基于網(wǎng)絡藥理學的當歸補血湯輔助治療肺癌的作用機制研究*

劉 鑫，趙 穎，王永潔，劉欣妍，劉 葭，吳 清

（北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488）

肺癌在所有腫瘤中是最主要的致死因素，已成為全球共同面對和急需解決的公共衛(wèi)生問題之一[1]。肺癌病死率逐年增加，嚴重威脅人類健康并加重社會負擔[2]。目前，西醫(yī)臨床上多采用化療的方法進行治療[3]，但化療的同時，患者的正常細胞也會受到損傷，不良反應較大，因此肺癌患者進行化療時，臨床上多采用中藥復方進行輔助治療[4]。

當歸補血湯由黃芪和當歸兩味中藥組成，出自李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》，是補氣生血的經(jīng)典名方[5-6]。方中黃芪補脾肺之氣，固護肌表，為君藥；當歸養(yǎng)血和營，為臣藥，兩藥配伍，共奏補氣生血之功效[7]。當歸補血湯化學成分復雜，主要含有黃酮類、多糖類及揮發(fā)油類成分?，F(xiàn)代藥理學研究表明，當歸補血湯具有改善血液系統(tǒng)疾病、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、促進血管生成、抗腫瘤等藥理作用[8-9]。亦有臨床報道用當歸補血湯及其加減方作為肺癌化療時的輔助用藥[10-11]，但當歸補血湯輔助治療肺癌的具體機制仍然不清晰。

由于中藥具有多成分、多靶點的特點，為研究中藥治療某種疾病的作用機制增添了難度，網(wǎng)絡藥理學的出現(xiàn)促進了中藥作用機制的研究。網(wǎng)絡藥理學融合了系統(tǒng)生物學、多向藥理學、網(wǎng)絡分析學及計算生物學等多學科的技術和內(nèi)容，通過構建“疾病-表型-基因-藥物”的多層次結構網(wǎng)絡，從系統(tǒng)水平上揭示藥物與疾病之間的關系，其系統(tǒng)性、整體性的思想與中醫(yī)中藥辨證論治、協(xié)同作用理念不謀而合[12-14]。因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，對當歸補血湯多成分、多靶點與肺癌的復雜網(wǎng)絡關系進行分析，旨在揭示當歸補血湯輔助治療肺癌的作用機制，為其應用提供一定的理論依據(jù)。

1 方法

1.1 研究思路 利用網(wǎng)絡藥理學的方法研究當歸補血湯輔助治療肺癌的實驗思路見圖1。

1.2 當歸補血湯活性成分的收集和篩選 本實驗利用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，http：//lsp．nwu．edu．cn/tcmsp．php）[15]，分別以“黃芪”“當歸”為關鍵詞進行搜索，檢索當歸補血湯中的所有化學成分。將篩選條件設置為 OB≥30%，DL≥0．18[16]，篩選出當歸補血湯中的活性成分。

圖1 當歸補血湯輔助治療肺癌的網(wǎng)絡藥理學研究方法示意圖Fig.1 Work schemeof network pharmacology approach of Danggui Buxue Decoction in ad juvant treatment of lung cancer

1.3 當歸補血湯成分靶點的垂釣 利用中藥成分靶點數(shù)據(jù)庫（HIT，http：//lifecenter．sgst．cn/hit/）查詢成分已驗證的靶點[17]，通過 PubChem（https：//pubchem．ncbi．nlm．nih．gov/）查詢化合物的 SMILES[18]號，然后將SMILES號導入Swiss Target Prediction Database（http：//www．swisstargetprediction．ch/）預 測成分的靶點[19]。通過 Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www．uniprot．org/）[20]將所有成分的靶點校準為官方基因名稱。

1.4 疾病靶點的查找 通過Therapeutic Targets Database（TTD，http：//bidd．nus．edu．sg/group/cjttd/）[21]，Drugbank database （https：//www．drugbank．ca/）[22]，及DisGeNET database （http：//www．disgenet．org/web/DisGeNET/menu/home）[23]查找肺癌相關靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一基因名稱。

1.5 成分靶點與疾病靶點共同靶點的獲取 通過Venny 2．1．0（http：//bioinfogp．cnb．csic．es/tools/venny/）[24]將成分靶點與疾病靶點取交集得到共同靶點，這些共同靶點認為是當歸補血湯輔助治療肺癌可能的關鍵靶點。

1.6 網(wǎng)絡的構建和分析 通過Cytoscape 3．2．1構建成分-靶點等多層次網(wǎng)絡圖。網(wǎng)絡中節(jié)點的拓撲學特征可以通過Cytoscape中的NetworkAnalyzer進行計算，包括自由度、介數(shù)中心性及平均最短路徑長度等，其中度值是較為重要的評價指標[25]。

1.7 基因富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david．ncifcrf．gov/）進行通路富集分析，并通過Omicshare平臺 （http：//www．omicshare．com/tools/index．php/）對通路富集分析的結果進行可視化處理[26]。

2 結果

2.1 當歸補血湯中活性成分的收集 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查找到當歸補血湯212個成分，其中黃芪87個，當歸125個，經(jīng)過OB值和DL值篩選后，黃芪剩余19個成分，當歸剩余2個成分。中藥中某些成分本身具有良好的生物活性，但因其口服生物利用度較低或不具有良好的類藥性等，在篩選時易被過濾掉，因此，本實驗在查閱文獻的基礎上[27-29]，黃芪中加入活性成分黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ及黃芪甲苷，共有23個成分納入后續(xù)研究，當歸中加入活性成分阿魏酸及藁本內(nèi)酯，一共4個成分納入研究，見表1。

2.2 靶點的收集 通過HIT數(shù)據(jù)庫查找成分已通過實驗驗證的靶點，利用基于結構相似性原理的Swiss Target Prediction Database來預測成分的靶點，黃芪中共得到398個靶點，當歸中得到60個靶點，刪除重復項后，剩余194個靶點，其中有26個靶點為黃芪和當歸所共有。通過TTD、Drugbank及DisGeNET數(shù)據(jù)庫查找肺癌相關靶點，其中TTD數(shù)據(jù)庫中查找到88個疾病靶點，Drugbank數(shù)據(jù)庫查找到135個，DisGeNET數(shù)據(jù)庫查找到70個靶點，刪除重復后剩余263個疾病相關靶點。通過Venny 2．1．0將成分靶點與疾病靶點取交集，得到45個共同靶點，這45個共同靶點視為當歸補血湯輔助治療肺癌可能的潛在靶點，見圖2及表2。

2.3 活性成分-對應靶點網(wǎng)絡構建與分析 通過Cytoscape構建當歸補血湯中成分-對應靶點的網(wǎng)絡圖，如圖3所示，該網(wǎng)絡中包含了221個節(jié)點，458條邊，其中節(jié)點代表當歸補血湯中成分或者成分對應的靶點，邊表示成分和靶點之間具有相互作用，通過網(wǎng)絡圖可以看出，存在多個成分對應一個靶點或者一個成分對應多個靶點的現(xiàn)象，表明當歸補血湯是通過多成分、多靶點協(xié)同起效的方式輔助治療肺癌的。通過Cytoscape構建當歸補血湯中活性成分對應45個共同靶點的網(wǎng)絡圖，見圖4，網(wǎng)絡具有68個節(jié)點（45個為靶點節(jié)點，23個為成分節(jié)點），103條邊，利用Cytoscape中的NetworkAnalyzer分析節(jié)點的度值及相關參數(shù)，節(jié)點顏色由粉色變紅色表明度值逐漸增大，根據(jù)度值判斷靶點的重要性，由圖4可以看出，成分度值排名前3的為山奈酚（AR-15，度值 20）、槲皮素（AR-19，度值 8）、芒柄花素（AR-12，度值7），這些成分可能是當歸補血湯輔助治療肺癌比較重要的成分，靶點度值排名前3的為微管相關蛋白Tau（MAPT，度值12）、細胞色素P450 19A1（CYP19A1，度值10）、雌激素受體α（ESR1，度值8），當歸補血湯可能通過作用于這些靶點發(fā)揮輔助治療肺癌的作用。

表1 當歸補血湯中的成分Tab.1 Com ponents in Danggui Buxue Decoction

2.4 通路富集分析及當歸補血湯活性成分-靶點-關鍵通路網(wǎng)絡的構建 通過DAVID平臺對45個靶點進行基因的功能注釋及通路富集分析，結果表明45個靶點參與了170個生物過程相關的條目、30個細胞組成相關條目、54個分子功能相關條目，根據(jù)FDR＜0．05進行篩選，生物過程篩選出16個條目，主要涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、細胞增殖的正向調(diào)控等方面；細胞組成篩選出3個條目，涉及受體復合物、細胞器膜等方面；分子功能篩選出12個條目，主要涉及受體信號蛋白酪氨酸激酶活性、ATP結合等方面，見圖5。將DAVID通路富集分析結果 P值＜0．01的前 27條通路通過Omicshare平臺進行可視化，結果見圖6，圖中圓點越大，表明通路富集到的基因數(shù)目越多，圓點的顏色越紅，表明P值越小。對FDR＜0．05的8條通路通過Cytoscape構建當歸補血湯中中藥-活性成分-靶點-關鍵通路網(wǎng)絡，結果如圖7所示，其中度值較高的通路為癌癥通路（pathwanys in cancer，度值 15）、癌癥蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer，度值 11）、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路（PI3K-Akt signaling pathway，度值12）等，表明當歸補血湯可能通過作用于這些通路來達到輔助治療肺癌的目的。

表2 當歸補血湯輔助治療肺癌的45個潛在靶點Tab.2 Forty-five potential targets of Danggui Buxue Decoction in adjuvant treatment of lung cancer

圖2 成分靶點與疾病靶點取交集后的韋恩圖Fig.2 Venn diagram after intersection of com ponent targets and disease targets

3 討論

當歸補血湯由黃芪和當歸兩味藥組成，是“補氣生血”的經(jīng)典方，可用于治療多種疾病，臨床上也用于肺癌化療時的輔助用藥[10]。由于中藥復方由多味中藥組成，每味中藥組成成分復雜，每個成分對應靶點較多，靶點之間可能存在協(xié)同或拮抗等作用，因此難以闡明中藥復方治療某種疾病的作用機制。網(wǎng)絡藥理學是在研究者所建立的數(shù)據(jù)庫中進行中藥成分、成分靶點、疾病靶點的查找，可以系統(tǒng)性、整體性的揭示靶點與疾病之間的相互關系，闡明中藥復方治療疾病的作用機制，這與中醫(yī)整體觀、辨證論治的思想不謀而合[12]。因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法，探究當歸補血湯輔助治療肺癌的作用機制，為臨床上當歸補血湯的使用提供一定的理論指導。

圖3 當歸補血湯中成分-靶點相互作用網(wǎng)絡（紫色-黃芪成分，藍色-黃芪靶點，黃色-當歸成分，綠色-當歸靶點，紅色-黃芪當歸共同靶點）Fig.3 Com pounds-targets interaction network of Danggui Buxue Decoction（Purple-Com pounds of Astragali Radix，Blue-Targetsof Astragali Radix，Yellow-Com pounds of Angelicae Sinensis Radix，Green-Targetsof Angelicae Sinensis Radix，Red-Common targets of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix）

圖4 當歸補血湯輔助治療肺癌活性成分-45個潛在作用靶點網(wǎng)絡圖（節(jié)點顏色由粉色變紅色表明自由度逐漸增大，菱形-活性成分，圓形-靶點）Fig.4 Network of active ingredients for ad juvant treatment of lung cancer in Danggui Buxue Decoction-45 potential targets（The changeof nodescolor from pink to red indicates that the degree of freedom increases gradually，Diamond-Active com ponent，Circular-Target）

圖5 GO功能富集分析Fig.5 GO function enrichment analysis

圖6 KEGG富集分析Fig.6 Enrichment analysisof KEGG

圖7 中藥-成分-靶點-通路網(wǎng)絡（綠色-中藥，紫色-活性成分，藍色-靶點，黃色-通路）Fig.7 Network of Traditional Chinese medicine-Com ponents-Targets-Pathways（Green-Traditional Chinese medicine，Purple-Active component，Blue-Target，Yellow-Pathway）

本研究分析了當歸補血湯中黃芪和當歸兩味中藥的活性成分，通過數(shù)據(jù)庫的查找、篩選及文獻的查閱，最終得到27個活性成分，其中23個屬于君藥黃芪，4個屬于臣藥當歸。通過數(shù)據(jù)庫的查詢，黃芪中得到398個靶點，當歸中得到60個靶點，刪除重復靶點后，剩余194個成分靶點，有26個靶點為黃芪和當歸所共有。通過公共數(shù)據(jù)庫的查找，共查找到疾病相關靶點263個，將成分靶點與疾病靶點取交集后，得到45個共同靶點，這45個靶點視為當歸補血湯輔助治療肺癌可能的關鍵靶點。通過構建當歸補血湯中活性成分-45個潛在作用靶點網(wǎng)絡，預測出槲皮素、山奈酚、芒柄花素可能是當歸補血湯輔助治療肺癌的關鍵成分，已有研究表明槲皮素可以誘發(fā)BCL2/BAX介導的A549細胞凋亡壞死，并且通過擾動微管的有絲分裂，導致單極紡錘體的形成，造成細胞分裂的失敗，槲皮素還可以通過抑制波形蛋白和n-鈣黏蛋白的表達抑制A549細胞的遷移[30]；山奈酚可以抑制人非小細胞肺癌A549細胞的活力，降低cyclinD1的表達水平，用山奈酚處理A549細胞后，p-PI3K和p-Akt水平降低，表明山奈酚可以通過抑制PI3K-Akt信號通路的激活發(fā)揮抗腫瘤的作用[31]；芒柄花素可以改變細胞周期相關蛋白p21、細胞周期蛋白A及細胞周期蛋白D1的表達水平，誘導A549及NCI-H23兩種非小細胞肺癌細胞株細胞周期阻滯于G1期，從而促進細胞凋亡[32]。槲皮素、山奈酚、芒柄花素均可在一定程度上抑制肺癌的發(fā)展，表明網(wǎng)絡藥理學的結果具有一定的可靠性。黃芪多糖是黃芪的有效部位，現(xiàn)代大量研究表明黃芪多糖具有良好的調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤的作用，因此可以用作治療肺癌時的輔助用藥[33]，如王永清[34]等發(fā)現(xiàn)黃芪多糖聯(lián)合順鉑對Lewis肺癌荷瘤小鼠的腫瘤生長具有抑制作用，增強機體的免疫功能、抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達及增加內(nèi)皮抑素（Endostatin）的表達是其可能的作用機制，但黃芪多糖本身是一種混合物，結構較為復雜，而網(wǎng)絡藥理學主要關注小分子化合物，因此在本研究中未涉及黃芪多糖。MAPT、CYP19A1、ESR1等是當歸補血湯輔助治療肺癌的主要靶點。MAPT與微管的聚合及解聚密切相關，并可以維持微管動力學的平衡[35]。MAPT與紫杉類藥物具有相同的結構域，因此，當MAPT高表達時，可以競爭性的與微管結合，這可能是采用紫杉類藥物對肺癌患者進行化療時機體產(chǎn)生耐藥性的原因[36]，亦有研究通過miR-186靶向MAPT調(diào)節(jié)非小細胞肺癌對紫杉醇的化療敏感性[37]。CYP19A1又稱為芳香化酶或雌激素合成酶，可以將人體內(nèi)雄激素轉化為雌激素，是該過程的關鍵限速酶[38]，雌激素可以促進肺癌細胞的增殖，肺癌患者中雌激素水平往往高于正常人體，抗雌激素藥物對肺癌的發(fā)展具有抑制作用[39]，有研究表明，非小細胞肺癌患者標本中的CYP19A1蛋白含量明顯高于正常標本[40]，亦有研究發(fā)現(xiàn)，CYP19A1基因的一個單核苷酸多態(tài)性基因分型rs3764221通過引起更高水平CYP19A1的表達而促進肺腺癌的發(fā)展[41]。因此推測當歸補血湯可以作用于CYP19A1，從而減少雌激素的合成，抑制肺癌細胞增殖，達到輔助治療肺癌的作用。雌激素是類固醇激素，通過與靶器官上的雌激素受體結合而在體內(nèi)發(fā)揮作用。雌激素受體主要有兩個亞型，雌激素受體 α（ESR-α，ESR1）和雌激素受體 β（ESR-β，ESR2）[42]。Unai等[40]發(fā)現(xiàn) ESR1 在正常肺組織樣本中的表達要明顯高于非小細胞肺癌樣本，并且高表達ESR1的非小細胞肺癌患者生存率有所升高?，F(xiàn)代研究表明，ESR1可以通過上調(diào)細胞周期蛋白D1的水平促進細胞異常增殖，并且抑制細胞凋亡從而促進腫瘤的生長，ESR1也可以與EGFR相互作用激活PI3K-Akt信號通路促進細胞的增殖，該信號通路可以調(diào)節(jié)ESR1的活性，同樣ESR1對PI3K-Akt信號通路也具有調(diào)節(jié)作用[43]。有研究表明，PI3K-Akt通路可以參與免疫抑制微環(huán)境的形成，影響腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫細胞的活性，而阻斷該通路可以恢復機體被破壞的免疫應答，增強自身免疫，從而增強抗腫瘤固有的免疫效應[44]。肺癌患者在化療的同時，不僅殺死了癌細胞，人體的正常細胞也會受到損傷，使人體的免疫功能下降，中醫(yī)學中的“氣血陰陽虧虛”與現(xiàn)代醫(yī)學中人體免疫功能低下關系密切，而當歸補血湯可以補氣生血[45]，因此推測當歸補血湯可能作用于ESR1，從而抑制PI3K-Akt信號通路的激活，通過增強自身的免疫能力達到輔助治療肺癌的目的，但該推測仍需要通過進一步的實驗進行驗證。細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）及細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）與肺癌的發(fā)展關系密切[46]，當歸補血湯可能通過作用于CDK4及CDK2抑制細胞周期進程，從而起到輔助治療肺癌的作用。肺癌的侵襲和轉移依賴于豐富的血液供應，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在肺癌患者中高表達，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）水平在肺癌患者中亦有所升高，從而促進腫瘤轉移[47]，因此推測當歸補血湯可能作用于VEGF及MMP抑制肺癌的侵襲和轉移，達到輔助治療肺癌的目的。以上研究均表明MAPT、CYP19A1、ESR1、CDK4、CDK2、VEGF、MMP 等基因與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，表明網(wǎng)絡藥理學預測的結果具有一定的可靠性。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法，初步研究了當歸補血湯中活性成分輔助治療肺癌的作用機制，表明當歸補血湯通過多成分、多靶點、多通路的方式達到協(xié)同起效的目的，為后續(xù)進一步研究當歸補血湯輔助治療肺癌的作用機制奠定了基礎，為臨床上當歸補血湯的合理應用提供了理論依據(jù)。