元胡止痛口服液對原發(fā)性痛經(jīng)的鎮(zhèn)痛作用及機制研究*

張 愷 ，李娜娜 ，李 嵩 ，孟慶芬 ，關(guān)建麗 ，鄧 昊 ，樊官偉 ，6

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2．天津市中醫(yī)方證轉(zhuǎn)化研究重點實驗室，天津 301617；3．天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津300120；4．天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301617；5．河南福森藥業(yè)有限公司，淅川474450；6．天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617）

原發(fā)性痛經(jīng)系指非盆腔器質(zhì)性病變引起的痛經(jīng)，以患者下腹部痙攣性疼痛為主要臨床表現(xiàn)。本病多發(fā)于青年女性，國內(nèi)報道其發(fā)病率約為43%～69%[1]。國外流行病學(xué)調(diào)查顯示，原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病率由34%（埃及）至94%（阿曼）不等，其中重度痛經(jīng)的患病率約為 0．9%～59．8%[2]。隨著生活壓力增加、飲食結(jié)構(gòu)改變等因素的影響，原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，對女性的生活與工作造成了嚴重影響。

中醫(yī)認為原發(fā)性痛經(jīng)屬“經(jīng)行腹痛”范疇，元胡止痛方是中醫(yī)臨床治療由氣滯血瘀引起的痛經(jīng)的常用經(jīng)方，其由延胡索和白芷兩味中藥組成，具有理氣、活血、止痛之功效[3]。目前，元胡止痛方有口服液、片劑、軟膠囊劑、膠囊劑、顆粒劑與滴丸共6種劑型收錄于2015年版《中華人民共和國藥典》中。關(guān)于元胡止痛片劑、膠囊劑、滴丸對于原發(fā)性痛經(jīng)的治療作用已有一些研究報道，如張秀書[4]采用元胡止痛片治療原發(fā)性痛經(jīng)，可使患者痛經(jīng)癥狀積分顯著降低；方遠書等[5]報道元胡止痛膠囊的含藥血清能顯著減少痛經(jīng)動物模型的扭體次數(shù)；韓彥琪等[6]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)元胡止痛滴丸可能通過作用于激素調(diào)節(jié)、中樞鎮(zhèn)痛、解痙、炎癥及免疫相關(guān)的蛋白靶點與通路，從而發(fā)揮治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用。但目前尚缺乏元胡止痛口服液治療原發(fā)性痛經(jīng)的相關(guān)實驗研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)元胡止痛口服液可顯著抑制縮宮素誘導(dǎo)的小鼠離體子宮痙攣性收縮，本研究進一步采用縮宮素誘導(dǎo)原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型，以大鼠扭體反應(yīng)次數(shù)與發(fā)生率為指標，考察元胡止痛口服液對痛經(jīng)大鼠模型的影響。并測定給藥后大鼠血漿雌二醇（E2）、孕酮（Prog）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）與谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平，以及大鼠子宮組織前列腺素F2α（PGF2α）、前列腺素E2（PGE2）、血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）、鈣離子（Ca2+）與一氧化氮（NO）含量，探討元胡止痛口服液的作用機制，為其臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 NewClassic MF電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Xianou-24高通量多樣品組織研磨機（南京先歐儀器制造有限公司）；Varioskan Lux多功能微孔板讀數(shù)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Wellwash全自動洗板機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BGZ-240電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ProFlex Base PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）；Milli-Q Integral 5超純水系統(tǒng)（美國 Merck Millipore公司）；Legend Micro 21R冷凍高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 實驗藥品與試劑 元胡止痛口服液的處方由醋延胡索、白芷兩味中藥組成，輔料為蔗糖、β環(huán)糊精、甜菊素、純化水，由河南福森藥業(yè)有限公司提供，批號：18090121，實驗時用蒸餾水稀釋成所需濃度的溶液。羅通定片的有效成分為延胡索乙素（每片30 mg），購自山西云鵬制藥有限公司，批號：G180302，實驗時取出片劑研磨成細粉，加入蒸餾水與0．5%（W/V）羧甲基纖維素鈉，配制成所需濃度的混懸液。己烯雌酚（上海源葉生物科技有限公司，批號：X13M6Y1）；縮宮素（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：N1108A）；羧甲基纖維素鈉（上海申光食用化學(xué)品有限公司，批號：20180816）；肝素鈉（北京索萊寶科技有限公司，批號：409G024）；水合氯醛（上海源葉生物科技有限公司，批號：Z23A9Y68668）。E2酶聯(lián)反應(yīng)吸附實驗（ELISA）檢測試劑盒（批號：L181010239）與PGF2aELISA檢測試劑盒（批號：L181023119）購自武漢云克隆科技股份有限公司。大鼠Prog ELISA檢測試劑盒（批號：20181112005）購自武漢六合生物技術(shù)有限公司。大鼠PGE2ELISA檢測試劑盒（批號：C0174080121）、大鼠TXB2ELISA檢測試劑盒（批號：A27017483）與大鼠6-keto-PGF1αELISA 檢測試劑盒（批號：D10017485）購自武漢華美生物工程有限公司。MDA檢測試劑盒（批號：082418181030）、總SOD活性檢測試劑盒（批號：092618181030）、GSH-Px檢測試劑盒 （批號：060518181114）、NO 檢 測 試 劑 盒 （ 批 號 ：052218181029）與BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：070618181017）購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。Ca2+試劑盒（批號：20181123）購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗動物 SD大鼠，雌性，體質(zhì)量180～200 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2017-0001。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心，飼養(yǎng)設(shè)施合格證號：SVXK津2009-0002。實驗動物操作均遵從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物倫理委員會審定的規(guī)范要求。

1.4 分組與造模方法 將60只健康雌性SD大鼠按體質(zhì)量隨機分為6組，分別為空白組、模型組、元胡止痛口服液高劑量組（高劑量組）、元胡止痛口服液中劑量組（中劑量組）、元胡止痛口服液低劑量組（低劑量組）以及羅通定片陽性藥組（陽性藥組），每組10只。參考文獻方法[7]復(fù)制痛經(jīng)大鼠模型。除空白組外，其余各組大鼠灌胃給予己烯雌酚2．00mg/kg，每日1次，連續(xù)12 d。

1.5 給藥方法 于造模第6天開始給藥，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，高劑量組、中劑量組、低劑量組大鼠分別以3．20、1．07、0．36 g/kg 劑量灌胃給予元胡止痛口服液。根據(jù)實驗動物與人之間藥物劑量等效換算方法，陽性藥組大鼠灌胃給予羅通定混懸液0．03 g/kg?？瞻讓φ战M與模型組灌胃等體積蒸餾水，各組大鼠每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

1.6 扭體反應(yīng)觀察 于造模第12天，末次給藥1 h后，模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組與陽性藥組大鼠腹腔注射縮宮素40 U/kg，空白組注射等體積生理鹽水。記錄注射縮宮素后30 min內(nèi)各組大鼠發(fā)生扭體反應(yīng)（腹部收縮內(nèi)凹，軀干與后肢伸展，臀部與一側(cè)肢體內(nèi)旋）的數(shù)量以及扭體次數(shù)，并按公式1計算大鼠的扭體發(fā)生率。

扭體發(fā)生率（%）=發(fā)生扭體反應(yīng)動物數(shù)量/實驗動物數(shù)量×100%（公式1）

1.7 檢測指標 注射縮宮素1 h后，各組大鼠腹腔注射 3．50%（V/V）水合氯醛溶液（0．10 mL/kg）麻醉，腹主動脈采血，加入肝素抗凝管，于1 500 g，4℃條件下離心5 min，取上清液，采用ELISA法測定大鼠血漿E2與Prog水平，采用TBA法檢測大鼠血漿MDA含量，運用WST-8法測定血漿SOD活性，并采用紫外比色檢測GSH-Px活性。

另于采血后取大鼠子宮組織，精密稱質(zhì)量，加入生理鹽水，在冰浴下制成10%（W/V）的組織勻漿，于1 500 g、4℃條件下離心10 min，分離上清液，采用ELISA法測定大鼠子宮組織勻漿中PGF2α、PGE2、TXB2、6-keto-PGF1α水平。采用甲基百里香酚藍比色法測定組織勻漿中Ca2+含量，運用Griess試劑法測定NO含量，并采用BCA法測定大鼠組織勻漿總蛋白含量。上述測定方法均按各試劑盒說明進行，實驗數(shù)據(jù)采用ELISACalc軟件進行分析，以四參數(shù)Logistic曲線模型擬合標準曲線，并通過標準曲線計算各樣本濃度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19．0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，正態(tài)分布資料采用單因素方差分析比較多組間差異，偏態(tài)分布資料采用Wilcoxon秩和檢驗分析，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扭體反應(yīng)觀察 空白組大鼠未出現(xiàn)扭體反應(yīng)，模型組大鼠在注射縮宮素后30 min內(nèi)的扭體發(fā)生率為90%，提示動物模型成功建立。與模型組相比，陽性藥組、高劑量組、中劑量組、低劑量組大鼠扭體發(fā)生率均有不同程度的降低，其中高劑量組與陽性藥組大鼠扭體反應(yīng)次數(shù)顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），詳見表 1。

表1 元胡止痛口服液對痛經(jīng)大鼠疼痛扭體的影響Tab.1 Effects of Yuanhu Zhitong Oral Liquid on the w rithing response of dysmenorrhea rats

表1 元胡止痛口服液對痛經(jīng)大鼠疼痛扭體的影響Tab.1 Effects of Yuanhu Zhitong Oral Liquid on the w rithing response of dysmenorrhea rats

注：與模型組比較，*P＜0．05。

給藥量（生藥/kg鼠質(zhì)量）扭體發(fā)生率（%）扭體次數(shù)（次/30 min）/0 0/90．00 4．11±1．76 3．20g 50．00 2．20±0．84*1．07g 70．00 2．57±1．40 0．36g 70．00 2．71±1．11 0．03g 50．00 2．00±0．71*組別空白組模型組高劑量組中劑量組低劑量組陽性藥組動物數(shù)10 10 10 10 10 10

2.2 血漿E2、Prog水平 與正常大鼠相比，原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠血漿 E2水平顯著升高（P＜0．01），血漿Prog水平顯著降低（P＜0．05）。但陽性藥與元胡止痛口服液給藥后，模型大鼠血漿E2與Prog水平均未見顯著回調(diào)。見圖1。

圖1 元胡止痛口服液對大鼠血漿E2（A）、Prog（B）水平的影響（n=10）Fig.1 Effectsof Yuanhu Zhitong Oral Liquid on the levels of E2（A）and Prog（B）in the p lasma of rats（n=10）

2.3 血漿MDA、SOD、GSH-Px水平 與空白組相比，模型組大鼠血漿 MDA 水平顯著升高（P＜0．001），血漿 SOD 與 GSH-Px水平顯著降低（P＜0．05）。與模型組相比，陽性藥組、高劑量組、中劑量組大鼠血漿MDA水平均顯著下調(diào)（P＜0．05）。但與模型組相比，元胡止痛口服液各劑量組大鼠血漿SOD與GSHPx水平均無顯著變化，結(jié)果見圖2。

圖2 元胡止痛口服液對大鼠血漿MDA（A）、SOD（B）與GSH-Px（C）水平的影響（n=10）Fig.2 Effectsof Yuanhu Zhitong Oral Liquid on the levels of MDA（A）、SOD（B）and GSH-Px（C）in the plasma of rats（n=10）

2.4 子宮組織 PGF2α、PGE2、TXB2、6-keto-PGF1α水平 與正常大鼠相比較，原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠子宮組織 PGF2α水平顯著升高（P＜0．001），PGE2水平顯著降低（P＜0．05），且 PGF2α/PGE2比值顯著增高（P＜0．001）。元胡止痛口服液給藥后，各劑量組大鼠子宮PGF2α水平均顯著下調(diào)（P＜0．01），且各組 PGF2α/PGE2比值與模型組相比均顯著降低（P＜0．01）。但元胡止痛口服液與陽性藥對大鼠子宮PGE2水平無顯著影響。見圖3。

與正常大鼠相比，模型大鼠子宮組織TXB2水平顯著升高（P＜0．01），6-keto-PGF1α水平顯著降低（P＜0．001），TXB2/6-keto-PGF1α比值顯著增高（P＜0．001）。元胡止痛口服液對模型大鼠子宮TXB2水平無顯著影響，但對6-keto-PGF1α有一定的調(diào)節(jié)作用，高劑量組與中劑量組大鼠子宮6-keto-PGF1α水平與模型組相比均顯著升高（P＜0．05），且各劑量組大鼠子宮TXB2/6-keto-PGF1α比值均顯著下調(diào)（P＜0．05）。見圖 4。

圖3 元胡止痛口服液對大鼠子宮PGF2α（A）、PGE2（B）與PGF2α/PGE2（C）水平的影響（n=10）Fig.3 Effects of Yuanhu Zhitong Oral Liquid on the levels of PGF2α（A），PGE2（B）and PGF2α/PGE2（C）in the uterus of rats（n=10）

圖4 元胡止痛口服液對大鼠子宮TXB2（A）、6-keto-PGF1α（B）與TXB2/6-keto-PGF1α（C）水平的影響（n=10）Fig.4 Effectsof Yuanhu Zhitong Oral Liquid on the levels of TXB2（A），6-keto-PGF1α（B）and TXB2/6-keto-PGF1α（C）in the uterusof rats（n=10）

2.5 子宮組織Ca2+、NO水平 與空白組相比，模型組大鼠子宮組織 Ca2+含量顯著升高（P＜0．01），NO 水平顯著下降（P＜0．05）。與模型組相比，陽性藥組、高劑量組、中劑量組大鼠子宮Ca2+含量均顯著下調(diào)（P＜0．05），同時大鼠子宮NO水平有上調(diào)趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見圖5。

3 討論

圖5 元胡止痛口服液對大鼠子宮Ca2+（A）、NO（B）水平的影響（n=10）Fig.5 Effects of Yuanhu Zhitong Oral Liquid on the levels of Ca2+（A）and NO（B）in the uterus of rats（n=10）

原發(fā)性痛經(jīng)的主要癥狀表現(xiàn)為周期發(fā)作的下腹部痙攣性疼痛，縮宮素誘導(dǎo)的痛經(jīng)動物模型是觀察原發(fā)性痛經(jīng)疼痛程度的首選模型，而扭體反應(yīng)則是評價動物疼痛程度的經(jīng)典行為學(xué)指標，目前在原發(fā)性痛經(jīng)的機制與防治研究中有廣泛應(yīng)用[8-9]。本研究首先灌胃給予大鼠己烯雌酚以提高子宮敏感性，之后注射縮宮素誘發(fā)子宮痙攣性收縮，觀察到模型大鼠出現(xiàn)典型的扭體反應(yīng)，與文獻報道一致[10]，提示痛經(jīng)大鼠模型的成功建立。進一步研究發(fā)現(xiàn)，元胡止痛口服液可顯著減少痛經(jīng)大鼠扭體反應(yīng)發(fā)生次數(shù)，降低大鼠扭體反應(yīng)發(fā)生率，提示元胡止痛口服液對縮宮素誘導(dǎo)的痛經(jīng)大鼠模型具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。

原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前認為是由多項因素綜合作用的結(jié)果[11]。較多研究表明，氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化參與了原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)生發(fā)展過程[12-13]。正常狀態(tài)下，機體產(chǎn)生的氧自由基可被SOD、GSH-Px等抗氧化酶迅速清除。痛經(jīng)時，子宮平滑肌痙攣性收縮導(dǎo)致子宮肌層與內(nèi)膜的暫時性缺血，子宮組織細胞由于缺血-再灌注而產(chǎn)生較多的氧自由基，同時抗氧化酶活性降低，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，產(chǎn)生了較多的脂質(zhì)自由基及降解產(chǎn)物MDA，進而破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，加重子宮內(nèi)膜的損傷，進一步加劇了痛經(jīng)癥狀[14]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其水平反應(yīng)了脂質(zhì)過氧化的程度，本研究觀察到縮宮素誘導(dǎo)的痛經(jīng)模型大鼠血漿MDA水平顯著升高，同時SOD與GSH-Px活性顯著降低，與文獻報道一致[15]，提示模型大鼠處于氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化狀態(tài)。元胡止痛口服液給藥后，雖然模型大鼠血漿SOD與GSH-Px無顯著回調(diào)，但觀察到血漿MDA水平顯著降低，這提示元胡止痛口服液對痛經(jīng)子宮內(nèi)膜缺血-再灌注損傷時的脂質(zhì)過氧化狀態(tài)有一定的調(diào)節(jié)作用。

另一方面，原發(fā)性痛經(jīng)與子宮內(nèi)膜前列腺素的合成與分泌異常密切相關(guān)[16]。較多文獻報道[17-18]原發(fā)性痛經(jīng)患者子宮內(nèi)膜與外周血中PGF2α含量顯著增高，且 PGF2α/PGE2比例失衡。高濃度的 PGF2α作用于螺旋小動脈壁上的PGF2α受體，可引起子宮平滑肌痙攣性收縮，致使子宮缺血缺氧，酸性代謝產(chǎn)物堆積于子宮肌層進而誘發(fā)痛經(jīng)。相反，PGE2具有松弛子宮平滑肌，抑制子宮收縮的功能，二者比值（PGF2α/PGE2）的升高提示痛經(jīng)程度的加重[19]。本研究觀察到原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠子宮組織PGF2α水平與PGF2α/PGE2比值均顯著升高，與Lu等[20]研究結(jié)果一致。元胡止痛口服液可使模型大鼠子宮PGF2α水平顯著下調(diào)，并使PGF2α/PGE2比值顯著降低，提示元胡止痛口服液可通過調(diào)節(jié)子宮PGF2α含量緩解平滑肌痙攣以發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

其次，子宮平滑肌的痙攣性收縮與血栓素A2（TXA2）和前列環(huán)素（PGI2）的比例失調(diào)有密切關(guān)聯(lián)[21]。TXA2由血小板釋放，具有收縮血管和促進血小板聚集的功能；PGI2則由血管內(nèi)皮細胞釋放，具有擴張血管、抗血小板聚集的作用；TXA2/PGI2代謝失衡致使子宮局部微循環(huán)障礙，導(dǎo)致子宮缺血缺氧，進而引起子宮平滑肌痙攣性收縮，加重痛經(jīng)癥狀[22]。但是TXA2與PGI2在體內(nèi)均不穩(wěn)定，半衰期較短，因此常檢測二者各自的代謝產(chǎn)物TXB2與6-keto-PGF1α來間接反映TXA2與PGI2的水平[23]。在本研究中，原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠子宮組織TXB2與6-keto-PGF1α的比值顯著增高，元胡止痛口服液能顯著改善模型大鼠子宮6-keto-PGF1α水平，對TXB2/6-keto-PGF1α比例的失衡具有一定的調(diào)節(jié)作用，提示元胡止痛口服液可通過改善痛經(jīng)大鼠子宮微循環(huán)障礙而緩解痛經(jīng)癥狀。

此外，本研究還觀察到元胡止痛口服液可使原發(fā)性痛經(jīng)大鼠子宮Ca2+水平顯著降低?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，痛經(jīng)時子宮組織細胞由于缺血-再灌注會造成細胞內(nèi)Ca2+超載，一方面導(dǎo)致細胞能量耗竭，細胞膜受損；另一方面加劇了血管收縮，使子宮內(nèi)膜供血不足，加劇子宮平滑肌痙攣性收縮，引發(fā)痛經(jīng)[24]。元胡止痛口服液對模型大鼠子宮Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡的調(diào)節(jié)作用，可能與抑制縮宮素誘導(dǎo)的細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放，以及影響子宮平滑肌細胞膜上的電壓依賴性Ca2+通道密切相關(guān)[25]。本研究還發(fā)現(xiàn)原發(fā)性痛經(jīng)大鼠血漿E2含量顯著升高，血漿Prog與子宮NO水平顯著降低，提示模型大鼠生殖激素與內(nèi)源性NO的合成與釋放出現(xiàn)異常，與文獻報道一致[26-27]。但在給藥后未觀察到模型大鼠血漿E2與Prog水平有顯著的回調(diào)，提示元胡止痛口服液對痛經(jīng)大鼠生殖激素的代謝失衡沒有顯著的影響。同時，元胡止痛口服液對大鼠子宮NO的調(diào)節(jié)作用也較為有限，具體還有待進一步的實驗驗證。

綜上所述，元胡止痛口服液可顯著減少縮宮素所致痛經(jīng)大鼠模型的扭體次數(shù)，其主要通過降低大鼠血漿MDA水平，下調(diào)子宮組織PGF2α與Ca2+含量，以及上調(diào)子宮6-keto-PGF1α水平而發(fā)揮解痙鎮(zhèn)痛作用。該研究為元胡止痛口服液臨床用于治療原發(fā)性痛經(jīng)提供了一定的藥效學(xué)依據(jù)，其作用機制和靶點還有待進一步的驗證與研究。