固相萃取LC-MS/MS法測(cè)定疏血通注射液中次黃嘌呤濃度*

王獻(xiàn)瑞 ，趙西子 ，王曉明 ，郭亞卿 ，潘桂湘 ，黃宇虹

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250）

疏血通注射液是由水蛭[1-2]、地龍[3-4]兩味動(dòng)物類中藥經(jīng)低溫提取和膜分離等工藝制成的中藥復(fù)方制劑[5]，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)的功效，臨床常用于瘀血阻絡(luò)所致的缺血性中風(fēng)病中經(jīng)絡(luò)急性期，癥見(jiàn)半身不遂、口舌歪斜、語(yǔ)言謇澀[6-7]。疏血通注射液化學(xué)成分復(fù)雜，含有多肽、多糖、氨基酸、次黃嘌呤等物質(zhì)[8-10]，目前其真正發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]，次黃嘌呤具有明確的生物活性，能透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提高多種酶的活性，參與機(jī)體一些重要生理機(jī)能的調(diào)節(jié)。因此，本文以次黃嘌呤為指標(biāo)成分，建立液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法對(duì)其進(jìn)行定量分析，以期為疏血通注射液質(zhì)量分析、評(píng)價(jià)以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考和依據(jù)。

目前，疏血通注射液中次黃嘌呤的測(cè)定，采用的大多是高效液相色譜-紫外法（HPLC-UV）[13-14]，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。由于疏血通注射液中眾多成分在254 nm處具有紫外吸收，需進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)50 min的梯度洗脫，使次黃嘌呤與注射液中的其他干擾物質(zhì)實(shí)現(xiàn)完全的色譜分離，次黃嘌呤出峰時(shí)間為13min，整個(gè)分析周期相對(duì)較長(zhǎng)[15]。LC-MS/MS具有高選擇性、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)[21]，尤其是具有獨(dú)特的質(zhì)量分辨能力，能在復(fù)雜基質(zhì)中專屬、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)某個(gè)或某幾個(gè)成分。本研究采用固相萃取LC-MS/MS法測(cè)定疏血通注射液中次黃嘌呤濃度，分析時(shí)間縮短至3.50 min，次黃嘌呤出峰時(shí)間為1.02 min，可較大程度提高分析的效率。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國(guó)waters公司），Waters Xevo TQ-S三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)waters公司）；MiniSpin Plus高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），AX205十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），Synergy UV超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試劑和藥品 疏血通注射液（牡丹江友博藥業(yè)股份有限公司）。次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Sigma公司，純度99%以上），6-巰基嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Aldrich公司，純度98%以上）。甲醇（色譜純，德國(guó)Sigma公司），甲酸（色譜純，ROE公司），超純水為Millipore超純水系統(tǒng)制得。Sep-pak C18固相小柱（500 mg，waters公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀系統(tǒng)：二元泵系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分析柱，BEH C18（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）保護(hù)柱；流動(dòng)相為甲醇（A），0.1%甲酸水（B），流速：0.3 mL/min；柱溫40℃，進(jìn)樣量2 μL，分析時(shí)間為3.50 min。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 色譜條件梯度洗脫程序表

2.2 質(zhì)譜條件 Waters Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜，ESI負(fù)離子模式，MRM掃描方式。參數(shù)設(shè)置：毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V，氮?dú)鈮毫? psi，脫溶劑氣溫度400℃，脫溶劑氣流速800 L/h，錐孔氣流速150 L/h，碰撞氣流速0.15 mL/min?；衔颩RM方法參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 次黃嘌呤與內(nèi)標(biāo)的MRM方法參數(shù)

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取次黃嘌呤適量，加甲醇制成100 μg/mL的次黃嘌呤儲(chǔ)備液；另稱取內(nèi)標(biāo)6-巰基嘌呤適量，少量甲醇溶解后用甲醇-水（含0.2%甲酸）（2∶8） 配制成 125 μg/mL 的 6-巰基嘌呤儲(chǔ)備液。用甲醇-水（2∶8，含0.2%甲酸）稀釋上述儲(chǔ)備液，制得含次黃嘌呤系列濃度 500、400、300、200、100 ng/mL的混合對(duì)照品溶液（含內(nèi)標(biāo)250 ng/mL）。2.3.2 供試品溶液制備 精密移取100 μL疏血通注射液和100 μL濃度為125 μg/mL的6-巰基嘌呤溶液，加于已活化的C18固相萃取小柱上，用300 μL水洗除雜，再用 1.00 mL 甲醇-水（2∶8，含 0.2%甲酸）洗脫，取洗脫液 100 μL 用甲醇-水（2∶8，含 0.2%甲酸）稀釋 10倍，搖勻，再取 200 μL用甲醇-水（2∶8，含0.2%甲酸）稀釋5倍，混勻，即得。

2.3.3 陰性對(duì)照液制備 取1 mL疏血通注射液，加黃嘌呤氧化酶37℃水浴溫孵2h，精密移取100μL經(jīng)酶促反應(yīng)后的疏血通注射液，加于C18固相萃取小柱上，其余按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，制成不含次黃嘌呤的陰性對(duì)照液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取陰性對(duì)照液、對(duì)照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，次黃嘌呤、6-巰基嘌呤色譜峰形良好，測(cè)定無(wú)干擾，次黃嘌呤保留時(shí)間為1.02 min，6-巰基嘌呤保留時(shí)間為1.22 min，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 疏血通注射液中次黃嘌呤及內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 吸取“2.3.1”項(xiàng)下系列濃度混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣2 μL測(cè)定，以次黃嘌呤質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=4.299×10-3X+9.246×10-3，r=0.999，表明次黃嘌呤在0.1～0.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品混合溶液2 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得次黃嘌呤與內(nèi)標(biāo)峰面積比值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.54%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密移取同一批號(hào)的疏血通注射液 100 μL，按“2.3.2”項(xiàng)制備供試品溶液，平行6份，進(jìn)樣測(cè)定，RSD為0.86%，表明樣品重現(xiàn)性良好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 室溫下，精密吸取同一供試品溶液 2 μL，分別在 0、2、4、6、8、12、24、48 h 進(jìn)樣，測(cè)次黃嘌呤與內(nèi)標(biāo)峰面積比值，RSD為0.84%。結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密移取同一批號(hào)已知含量的疏血通注射液6份，每份50 μL，精密加入濃度為 200 ng/mL 的對(duì)照品溶液 28 μL，按“2.3.2”項(xiàng)下處理與測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 次黃嘌呤加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.10 樣品濃度測(cè)定 分別精密移取各批號(hào)疏血通注射液 100 μL，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算次黃嘌呤濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈-水和甲醇-水等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用乙腈-水或乙腈-水（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相時(shí)，次黃嘌呤峰形尖而細(xì)，但主峰后出現(xiàn)一個(gè)小的裂分峰；當(dāng)使用甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，次黃嘌呤峰形較寬，且裂分為兩個(gè)大小相當(dāng)?shù)碾p峰，但若將水相改為0.1%甲酸水時(shí)，即以甲醇-水（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相，峰形對(duì)稱尖銳且未出現(xiàn)裂分，響應(yīng)較高。當(dāng)以甲醇-水（含0.2%甲酸）為流動(dòng)相時(shí)，其峰形和響應(yīng)與甲醇-水（含0.1%甲酸）相當(dāng)，考慮到色譜柱對(duì)酸的耐受程度，實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇-水（含0.1%甲酸）作為流動(dòng)相。

表4 疏血通注射液中次黃嘌呤濃度測(cè)定結(jié)果

3.2 稀釋溶劑的選擇 在供試品和對(duì)照品溶液制備過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)終溶液如果所含甲醇比例較高，會(huì)因與流動(dòng)相不匹配而產(chǎn)生強(qiáng)溶劑效應(yīng)，導(dǎo)致色譜峰形的畸變；反之，如果采用純水稀釋系列溶液，則會(huì)因?yàn)閮?nèi)標(biāo)在水中的溶解度低而析出形成渾濁液體。實(shí)驗(yàn)考察比較了甲醇-水系統(tǒng)（水相不含，或含有0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸） 不同比例 5∶5、4∶6、3∶7 和2∶8作為稀釋劑時(shí)，次黃嘌呤和內(nèi)標(biāo)6-巰基嘌呤的峰形和響應(yīng)，結(jié)果表明當(dāng)以甲醇-水（2∶8，含0.2%甲酸）為稀釋劑時(shí)，二者的響應(yīng)最高且峰形良好。

3.3 離子源的選擇 考察了待測(cè)物在ESI和APCI兩種電離方式下的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)采用APCI電離源，次黃嘌呤和6-巰基嘌呤的響應(yīng)極其微弱，而采用ESI電離源二者的響應(yīng)提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，這可能與次黃嘌呤和6-巰基嘌呤均為極性化合物有關(guān)，更適合選用ESI電離源。

3.4 電離方式的選擇 將次黃嘌呤和6-巰基嘌呤對(duì)照品溶液經(jīng)由蠕動(dòng)泵連續(xù)進(jìn)樣，比較正、負(fù)電離方式下化合物的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)次黃嘌呤和6-巰基嘌呤在負(fù)離子模式下，均可產(chǎn)生響應(yīng)較高且穩(wěn)定的[MH]-離子。因此選擇在負(fù)離子模式下采用MRM掃描方式檢測(cè)。

3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 本文建立的分析方法可方便、準(zhǔn)確測(cè)定疏血通注射液中次黃嘌呤濃度，為其提供技術(shù)支持，較常規(guī)UV檢測(cè)方法可大大縮短分析時(shí)間。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的WS3-548（Z-084）-2005（Z）文件，要求疏血通注射液中含次黃嘌呤不得低于0.05 mg/mL，由表4可見(jiàn)，20個(gè)批次疏血通注射液中次黃嘌呤濃度穩(wěn)定集中在0.117～0.138 mg/mL，即（0.129±0.005）mg/mL（n=20），表明產(chǎn)品質(zhì)量合格、生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，次黃嘌呤可作為疏血通注射液質(zhì)量分析、評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分。

4 結(jié)論

本文所建立的固相萃取LC-MS/MS方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，可用于疏血通注射液中次黃嘌呤濃度測(cè)定。