商洛野生牛耳大黃中3種成分含量測定及影響因素研究

賈文江，李 春，曹望弟，劉喜玲，李 宏

（陜西省商洛市藥品檢驗所，陜西 商洛 726000）

牛耳大黃為蓼科植物皺葉酸模Rumex crispusL.的根，又名四季菜根、火風棠、羊蹄根[1]，主要化學成分為大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等，有清熱涼血、化痰止咳、通便殺蟲功效，臨床多用于治療急性肝炎、慢性氣管炎、吐血、血崩、血小板減少性紫癜、大便燥結(jié)、痢疾、疥癬、禿瘡、疔、癤等。目前的牛耳大黃藥材質(zhì)量標準中僅有高效液相色譜（HPLC）法測定其中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量[2-3]。本研究中采用HPLC法同時測定并比較不同生長年限、不同生長時間商洛野生牛耳大黃中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量，為全面控制其質(zhì)量奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器（日本島津公司）；SQP型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；AS30600BDT型超聲波清洗機（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

大黃素對照品（批號為 110756-200110，含量98.0% ），大黃酚對照品（批號為 110796-201621，含量99.2%），大黃素甲醚對照品（批號為110758-200912，含量99.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

商洛野生牛耳大黃樣品，經(jīng)陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院郭耀武主任藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -1% 冰醋酸溶液（75 ∶25，V／V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：254 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制成大黃素、大黃酚、大黃素甲醚質(zhì)量濃度分別為0.054，0.038，0.022 mg／mL的混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品粉末（過4號篩）2 g，精密稱定，置150 mL錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，20℃超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理30 min，冷卻，以甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：取上述2種溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜，見圖1。結(jié)果各相鄰成分間分離度較好（R＞1.5），理論板數(shù)以大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰計均大于3 000。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取2.2項下混合對照品溶液，分別進樣2，5，10，15，20 μL，測定，以對照品進樣量（μg）為橫坐標（X）、峰面積值為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程，大黃素為Y1=38023X1+4828（r1=0.9999，n=5），大黃酚為Y2=55124X2-163146（r2=0.9995，n=5），大黃素甲醚為Y3=16 002X3+5 216.4（r3=0.998 3，n=5）。結(jié)果表明，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的進樣量分別在0.11～1.08 μg、0.08 ～ 0.76 μg、0.04 ～ 0.44 μg 范圍內(nèi)與峰面積值線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密量取2.2項下混合對照品溶液20 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6次，測定。結(jié)果大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.31%，0.45%，0.62%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2項下供試品溶液20 μL，室溫下分別放置 0，2，4，8，12，18，24 h 時進樣，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為 0.17% ，0.10% ，0.07% （n=7），表明室溫下供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批樣品粉末（過4號篩）6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量，結(jié)果的RSD分別為 0.82%，1.03%，1.18%（n=6），表明方法重復性較好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的同批次樣品粉末（過4號篩）2.0 g，精密稱定，平行6份，分別精密加入大黃素、大黃酚、大黃素甲醚質(zhì)量濃度為0.1009，0.0992，0.050 0 g／L的混合對照品溶液各 3.0 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，測定峰面積，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

按擬訂色譜條件，測定不同生長年限、不同保存時間樣品的含量。結(jié)果見表2。

表1 大黃素、大黃酚、大黃素甲醚加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

表2 樣品中3種成分含量測定結(jié)果（mg／g，n=3）

3 討論

本研究中參考文獻[4-18]，分別選取加甲醇25 mL 超聲（功率 250 W，頻率 50 kHz）15，30，45 min，發(fā)現(xiàn)超聲30 min內(nèi)樣品提取最充分；同時分別在20℃（常溫）與50℃條件下進行，結(jié)果含量無明顯差異；同時考察了甲醇加熱回流1 h、三氯甲烷超聲提取、甲醇超聲提取等方法，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取法快捷、簡便、安全，故選擇甲醇超聲提取法。

流動相考察了甲醇與1%冰醋酸溶液不同比例（60∶40，75 ∶25，80∶20，V／V）的試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)樣品和對照品在以甲醇-1%冰醋酸溶液（75∶25，V／V）為流動相時3個指標成分色譜峰分離度最好，理論板數(shù)最高，重復性最好，故本研究中采用甲醇-1%冰醋酸溶液（75∶25，V／V）為流動相。

比較不同生長年限樣品含量結(jié)果，可見，1年生的上述3種成分含量最低，2年生的比多年生的含量稍偏低；同一多年生但保存時間為14個月與2個月的樣品含量比較發(fā)現(xiàn)，大黃素含量減少，而大黃酚含量增加，大黃素甲醚含量基本不變，三者總含量變化不大。

綜上所述，該方法簡便、快捷，結(jié)果準確、可靠，可用于商洛野生牛耳大黃藥材中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的同時測定。