熄風(fēng)膠囊對匹羅卡品致癇大鼠電壓門控性鈉通道功能的影響*

路巖莉，房艷艷，李新民，孫 丹，馬莉婷，韓耀巍

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2．山東省臨沂市中醫(yī)醫(yī)院，臨沂 276002）

電壓門控性鈉通道（VGSC）是細(xì)胞動作電位產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)和功能異常參與癲癇的發(fā)病機(jī)制，因此調(diào)節(jié)VGSC功能成為許多抗癲癇藥物的作用機(jī)制，如卡馬西平（CBZ）、奧卡西平（OXC）等[1]。本實驗將從氯化鋰—匹羅卡品致癇大鼠海馬VGSC的功能入手，通過全細(xì)胞膜片鉗觀察中藥復(fù)方制劑熄風(fēng)膠囊對其影響。

1 材料

1.1 動物 13日齡無特定病原體級健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠 60 只，體質(zhì)量（45±10）g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供[許可證號 SCXK-（軍）2013-004]，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始實驗。

1.2 主要藥品及儀器 氯化鋰（批號115K1308，100g/瓶，美國Sigma公司）、鹽酸匹羅卡品（批號066k1730，5g/瓶，美國 Sigma公司）、熄風(fēng)膠囊（批號為津Z0252號，0．33g/粒，天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院杏林藥廠。藥物組成：紫河車、石菖蒲、天麻、川芎、全蝎、白僵蠶、蜈蚣、白礬、郁金等）、EPC-10型膜片鉗放大器（德國HEKA公司）、MP285R型微電極推進(jìn)器（美國Sutter公司）、P-97型微電極拉制儀（美國Sutter公司）等。

2 實驗動物的分組及處理

2.1 造模 將60只大鼠隨機(jī)分成兩大組，空白組10只，其余50只用于建模。腹腔注射127 mg/kg氯化鋰，18 h后腹腔注射1 mg/kg硫酸阿托品，30 min后分兩次腹腔注射30 mg/kg匹羅卡品，大鼠出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)1 h后，再給予腹腔注射10 mg/kg地西泮以止抽，必要時可重復(fù)注射1～2次，直到癇性發(fā)作被完全控制[2]。

2.2 分組 47只造模成功大鼠隨機(jī)選出40只分為4組，每組10只，分別為模型組、熄風(fēng)膠囊高劑量治療組（熄高組）、熄風(fēng)膠囊中劑量治療組（熄中組）和熄風(fēng)膠囊低劑量治療組（熄低組）。

2.3 處理 熄高組、熄中組和熄低組大鼠，分別每天上午灌胃熄風(fēng)膠囊 0．33、0．66 和 0．99 g 濃縮劑2 mL 1次；模型組和空白組大鼠，分別每天上午灌胃生理鹽水2 mL 1次。共持續(xù)60 d。

3 實驗方法

大鼠斷頭取腦，在孵育液中分離出海馬并切成400μm厚的腦片，加入蛋白酶在30℃下消化30 min后用孵育液洗腦片3次，放入盛有氧飽和標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液的離心管內(nèi)，用Pasteur吸管輕輕吹打，靜止約2 min，取上部的細(xì)胞懸液加入含標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液的灌注槽內(nèi)，約15 min后細(xì)胞貼壁于涂布多賴氨酸的圓形蓋玻片上，即進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。

本實驗記錄電極選用軟質(zhì)玻璃毛坯，經(jīng)P-97拉制儀拉制后拋光，尖端直徑為1～2μm，充灌電極內(nèi)液后電極阻抗約為2～8 MΩ。記錄在室溫（2～24℃）下進(jìn)行，采用EPC-10膜片鉗放大器記錄膜電流，通過Pulse軟件進(jìn)行實驗參數(shù)的設(shè)置、數(shù)據(jù)的采集和刺激的施加，采樣頻率為10 kHz，濾波頻率為2．9 kHz。采樣后將數(shù)據(jù)存貯在硬盤，以供測量和分析。

4 統(tǒng)計分析

使用Graphpad Prism 6．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。計量資料均值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK檢驗；P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

5 實驗結(jié)果

5.1 熄風(fēng)膠囊對IE大鼠SRS的影響 本實驗采用氯化鋰-匹羅卡品癲癇動物模型，造模成功率為94%。在造模及隨后60 d灌胃過程中，致癇大鼠均出現(xiàn)了癲癇慢性期的行為學(xué)改變，即癲癇持續(xù)狀態(tài)后15 d到60 d內(nèi)出現(xiàn)反復(fù)自發(fā)性發(fā)作（SRS）。如表1所示，空白組未見SRS發(fā)作，其余各實驗組均有SRS發(fā)作。與模型組比較，熄高組、熄中組和熄低組SRS發(fā)作次數(shù)均低于模型組，差異有顯著性（F=19．538 1，P=0．00）。在熄風(fēng)膠囊治療組中，隨劑量增加SRS發(fā)作次數(shù)逐漸減少，其中熄高組和熄低組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05），而熄高組和熄中組、熄中組和熄低組之間均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

5.2 大鼠海馬神經(jīng)元鈉通道功能電生理學(xué)檢測

5.2.1 電流-電壓曲線 細(xì)胞膜電位鉗制在-90 mV，從-80 mV到+100 mV，以5 mV的幅度遞增給予細(xì)胞去極化刺激，可激發(fā)一系列鈉電流。經(jīng)細(xì)胞膜電容標(biāo)化后，兩組均約-60 mV時出現(xiàn)內(nèi)向電流，即鈉通道開始激活。內(nèi)向電流達(dá)到峰值時提示鈉通道開放到最大程度，流入細(xì)胞內(nèi)的鈉離子濃度最高。以不同膜電位為橫軸，該膜電位下的鈉電流峰值為縱軸，繪制鈉通道的電流-電壓曲線（見圖1A）?？v坐標(biāo)鈉電流的波幅峰值均經(jīng)過標(biāo)化，分別與相應(yīng)的測試脈沖電壓對應(yīng)，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析（見表2）。

表1 熄風(fēng)膠囊對各組大鼠SRS的影響Tab.1 Effect of Xifeng Capsuleon SRSin ratsof each group

表1 熄風(fēng)膠囊對各組大鼠SRS的影響Tab.1 Effect of Xifeng Capsuleon SRSin ratsof each group

注：與模型組比較，*P＜0．05。

組別 動物數(shù) SRS發(fā)作次數(shù)（次）空白組 10 0模型組 10 29．60±2．69熄高組 10 15．73±1．58*熄中組 10 17．07±2．40*熄低組 10 18．60±2．16*

從電流-電壓曲線可見，各治療組的曲線較模型組顯著上移，但鈉電流的激活閾電位沒有明顯變化（均在約-60 mV）；從鈉電流平均峰值圖可以直觀的看出，各治療組均有減小鈉電流的作用。從表2中可以看出各組鈉通道電流-電壓曲線峰值電流相比較有統(tǒng)計學(xué)差異（F=23．89，P=0．00），其中與空白組相比較，模型組和熄低組差異有顯著性（P＜0．01），而與熄高組和熄中組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）；與模型組相比，治療組電流均下降，其中熄高組和熄中組差異有顯著性（P＜0．01），熄低組有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）；各中藥治療組之間，熄高組和熄中組相比有隨劑量增加而電流下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），而熄高組、熄中組分別與熄低組相比差異有顯著性（P＜0．01）。

5.2.2 激活曲線 在電壓鉗制模式下，把初始電壓鉗制在-90 mV，預(yù)置-120 mV超極化電壓200 ms，隨后給予-80 mV至＋100 mV的躍階指令電壓刺激，步幅為5 mV，每個電壓指令的作用時程為50 ms。記錄到的這一系列指令電壓激活的內(nèi)向電流，以電導(dǎo)值與最大電導(dǎo)值的比值（G/Gmax）及對應(yīng)膜電位繪制出兩組鈉通道的激活曲線（見圖1B）?？v坐標(biāo)鈉電流的波幅峰值均經(jīng)過標(biāo)化，分別與相應(yīng)的測試脈沖電壓對應(yīng)，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析（見表3）。

表2 電流-電壓曲線峰值電流比較Tab.2 Comparison of peak current on current-voltage curve

表2 電流-電壓曲線峰值電流比較Tab.2 Comparison of peak current on current-voltage curve

注：與空白組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別 例數(shù) 峰值電流（pA/pF）空白組 10 -229．06±26．01模型組 10 -319．70±28．24*熄高組 10 -225．13±31．70#熄中組 10 -243．55±23．74#熄低組 10 -289．25±23．33*#

表3 鈉通道激活參數(shù)比較Tab.3 Com parison of sodium channel activation parameters

表3 鈉通道激活參數(shù)比較Tab.3 Com parison of sodium channel activation parameters

注：與空白組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別 動物數(shù) V1/2（mV） k（G/Gmax）空白組 10 -55．11±2．06 4．501±0．85模型組 10 -58．95±1．97* 4．150±0．80*熄高組 10 -55．77±2．87# 5．463±1．11#熄中組 10 -55．73±1．68# 3．932±0．67#熄低組 10 -55．28±2．38# 5．001±1．24#

對表3所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析示各組V1/2值（F=5．04，P=0．001 9）和 K 值（F=4．27，P=0．0052）比較差異有顯著性。其中與空白組相比較，模型組差異有顯著性（P＜0．01），而與熄高組、熄中組和熄低組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）；與模型組相比，治療后激活閾值上升，熄高組和低中組有顯著性差異（P＜0．01），熄中組差異有統(tǒng)計學(xué)（P＜0．05）；各中藥治療組之間，隨劑量升高電流有下降趨勢，提示治療后激活閾值有上升趨勢，但各治療組間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

5.2.3 失活曲線 在電壓鉗制的模式下，把初始電壓鉗制在-90 mV，先給予從-120到40 mV躍階指令電壓刺激，步幅為5 mV，刺激波寬1 000 ms；隨后再施以-90到0 mV，步幅為5 mV，時程為50 ms的測試脈沖刺激。記錄兩組測試脈沖下鈉通道電流，以電流峰值與最大電流峰值的比值（I/Imax），與所對應(yīng)的條件刺激脈沖電壓繪制出鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活曲線（見圖1C）?？v坐標(biāo)鈉電流的波幅峰值均經(jīng)過標(biāo)化，分別與相應(yīng)的測試脈沖電壓對應(yīng)，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析（見表4）。

對表4所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析示各組V1/2值（F=17．28，P=0．00）和 K 值（F=57．32，P=0．00）相比較有統(tǒng)計學(xué)差異。其中與空白組相比較，各組均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．01）；與模型組相比，治療后失活閾值下降，各中藥治療組有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．01）；各中藥治療組之間，總體上隨劑量升高失活閾值有下降趨勢，提示治療有效，但各治療組間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

表4 鈉通道失活參數(shù)比較Tab.4 Com parison of sodium channel inactivation parameters

表4 鈉通道失活參數(shù)比較Tab.4 Com parison of sodium channel inactivation parameters

注：與空白組比較，*P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．01。

組別 例數(shù) V1/2（mV） k（G/Gmax）空白組 10 -51．41±0．80 6．24±0．31模型組 10 -63．09±1．87* -5．85±0．26*熄高組 10 -55．78±2．45*# 8．18±0．53*#熄中組 10 -55．10±2．05*# 7．47±0．53*#熄低組 10 -57．89±2．50*# 8．04±0．50*#

5.2.4 失活后恢復(fù)曲線 細(xì)胞靜息狀態(tài)下膜電位鉗制于-90 mV，運(yùn)用雙脈沖刺激方法記錄這一系列失活后再次激活的內(nèi)向電流，即電壓依賴性鈉通道的失活后恢復(fù)電流，以鈉電流條件刺激電壓和測試電壓均間間隔t作圖繪制失活后的恢復(fù)曲線（見圖1D），并用指數(shù)方程 I/Imax=1-exp（-t/τ）擬合曲線，得出的大鼠錐體神經(jīng)元鈉通道電流失活后恢復(fù)的時間常數(shù)（τ）（見表 5）。

表5 各組鈉通道恢復(fù)時間常數(shù)比較Tab.5 Com parison of recovery time constantsof sodium channels in each group

表5 各組鈉通道恢復(fù)時間常數(shù)比較Tab.5 Com parison of recovery time constantsof sodium channels in each group

注：與空白組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別 例數(shù) τ（ms）空白組 10 1．86±0．21模型組 10 1．36±0．15*熄高組 10 2．55±0．43*#熄中組 10 2．37±0．40*#熄低組 10 2．44±0．42*#

對表5所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析示各組鈉通道恢復(fù)時間常數(shù)相比較有統(tǒng)計學(xué)差異（F=19．67，P=0．00）。其中與空白組相比較，各組均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0．01）；與模型組相比，治療后恢復(fù)時間明顯延長，各中藥治療組有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．01）；各中藥治療組之間，總體上隨劑量升高恢復(fù)時間有延長趨勢，提示治療有效，但各治療組間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

6 討論

電壓門控性鈉通道（VGSC）存在三種功能狀態(tài)：開放/被激活，靜息/關(guān)閉和失活/被滅活。VGSC開放引起去極化內(nèi)向電流是動作電位產(chǎn)生和傳遞的基礎(chǔ)[3-4]，是苯妥英鈉、CBZ、OXC、拉莫三嗪等多種抗癲癇藥物（AEDs）在海馬神經(jīng)元的作用靶點(diǎn)。VGSC的密度、分布、分子結(jié)構(gòu)和功能的改變，導(dǎo)致AEDs敏感性下降，影響了鈉通道的激活、失活、失活后恢復(fù)或電流的幅度，最終引起了神經(jīng)元的興奮性改變，從而造成了多種AEDs的對癲癇發(fā)作不敏感[5]。

本院馬融教授根據(jù)“久病必虛”“久病入腎”理論，指出腎精虧虛為致癇之本，治宜“益腎填精、豁痰熄風(fēng)”，基于此而研制了熄風(fēng)膠囊，方中紫河車益腎填精，補(bǔ)腦益智；天麻平肝潛陽、熄風(fēng)止痙，辛潤不燥，配以石菖蒲辛香避穢、豁痰開竅；全蝎、僵蠶以搜風(fēng)剔痰逐瘀；川芎行氣活血；白金丸行氣除痰。諸藥合用，標(biāo)本兼顧，扶正祛邪以治癇病頑疾，且前期臨床研究證實熄風(fēng)膠囊是一種治療小兒癲癇有效的中藥復(fù)方制劑[6-7]。基礎(chǔ)研究方面，通過對氯化鋰-匹羅卡品動物模型的研究，發(fā)現(xiàn)熄風(fēng)膠囊能夠減輕海馬損傷[8]。本實驗進(jìn)一步證實采用熄風(fēng)膠囊干預(yù)治療氯化鋰-匹羅卡品癲癇動物模型可以減少SRS發(fā)作，且隨劑量增加SRS發(fā)作次數(shù)逐漸減少，其中熄風(fēng)膠囊高劑量和低劑量治療相比有統(tǒng)計學(xué)意義。

本實驗通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞VGSC功能變化，從電流-電壓曲線可見，各治療組的曲線較模型組顯著上移，但鈉電流的激活閾電位沒有明顯變化，各治療組均有減小鈉電流的作用。與空白組相比較，模型組和熄低組有顯著性差異，而與熄高組和熄中組比較無統(tǒng)計學(xué)差異；與模型組相比，治療組電流均下降，其中熄高組和熄中組有顯著性差異，熄低組有統(tǒng)計學(xué)差異，均提示熄風(fēng)膠囊治療有效，能降低異常增高的鈉電流，尤其是熄高組和熄中組鈉電流與空白組相近，即接近于正常；各中藥治療組之間，有隨劑量增加而電流下降趨勢，熄高組和熄中組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，而兩者分別與熄低組相比有顯著性差異，提示在對鈉電流影響方面，熄高組和熄中組療效相似，提示在臨床治療上其療效與劑量呈非線性關(guān)系。

從激活曲線和失活曲線可以看出與模型組相比，各中藥治療組激活閾值上升、失活閾值下降，因此整個錐體細(xì)胞不易啟動動作電位，導(dǎo)致其海馬神經(jīng)元的興奮性下降，進(jìn)而達(dá)到控制反復(fù)癲癇發(fā)作的目的，這與CBZ和拉莫三嗪[9]等可通過快速失活和慢速失活以終止動作電位達(dá)到控制癲癇發(fā)作相一致。各中藥治療組總體上隨劑量升高激活閾值有下降趨勢、失活閾值有上升趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

從失活后恢復(fù)曲線可以看出與模型組相比，熄風(fēng)膠囊治療后恢復(fù)時間明顯延長，即延長不應(yīng)期，使其不易再次被激活，從而抑制放電擴(kuò)散和促使發(fā)作放電終止[10]。各熄風(fēng)膠囊治療組之間，總體上隨劑量升高恢復(fù)時間有延長趨勢，但組間無統(tǒng)計學(xué)意義。

本實驗進(jìn)一步證實熄風(fēng)膠囊通過減少VGSC電流，增強(qiáng)VGSC失活，抑制失活后的恢復(fù)，延長恢復(fù)時間來達(dá)到降低VGSC異常活化的作用，從而降低癲癇反復(fù)自發(fā)性發(fā)作，這可能是其作用機(jī)制之一。但是從激活曲線、失活曲線和失活后恢復(fù)曲線來看，熄風(fēng)膠囊各治療組間治療差異無統(tǒng)計學(xué)差異，從另一方面證實了中藥多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，其他作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。