基于綜合評分法優(yōu)選豬苓最佳炮制方法*

李麗紅，劉麗婷，劉亞男，毛 睿，王 飄，竇志英

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

豬苓為多孔菌科真菌豬苓[Polyporus umbellatus（Pers.）Fries]的干燥菌核[1]，其菌核入藥在中國已有2 000多年的歷史，具有利水滲濕之功效[2]，臨床上主要用于治療小便不利、水腫、泄瀉等癥。其分布較廣，以云南產(chǎn)量最大、陜西所產(chǎn)質(zhì)量為優(yōu)[3]。豬苓的生長發(fā)育一般要經(jīng)過4個(gè)階段，分別是擔(dān)孢子、菌絲體、菌核和子實(shí)體[4]，在這期間豬苓主要依靠蜜環(huán)菌供給其生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)[5]。豬苓的化學(xué)成分較多，其中多糖類成分是豬苓的重要活性成分，具有抗腫瘤、延緩衰老、保肝等作用[6-8]，甾體類成分是主要的利尿成分，此外還有氨基酸類、維生素類及微量無機(jī)元素等[9]。

合理的炮制方法不僅可以保證藥材的質(zhì)量，還能降低成本，提高效率以及減少藥材的損耗[10]。豬苓采收后均需要在產(chǎn)地凈選去除雜質(zhì)后，再采用水處理軟化至內(nèi)外濕度均勻一致[11]，按照一定的規(guī)格切制成飲片，豬苓飲片可直接用于臨床調(diào)配處方或作為供藥制劑的原料。王天媛等[12]采用曬干、陰干、不同溫度烘干共10種加工方法處理豬苓藥材，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同加工方法處理的豬苓藥材性狀差異較小，有效成分含量存在顯著性差異，40、50℃烘干處理時(shí)麥角甾醇和總多糖含量較高。魯文靜等[13]研究結(jié)果表明，50℃烘干法的多糖含量最高，陰干法多糖含量較低；自然曬干及70℃烘干所得麥角甾醇含量較高，而高溫烘干得到的麥角甾醇含量較低。而到目前為止，對豬苓的浸潤方法研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用不同浸泡時(shí)間和不同干燥方法對豬苓藥材進(jìn)行加工處理，以豬苓中麥角甾醇、麥角甾酮、多糖和水溶性浸出物為評價(jià)指標(biāo)，采用綜合評分法優(yōu)選豬苓的最佳炮制方法，為豬苓的炮制工藝及質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；色譜柱為phenomenon-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；UV6100S型紫外分光光度儀（上海美普達(dá)儀器有限公司）；KQ-300B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；FA210電子分析天平（上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司）；FW100高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市科析儀器有限公司）；XMT-921A遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱（天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市英峪高科儀器廠）。

1.2 材料 麥角甾酮對照品（天津藍(lán)天翔宇科技有限公司，批號X27J8L38809）、麥角甾醇對照品（上海生工生物有限公司，批號A600443-0005）、D-無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201707）；蒽酮（天津索羅門生物科技有限公司）；95%乙醇（分析純，天津渤化化學(xué)試劑有限公司）；濃硫酸（天津市化學(xué)試劑供銷公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

豬苓藥材來源于陜西省商洛市丹鳳縣，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為多孔菌科真菌豬苓[Polyporus umbellatus（Pers.）Fries]的干燥菌核，樣品粉碎過4號篩。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 麥角甾醇和麥角甾酮含量測定

2.1.1 色譜條件色譜柱為phenomenon-C18（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（95∶5）；檢測波長麥角甾醇283 nm，麥角甾酮343 nm，體積流量1.0 mL/min；柱溫：30℃。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取麥角甾醇和麥角甾酮對照品適量，加甲醇溶解，得濃度分別為0.400 mg/mL麥角甾醇、0.048 mg/mL麥角甾酮對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 取豬苓樣品粉末（過4號篩）0.5 g，精密稱定，置于100 mL具塞三角瓶中，加入甲醇10 mL，稱質(zhì)量，超聲60 min，放至室溫，加溶劑補(bǔ)足質(zhì)量，混勻，濾過，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。

2.1.4 方法學(xué)考察 線性關(guān)系：精密移取麥角甾醇、麥角甾酮對照品溶液適量，用甲醇稀釋一系列濃度的對照品溶液，麥角甾醇濃度分別為0.400、0.200、0.100、0.050 0、0.025 0、0.0125、0.0 0600、0.003 00 mg/mL，麥角甾酮濃度分別為 0.048 0、0.024 0、0.012 0、0.006 0、0.003 0、0.001 5、0.000 80、0.000 40 mg/mL，進(jìn)樣量20 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程麥角甾醇為Y=34 283 478X+58 072，相關(guān)系數(shù) r=0.999 3，線性范圍：0.003～0.400 mg/mL。麥角甾酮為Y=44 843 619X+13 375，相關(guān)系數(shù) r=0.999 1，線性范圍：0.000 4～0.048 0 mg/mL。

精密度實(shí)驗(yàn)：取“2.1.2”項(xiàng)下混標(biāo)溶液，在色譜條件“2.1.1”項(xiàng)下，連續(xù)進(jìn)樣6針，測定峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示麥角甾醇和麥角甾酮RSD值分別為0.57%、1.04%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件在 0、2、4、8、12、24 h 分別進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果麥角甾醇和麥角甾酮RSD值分別為1.54%，1.95%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：精密稱取同一個(gè)樣品6份，按“2.1.3”提取處理方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測定峰面積，計(jì)算各對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果麥角甾醇和麥角甾酮RSD值分別為0.81%，0.69%，表明重復(fù)性良好。

加樣回收率測定：精密稱取9份已測定的豬苓粉末各約0.25g，分別加入麥角甾醇、麥角甾酮對照品溶液（相當(dāng)于豬苓飲片中麥角甾醇、麥角甾酮的80%，100%，120%的含量），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測定峰面積，計(jì)算回收率及RSD值。結(jié)果麥角甾醇、麥角甾酮的加樣回收率分別為99.93%、99.86%，RSD值分別為1.51%、1.78%。

2.2 多糖含量測定

2.2.1 硫酸-蒽酮試劑的配制及檢測條件 取蒽酮0.2 g溶解于100 mL濃硫酸中，即得，當(dāng)天配制使用。取1 mL多糖供試液至25 mL具塞試管中，冰水浴中緩慢滴入2.5 mL硫酸蒽酮，搖勻，置于沸水浴中加熱10 min，取出，冰水浴冷卻后，以蒸餾水做空白對照，626 nm下測得吸光度，并根據(jù)吸光度計(jì)算豬苓多糖含量。

2.2.2 對照品溶液的制備 取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（105℃干燥至恒重）100 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得1 mg/mL的葡萄糖對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取豬苓粉末約1.0 g，精密稱定，置于250 mL錐形瓶中，向其加入80 mL 95%乙醇超聲20 min，過濾，棄去濾液，回收濾渣，濾紙及濾渣揮干溶劑后放錐形瓶中，加水80 mL，超聲提取20 min，過濾得濾液，轉(zhuǎn)移定容至100 mL容量瓶中，取1 mL溶液稀釋至10 mL容量瓶中即得多糖供試液。

2.2.4 方法學(xué)考察 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取上述葡萄糖對照品儲備液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，分別取1 mL置10 mL具塞試管中，各加入硫酸蒽酮溶液2.5 mL，混勻，置沸水浴中加熱10 min，冰水浴中冷卻降溫，另取蒸餾水1.0 mL同上平行操作，作為空白溶液，在626 nm下測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=9.599 1X+0.069 3，r=0.998 4，線性范圍 0～1.013 mg/mL。

精密度實(shí)驗(yàn)RSD值為0.290%，表明儀器精密度良好；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD值為1.83%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD值為1.98%，表明樣品在2 h內(nèi)穩(wěn)定；加樣回收率實(shí)驗(yàn)平均加樣回收率為99.96%，RSD值為1.89%。

2.3 浸出物含量測定 水溶性浸出物測定：按2015年版《中華人民共和國藥典》第四部附錄2201水溶性浸出物測定方法（冷浸法）對樣品進(jìn)行測定，計(jì)算水溶性浸出物的量。

3 炮制工藝研究

3.1 優(yōu)選最佳浸泡時(shí)間

3.1.1 最大吸水量考察 取相同規(guī)格的豬苓藥材100 g，平行 3份，各加水 500 mL，浸泡 24 h，考察最大吸水量。結(jié)果24 h內(nèi)最大吸水量為（130.00±2.00）mL。

3.1.2 吸水速率考察 取相同規(guī)格的豬苓藥材100g，平行 3 份，各加水 500 mL，分別在浸泡 2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)測定其吸水量，并計(jì)算吸水速率。結(jié)果見表1。

表1 不同浸泡時(shí)間吸水速率

吸水速率（mL/h）35.33±2.57 7.17±0.58 4.83±0.14 3.67±0.26 3.67±0.89 3.00±0.32 1.94±0.29浸泡時(shí)間（h） n 0～2 3 2～4 3 4～6 3 6～8 3 8～10 3 10～12 3 12～24 3

由表1可知，隨著浸泡時(shí)間的延長，豬苓藥材吸水速率逐漸減慢，0～2h吸水速率最快，為35.33mL/h，8 h前后吸水速率基本保持不變，說明豬苓藥材在浸泡8 h基本達(dá)到飽和狀態(tài)，且藥材已達(dá)到潤軟可切的程度。

3.1.3 浸泡時(shí)間考察 取同一產(chǎn)地同一規(guī)格凈制后的豬苓藥材各100 g，分別加等量的水并用濕紗布覆蓋于表面，分別浸泡 2、4、6、8、10、12、24 h，每組平行3份，切片，干燥。測定不同浸泡時(shí)間下豬苓中麥角甾醇、麥角甾酮、多糖和水溶性浸出物的含量，測定結(jié)果見表2。

3.1.4 采用綜合評分法優(yōu)選豬苓藥材最佳浸泡時(shí)間 采用綜合評分法來選擇最佳浸泡時(shí)間，隸屬度函數(shù)計(jì)算：F（x）=（x-x最小值）/（x最大值-x最小值）；綜合分?jǐn)?shù)=多糖隸屬度×50%+麥角甾醇隸屬度×30%+麥角甾酮隸屬度×10%+水溶性浸出物隸屬度×10%。結(jié)果見表2。

由表2可知，豬苓藥材在浸泡2～8 h時(shí)間段內(nèi)，麥角甾醇和麥角甾酮含量均有所增加，浸泡8 h時(shí)二者含量均達(dá)到最大值。其中浸泡2 h與4 h、4 h與6 h麥角甾醇無顯著性差異（P＞0.05），浸泡8 h與浸泡時(shí)間＜8 h各組之間均存在極顯著性差異（P＜0.01）。浸泡8 h之后，兩者含量又有所降低。而多糖和水溶性浸出物含量隨著浸泡時(shí)間的延長，都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，浸泡10 h達(dá)到最大值，其中，浸泡2～6 h之間各組均無顯著性差異（P＞0.05），浸泡8 h與浸泡時(shí)間＜8 h各組之間有顯著性差異。

由綜合評分結(jié)果可知，浸泡8 h綜合評分最高，其分值達(dá)到0.796，浸泡時(shí)間過短和過長綜合評分值都較低，浸泡24 h綜合評分分值僅為0.254，說明浸泡24 h有效成分損失較大。由此可得出豬苓藥材不宜浸泡過長時(shí)間，最佳水浸泡時(shí)間為8 h。

3.2 干燥方法的優(yōu)選 取同一批豬苓藥材按上述優(yōu)選的最佳浸泡時(shí)間浸泡8 h后，切片，分別采用烘干法（50℃、60℃、70℃、80℃烘干）、自然晾干法、冷凍干燥法、微波干燥法進(jìn)行干燥，每組平行3份。

3.2.1 不同干燥方法對各指標(biāo)含量的影響 測定不同干燥方法豬苓中麥角甾醇、麥角甾酮、多糖、水溶性浸出物的含量，研究不同干燥方法對其含量的影響。測定結(jié)果見表3。

表2 優(yōu)選豬苓藥材最佳浸泡時(shí)間的綜合評分表

表3 優(yōu)選豬苓最佳干燥方法的綜合評分表

3.2.2 采用綜合評分法優(yōu)選豬苓最佳干燥方法 以麥角甾醇、麥角甾酮為指標(biāo)，最佳干燥方法為自然晾干，其次是50℃烘干；以多糖為指標(biāo)，最佳干燥方法為80℃烘干；以水溶性浸出物為指標(biāo)，最佳干燥方法為60℃烘干。說明不同干燥方法對豬苓中的各成分含量有很大的影響，因此采用綜合評分法優(yōu)選最佳干燥方法。隸屬度函數(shù)計(jì)算公式見“3.1.4”，計(jì)算結(jié)果見表3。

結(jié)果表明，不同干燥方法對各成分含量有顯著影響，自然晾干下麥角甾醇、麥角甾酮含量最高，其次為50℃烘干。不同干燥方法中麥角甾醇含量大小順序?yàn)椋鹤匀涣栏桑?0℃烘干>70℃烘干>60℃烘干＞冷凍干燥>80℃烘干>微波干燥，其中，50℃烘干麥角甾醇含量顯著高于80℃烘干，而與自然晾干無顯著性差異（P>0.05）。麥角甾酮含量大小順序?yàn)椋鹤匀涣栏桑?0℃烘干>60℃烘干>70℃烘干＞微波干燥>冷凍干燥>80℃烘干，各組之間均有顯著性差異（P＜0.05）。多糖含量大小順序?yàn)椋?0℃烘干>冷凍干燥＞自然晾干＞70℃烘干＞微波干燥>50℃烘干＞60℃烘干。其中，50℃烘干與60℃、70℃烘干無顯著性差異，與80℃烘干有顯著性差異（P＜0.05）。浸出物含量大小順序?yàn)椋?0℃烘干＞80℃烘干＞50℃烘干＞70℃烘干＞冷凍干燥＞微波干燥>自然晾干。其中，60℃烘干與各組之間均有顯著性差異。

由綜合評分結(jié)果可知，干燥方法中自然晾干的綜合評分最高，其分值達(dá)0.745，其次是冷凍干燥，其分值為0.674，50℃烘干，其分值為0.631，評分最低的為微波干燥，分值為0.242。由于自然晾干時(shí)間較長，且受天氣影響；冷凍干燥成本較高，操作繁瑣，且耗時(shí)長，不能廣泛采用。所以，選擇50℃烘干作為豬苓干燥加工方法較為合適，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。由此表明，綜合評分法是一種比較合理的評估藥材質(zhì)量的一種簡單可靠的方法。

4 討論

中藥材的水處理是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，掌握正確的水處理方法，可以提高藥材有效成分的利用率[14-16]。但是目前仍存在著中藥材浸潤工藝不規(guī)范和不合理的操作，特別是將藥材長時(shí)間浸泡在水中，會致使其有效成分大量流失，甚則發(fā)霉腐爛，嚴(yán)重影響藥材飲片或中成藥的內(nèi)在質(zhì)量甚或產(chǎn)生毒性物質(zhì)。2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，豬苓藥材的炮制方法為洗凈，浸泡，潤透，切片，但對于具體的浸泡時(shí)間沒有規(guī)定，各省市炮制規(guī)范中對豬苓藥材的浸潤方法也不盡相同，而且到目前為止，有關(guān)豬苓浸潤及干燥工藝的研究較少，因此本研究考察了豬苓藥材浸泡時(shí)間及干燥方法，通過綜合評分法優(yōu)選最佳浸泡時(shí)間及干燥方法。

結(jié)果表明，浸泡8 h綜合評分分值最高，達(dá)到0.796，且藥材軟化程度較好，切出的飲片較美觀，同時(shí)有效成分含量較高。干燥方法中，自然晾干法綜合評分最高，達(dá)0.745，但對于大規(guī)模集中生產(chǎn)來說，這種方法既不能提高生產(chǎn)效率又不易達(dá)到藥材的衛(wèi)生要求，且受天氣影響比較大。而烘干法時(shí)間短，且溫度好控制，適合大規(guī)模生產(chǎn)。烘干法中50℃烘干綜合評分值最大，因此綜合考慮采用50℃烘干較為合適。該干燥方法的優(yōu)選為豬苓的大規(guī)模生產(chǎn)及質(zhì)量控制提供參考。