結(jié)婚史，家系遺傳圖譜見圖1。經(jīng)患者及患者家屬知情同意后進(jìn)行相關(guān)凝血指標(biāo)及F9基因致病位點(diǎn)分析。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，臨床資料及標(biāo)本采集均獲患者知情同意。先證者母親及女兒、外甥女無明顯出血病史。

注：方形代表男性；圓形代表女性；圓形中間帶黑點(diǎn)代表女性攜帶者；方形帶斜線代表已去世男性；箭頭代表先證者

圖1 乙型血友病家系遺傳圖譜

1.2 主要試劑與儀器

全血基因組核酸提取及純化試劑(上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司)，DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)，ABI 3500測(cè)序儀Cathode Buffer Container、POP-7分離膠、ABI BigDyeTM終止劑(美國(guó)Applied Biosystems公司)，PCR clean up試劑盒(天根生化科技有限公司)，2×PCR mix buffer(Thermo公司)。Symex CS-5100全自動(dòng)凝血分析及配套試劑、XE 2100型全自動(dòng)血液分析儀及配套試劑(日本Sysmex公司)，9700型PCR儀、Smart LabAssist-32核酸自動(dòng)純化提取儀(臺(tái)灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)開發(fā)有限公司)，Nanodrop 2000 超微量分光光度計(jì)(美國(guó)NanoDrop 公司)，凝膠成像系統(tǒng)(BioSpectrum公司)，Sub-Cell GT Cell型水平電泳系統(tǒng)(BIO-BAD公司)。

1.3 常規(guī)指標(biāo)檢查

抽取先證者及其家系成員EDTA-K2抗凝靜脈血2ml，采用全自動(dòng)凝血分析儀及配套試劑檢測(cè)檢測(cè)活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、D-二聚體濃度及F9 活性，采用血液分析儀檢測(cè)血紅蛋白(Hb)水平。

1.4 F9基因測(cè)序及突變分析

1.4.1基因組DNA提?。翰杉軝z者靜脈血2ml，EDTA-K2抗凝，采用全血基因組核酸提取及純化試劑提取基因組DNA，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。在96孔預(yù)裝板的第1列和第7列加入全血樣本400μl ，分別在提取反應(yīng)板中第1列和第7列加入蛋白酶20μl，選擇Smart LabAssist-32核酸自動(dòng)純化提取儀上相應(yīng)的提取程序進(jìn)行自動(dòng)化核酸提取。運(yùn)行結(jié)束后第5列和第11列對(duì)應(yīng)槽位為相應(yīng)標(biāo)本提取的DNA。采用Nanodrop 2000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度，使A260/280 在1.8-2.0，A260/230>2。根據(jù)定量濃度將DNA樣本稀釋至5-15ng/μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，DNA原液于-20℃保存。

1.4.2PCR擴(kuò)增：分別針對(duì)F9基因的外顯子及鄰近內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)引物。引物參照Paez等[1]和Lynch等[2]設(shè)計(jì)，擴(kuò)增片段為265-795bp，引物由上海Invitrogen公司合成，引物序列及相關(guān)信息見表1。首輪PCR 總反應(yīng)體系為25μl，包括模板DNA 2μl，2×PCR mix buffer 12.5μl，終濃度為5μmol/L 的上、下游引物各2μl，ddH2O補(bǔ)足至25μl。循環(huán)參數(shù)：95℃ 預(yù)變性5min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2g/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照成像，驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目的片段。

表1 F9基因不同外顯子擴(kuò)增引物信息

1.4.3PCR產(chǎn)物回收：紫外燈下切下目的DNA條帶，采用Axygen DNA凝膠回收試劑盒回收DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4測(cè)序反應(yīng)：取 BigDye緩沖液1.15μl，BigDye 0.3μl，待測(cè)DNA 1μl，正反向引物各1μl，滅菌去離子水補(bǔ)體積為6μl。PCR擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性2min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，25個(gè)循環(huán)。然后置4℃保存。PCR產(chǎn)物中加入16μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，4℃離心后棄上清液；加70%(v/v)乙醇70μl洗滌沉淀2次。室溫干燥沉淀后加10μl的甲酰胺充分溶解DNA，在PCR儀上95℃熱變性2min，冰中驟冷待用。將純化后測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物在ABl 3500dx型測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，按儀器說明書操作。電泳結(jié)束后儀器自動(dòng)分析彩色測(cè)序圖譜，其DNA最低檢出濃度為20-40ng/L。

1.4.5基因序列分析：經(jīng)BLAST軟件比較分析測(cè)序結(jié)果與NCBI genebank數(shù)據(jù)庫中F9序列(NG_007994.1)的差異，分析F9基因是否存在突變位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 凝血指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

先證者Hb含量降低，凝血功能示APTT延長(zhǎng)，D-二聚體增高，F(xiàn)9活性明顯下降，屬于重型HB；先證者母親及女兒APTT及F9活性分別有不同程度的延長(zhǎng)和降低，Hb含量亦偏低，屬于輕型HB；先證者父親、哥哥和妹妹以及妻子APTT及F9活性正常。詳見表2。

表2 先證者級(jí)家系成員實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

2.2 F9基因序列結(jié)果分析

將先證者F9基因的測(cè)序結(jié)果與NCBI genebank數(shù)據(jù)庫中F9序列(NG_007994.1，hg38版本)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其第4外顯子區(qū)域存在c.289T>G(p.Cys97Gly)半合子錯(cuò)義突變，測(cè)序原始序列見圖2。進(jìn)一步檢測(cè)患者其他家系成員該位點(diǎn)變異情況，發(fā)現(xiàn)患者母親及女兒為c.289T>G雜合變異，其余家庭成員為野生型。HGMD數(shù)據(jù)庫收錄了該位點(diǎn)4個(gè)變異(c.289T>A[3]、c.289T>C[4]、c.290G>A[5]、c.291T>G[6])。

圖2 F9基因c.289T>G位點(diǎn)變異測(cè)序結(jié)果

3 討 論

HB又名血漿凝血活酶成分(PTC)缺乏癥或F9缺乏癥。此型臨床表現(xiàn)酷似甲型，但發(fā)病率較低，遺傳方式亦為X連鎖隱性遺傳，由于雜合子F9活性僅為正常 1/3，某些雜合子可出現(xiàn)癥狀，故HB女性患者較甲型多見。HB患者多因長(zhǎng)期反復(fù)的關(guān)節(jié)內(nèi)出血，而形成關(guān)節(jié)畸形(雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，踝關(guān)節(jié)及肘關(guān)節(jié)明顯)，活動(dòng)力減低，嚴(yán)重影響患者的生活能力及生活質(zhì)量。人類F9基因定位于Xq26.3-27.2，全長(zhǎng)34kb，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子以及側(cè)翼順序中調(diào)控區(qū)域構(gòu)成。F9基因mRNA全長(zhǎng)2804bp，翻譯為含461個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，主要有6個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，分別為信號(hào)肽和前肽區(qū)、γ-羧基谷氨酸區(qū)(GLA區(qū)域)、兩個(gè)表皮樣生長(zhǎng)因子區(qū)(EGF區(qū)域)、激活肽區(qū)及催化區(qū)，其中GLA 區(qū)域由12個(gè)γ-羧基谷氨酸殘基組成，F(xiàn)9通過該結(jié)構(gòu)域與鈣離子形成鈣橋連接并與磷脂表面相連。EGF區(qū)域分為EGF-1區(qū)和EGF-2區(qū)，EGF-1區(qū)域可與鈣離子緊密結(jié)合，EGF-1區(qū)被認(rèn)為在F9被FVIIa-TF復(fù)合物激活及F9與FVIIIa 的結(jié)合中發(fā)揮重要作用[7]。EGF-2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的Gln97、Phe98、Tyr115 及Leu117等4 個(gè)氨基酸位點(diǎn)對(duì)F9的分泌起著至關(guān)重要的作用[8]。目前為止F9基因已鑒定出的變異有1200多種，主要為錯(cuò)義突變、無義突變及小的插入和缺失等，其中錯(cuò)義突變和無義突變約占60%。除polyA區(qū)域外，F(xiàn)9基因突變?cè)谄渌鼌^(qū)域均有發(fā)生，其中第1、3、7外顯子發(fā)生突變頻率較低，第4和第8外顯子的突變頻率相對(duì)較高，屬于熱點(diǎn)區(qū)域，本家系中檢測(cè)的c.289T>G變異便位于第4外顯子，c.289T>G(p.Cys97Gly)位點(diǎn)變異在gnomAD、ExAC、1000g和ESP6500等人群頻率數(shù)據(jù)庫中均未被收錄，為罕見變異。F9基因突變中調(diào)節(jié)區(qū)域的致病突變目前發(fā)現(xiàn)有28種，基因重排導(dǎo)致HB的有13種。有研究表明調(diào)節(jié)區(qū)的致病性變異，尤其是位于啟動(dòng)子區(qū)域的變異多表現(xiàn)為兒童期有嚴(yán)重出血傾向，青春期后自發(fā)出血減輕，后證實(shí)與雄性類固醇表達(dá)量有關(guān)[9]，雄性類固醇可誘導(dǎo)啟動(dòng)子產(chǎn)生F9，由此可見，臨床癥狀輕重與突變性質(zhì)或突變位置有一定關(guān)系。HB的臨床治療除對(duì)癥治療外多采用輸血漿或濃縮血漿制劑等，將F9因子活性提高到25%以上即視為治療有效。產(chǎn)前診斷是防止本病患兒出生的有效方法。近年，復(fù)旦大學(xué)有研究團(tuán)隊(duì)[10，11]在F9缺乏癥的基因治療方面取得了進(jìn)展，有望在臨床取得長(zhǎng)期穩(wěn)定療效。

本研究發(fā)現(xiàn)一例F9基因新發(fā)變異的HB家系，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)制定的序列變異解讀指南[12，13]，F(xiàn)9基因的97密碼子區(qū)域被視為熱點(diǎn)區(qū)域(Hot Spot)，位于該結(jié)構(gòu)域內(nèi)密碼子對(duì)蛋白質(zhì)功能起關(guān)鍵作用，如果在這些結(jié)構(gòu)域上發(fā)現(xiàn)的所有錯(cuò)義突變均已被證實(shí)為致病突變(見表3)，且這些結(jié)構(gòu)域中一定沒有已知的良性突變，則該區(qū)域內(nèi)新變異c.289T>G可作為致病的中等證據(jù)(PM1)。因c.289T>G變異在所有人群中等位基因的頻率均不存在，ESP數(shù)據(jù)庫、千人數(shù)據(jù)庫、EXAC數(shù)據(jù)庫中正常對(duì)照人群中均未發(fā)現(xiàn)該變異，符合中等致病性證據(jù)(PM2)，多種功能預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)該變異會(huì)對(duì)基因或基因產(chǎn)物造成有害的影響，符合PP3證據(jù)，患者臨床表型符合HB，為PP4證據(jù)，該變異在患者家系中實(shí)現(xiàn)了共分離，為PP1證據(jù)。綜合考慮F9基因的c.289T>G位點(diǎn)變異歸為可能致病性變異。

目前國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道少數(shù)病例的女性HB患者，其發(fā)病機(jī)制主要是X染色體的萊昂化作用導(dǎo)致X染色體的非隨機(jī)失活或X染色體的結(jié)構(gòu)異常(如唐氏綜合征)，少見的發(fā)病機(jī)制是 F9 基因的純合突變，而后者多來自于攜帶有致病基因的近親結(jié)婚的家庭[14]。近親結(jié)婚在亞洲國(guó)家還比較常見，會(huì)增加疾病的發(fā)病率，特別是HB等性染色體連鎖的遺傳性疾病。因此避免近親結(jié)婚，同時(shí)對(duì)HB的女性攜帶者進(jìn)行孕前篩查及產(chǎn)前診斷是降低血友病患兒出生率的根本措施，對(duì)于提高人口素質(zhì)、減輕家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)具有重要意義。

綜上所述，本文通過分析一例HB先證者及其家系成員F9基因序列，首次發(fā)現(xiàn)第4外顯子區(qū)域存在c.289T>G(p.Cys97Gly)半合子錯(cuò)義突變，可能為HB致病性突變。F9基因序列分析對(duì)于攜帶者篩查，疾病的診斷具有重要意義，對(duì)HB的基因治療具有重要的指導(dǎo)意義。

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