熱熔擠出技術(shù)制備小檗紅堿固體分散體及其體外評價*

馬 麗 ，李新悅 ，梁春霞 ，張 兵 ，劉靜靜 ，祁東利 ，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 301617）

小檗紅堿（Berberrubine）是一類異喹啉類生物堿[1]，主要存在于黃連、黃柏等中藥[2]。但因其含量較低，一直未能引起廣泛關(guān)注。近年來，隨著對小檗堿作用機(jī)制的深入研究，作為小檗堿體內(nèi)重要代謝產(chǎn)物之一的小檗紅堿也隨之引起了科研工作者的重視。研究表明，小檗紅堿具有抗炎、抑菌、抗腫瘤和降血糖等藥理活性，但因其具有一定腎毒性及較低的生物利用度，從而嚴(yán)重制約了小檗紅堿的臨床應(yīng)用[3-4]。

圖1 小檗紅堿化學(xué)結(jié)構(gòu)式

據(jù)報道，固體分散體（SD）不但可以有效地提高難溶性藥物的溶解度、增加藥物穩(wěn)定性及提高生物利用度[5]，而且可以通過選擇相應(yīng)的載體達(dá)到緩、控釋作用[6-7]。近年來，SD作為速釋、緩釋及局部給藥制劑的中間體受到廣泛的關(guān)注。熱熔擠出（HME）技術(shù)是制備固體分散體的方法之一，該法所制備的固體分散體具有密度高和孔隙率低的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于緩、控釋給藥系統(tǒng)的制備[8]。與溶劑法、溶劑-熔融法、熔融法、超臨界CO2萃取法和噴霧（冷凍）干燥法等傳統(tǒng)方法相比較具有操作方便、工藝簡潔、不使用有機(jī)溶劑、自動化程度高及適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[9]。

本研究以Soluplus?為藥物載體，采用HME技術(shù)制備小檗紅堿固體分散體。采用差示掃描量熱分析儀、粉末X射線衍射儀、掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜儀對制備的小檗紅堿固體分散體進(jìn)行表征，并考察擠出物在不同介質(zhì)中的溶解度和體外溶出度，為小檗紅堿的相關(guān)制劑研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 儀器 高效液相色譜儀（Agilent 1260，安捷倫科技有限公司）；十萬分之一天平（XP 205，Mettler Toledo）；超純水系統(tǒng)（Milli-Q，美國 Millipore公司）；HME雙螺桿熱熔擠出機(jī)（安拓思納米技術(shù)有限公司）；差示掃描量熱儀（Jade DSC，美國Perkin Elmer公司）；掃描電子顯微鏡（JSM-7500F，日本日立公司）；透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀（TK-20B，上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；粉末X射線衍射儀（D/Max-2500PC，日本理學(xué)股份公司）；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet 6700，美國賽默飛世爾科技有限公司）；全自動智能溶出儀（DT-820，德國ERWEKA公司）。

1.2 藥品與試劑 小檗紅堿對照品（天津中新藥業(yè)團(tuán)股份有限公司，純度97%）；小檗紅堿（由天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院邱峰教授課題組提供，純度＞80%）；Soluplus?（德國巴斯夫股份公司）；乙腈（Fisher Chemical）；甲酸（東京化成工業(yè)株式會社）；甲醇（天津市康科德科技有限公司）；鹽酸（利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；結(jié)晶乙酸鈉（天津市風(fēng)船科技有限公司）；磷酸二氫鉀（天津市風(fēng)船科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 小檗紅堿分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 采用Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；以 0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，0～10 min，95%～10%A；10～15 min，10%～95%A；15～20 min，95%A；檢測波長340 nm；流速1 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。HPLC色譜圖見圖1，溶劑與Soluplus?均對小檗紅堿含量測定無干擾。

圖2 測定甲醇中小檗紅堿含量的專屬性圖譜

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取小檗紅堿對照品適量，加甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，作為儲備液，備用。用甲醇將儲備液分別稀釋成每1 mL含小 檗 紅 堿 2.08、4.16、20.80、41.60、83.20、104.00、166.40、208.00 μg 的溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件測定小檗紅堿的峰面積。以樣品色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程Y＝30.016X-54.147，r＝0.999 7，結(jié)果表明小檗紅堿在2.08～208.00 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取2.1.2項(xiàng)下低（2.08μg/mL）、中（20.80 μg/mL）、高（166.40 μg/mL）3 種濃度的小檗紅堿對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，考察精密度。結(jié)果低、中、高3種濃度精密度RSD分別是0.14%、0.06%、1.86%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別取2.1.2項(xiàng)下低（2.08μg/mL）、中（20.80 μg/mL）、高（166.40 μg/mL）3 種濃度的小檗紅堿對照品溶液，于 0、2、4、6、8、12、24 h 測定，評價藥物穩(wěn)定性。結(jié)果RSD分別是1.04%、0.43%、2.60%，表明對照品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 回收率實(shí)驗(yàn) 分別取2.1.2項(xiàng)下低（2.08μg/mL）、中（20.80 μg/mL）、高（166.40 μg/mL）3 種濃度的小檗紅堿對照品溶液，按藥輔比為1∶6（小檗紅堿∶Soluplus?=1∶6）加入 Soluplus?，考察回收率。平均回收率為99.46%，RSD為0.62%。

2.2 小檗紅堿固體分散體的制備 分別稱取小檗紅堿10 g，Soluplus?30 g過篩混合均勻，得到物理混合物，待儀器升至設(shè)定溫度后，將物理混合物投入加料斗中擠出，室溫放置24 h，粉碎并過60目篩，制得小檗紅堿固體分散體A，備用。另取小檗紅堿10 g，Soluplus?60 g，同法制備小檗紅堿固體分散體B，備用。

2.3 固體分散體表征

2.3.1 掃描電子顯微鏡觀察 將小檗紅堿、Soluplus?、物理混合物、小檗紅堿固體分散體A和小檗紅堿固體分散體B取適量均勻撒在貼有導(dǎo)電膠帶的樣品座上，噴金，真空干燥后置SEM下，于不同倍率下觀察所得粒子的表面形態(tài)。

由圖3可知，小檗紅堿（A）以針狀結(jié)晶體存在，Soluplus?（B）為橢圓形塊狀晶體結(jié)構(gòu)，物理混合物（C）中兩種形態(tài)的晶體均存在，而固體分散體中無獨(dú)立存在的小檗紅堿針狀型晶體，成無規(guī)則形態(tài)，凝集成塊，其藥物可能以非晶形態(tài)吸附在載體表面。2.3.2 差式掃描量熱分析 精密稱取小檗紅堿、Soluplus?、物理混合物、小檗紅堿固體分散體A和小檗紅堿固體分散體B 5～10 mg置鋁制樣品盤中，壓制后放入DSC的樣品室中，并放置參比盤。保持干燥的氮?dú)猸h(huán)境（30 mL/min），待系統(tǒng)穩(wěn)定后，以10℃/min的速度從30℃升溫到350℃，記錄樣品的熱力學(xué)曲線，見圖5。

圖3 小檗紅堿（A），載體Soluplus?（B），物理混合物（C），小檗紅堿固體分散體A（D）與小檗紅堿固體分散體B（E）的掃描電鏡圖

圖4 小檗紅堿（A），載體 Soluplus?（B），物理混合物（C），小檗紅堿固體分散體A（D）與小檗紅堿固體分散體B（E）的DSC圖譜

圖5 小檗紅堿（A），載體 Soluplus?（B），物理混合物（C），小檗紅堿固體分散體A（D）與小檗紅堿固體分散體B（E）的X射線衍射圖譜

圖4 所示，小檗紅堿在300℃右有一明顯的晶體吸熱峰，Soluplus?在70℃和320℃左右有一明顯的放熱峰，物理混合物中放熱峰明顯，小檗紅堿固體分散體中小檗紅堿的吸熱峰消失，表明小檗紅堿以非晶體形態(tài)分散于載體中。

2.3.3 粉末X射線衍射分析 以銅-Kα射線為輻射源，輻射強(qiáng)度設(shè)置為40 kV和100 mA，掃描步長0.02°，掃描范圍 5°～80°，掃描速度 5 °/min，對小檗紅堿、Soluplus?、物理混合物、小檗紅堿固體分散體A和小檗紅堿固體分散體B進(jìn)行X射線衍射分析。

圖5顯示，小檗紅堿的峰值為7.72°、8.64°、12.2°、13.28°、13.88°、15.04°、22.04°、22.64°、25.44°和26.32°，說明其為晶體結(jié)構(gòu)，因而溶解度較低。Soluplus?的峰值為9.04°，在物理混合物中小檗紅堿的衍射峰變得微弱，在固體分散體B中小檗紅堿的主峰更微弱甚至部分峰消失，表明小檗紅堿以非晶體形態(tài)分散于載體中。

2.3.4 傅里葉變換紅外光譜分析 分別取小檗紅堿、Soluplus?、物理混合物、小檗紅堿固體分散體A和小檗紅堿固體分散體B適量，與干燥的KBr均勻混合壓片置于紅外光譜儀中，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描，得到相應(yīng)紅外譜圖。

圖6顯示，小檗紅堿的C=O伸縮振動峰在1 633.41 cm-1、N-H 彎曲振動峰在 1 614.13 cm-1；Soluplus?的C=O伸縮振動峰在1 637.27 cm-1；物理混合物中藥物的C=O和N-H峰與小檗紅堿的位置一樣，而固體分散體的圖譜，小檗紅堿的N-H峰消失，且圖譜中Soluplus?的特征峰明顯，說明藥物與載體之間可能形成氫鍵，藥物是均勻地分散在載體中。

2.4 溶解度的測定 分別取過量的小檗紅堿、小檗紅堿固體分散體A、小檗紅堿固體分散體B置于西林瓶中，分別加入10 mL的去離子水、0.1 mol/L的稀鹽酸溶液、pH 4.5的醋酸-醋酸鈉溶液及pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，用保鮮膜封口，放入透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀中。在（37.0±0.5）℃、100 r/min條件下攪拌24 h，攪拌結(jié)束后靜置2 h。取適量上清液過0.45 μm的微孔濾膜，續(xù)濾液以相應(yīng)溶媒稀釋至適宜濃度后進(jìn)行測定，并計(jì)算小檗紅堿的飽和溶解度，結(jié)果見表1。

小檗紅堿固體分散體較小檗紅堿在4種介質(zhì)中的溶解度均有所提高，特別是在pH 6.8的磷酸緩沖液中，小檗紅堿固體分散體A的溶解度較小檗紅堿提高了1.90倍，小檗紅堿固體分散體B的溶解度較小檗紅堿提高了2.59倍。

圖6 小檗紅堿（A），載體Soluplus?（B），物理混合物（C），小檗紅堿固體分散體A（D）與小檗紅堿固體分散體B（E）的傅里葉變換紅外光譜圖譜

表1 小檗紅堿在不同介質(zhì)中的飽和溶解度mg/mL

表1 小檗紅堿在不同介質(zhì)中的飽和溶解度mg/mL

注：與小檗紅堿組相比，**P＜0.01。

小檗紅堿 固體分散體A 固體分散體B 8.35±0.52 9.11±0.01 10.78±0.08**9.75±0.06 10.24±0.03** 12.64±0.07**4.90±0.05 8.54±0.23** 9.36±0.02**2.21±0.20 4.19±0.04** 5.73±0.59**組別pH 1.0 pH 4.5去離子水pH 6.8 n 3 3 3 3

2.5 溶出度的測定 分別精密稱取適量小檗紅堿、小檗紅堿固體分散體A、小檗紅堿固體分散體B及其物理混合物（約相當(dāng)于小檗紅堿15 mg）于硬殼膠囊中，按《中華人民共和國藥典》2015版第4部制劑通則項(xiàng)下0931溶出度與釋放度測定第一法測定。以0.1 mol/L的稀鹽酸900 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為（37.00±0.5）℃，依法操作。在 5、10、15、30、45、60、120、240、360、480、720 min 時 取樣，每次取樣5 mL（即時補(bǔ)充同溫溶出介質(zhì)5 mL），經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后，按2.1.1項(xiàng)下方法測定續(xù)濾液，并計(jì)算各時間點(diǎn)的藥物累積溶出度。

圖7 小檗紅堿，物理混合物，固體分散體A及固體分散體B在0.1 mol/L的鹽酸中的累計(jì)溶出度（n=3，x±s）

在0.1 mol/L稀鹽酸中，小檗紅堿在短時間內(nèi)釋放速度迅速，在15 min左后累計(jì)溶出度達(dá)到90%，不利于臨床應(yīng)用[10]。小檗紅堿與Soluplus?的物理混合物在120 min內(nèi)累積溶出度達(dá)到90%，固體分散體A在240 min累積溶出度接近90%，固體分散體B在480 min累積溶出度接近90%。結(jié)果顯示小檗紅堿固體分散體延緩了小檗紅堿的釋放，有利于維持血藥濃度平衡，可降低給藥頻率，減輕腎臟負(fù)擔(dān)。

3 討論

熱熔擠出過程中，適宜的載體濃度、黏度與取代基不僅會影響藥物的釋放[11]，而且可以有效防止藥物“再結(jié)晶”，從而增加其穩(wěn)定性。Soluplus?是一種專門用于熱熔擠出技術(shù)的兩親性高分子聚合載體，是聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物，該載體玻璃化轉(zhuǎn)變溫度低，有很好的抑晶作用，主要用于提高難溶性藥物溶解性和增加藥物穩(wěn)定性[12-13]。

通過熱熔擠出技術(shù)，以Soluplus?作為載體制備了載體與藥物質(zhì)量比為1∶3和1∶6的A、B兩種固體分散體。SEM、DSC、XRD和FT-IR理化表征的結(jié)果顯示，小檗紅堿固體分散體中小檗紅堿以非晶態(tài)分散于載體Soluplus?中。溶解度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小檗紅堿固體分散體B較原料藥溶解度提高2.59倍，差異具有顯著性。體外釋放度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所制備的小檗紅堿固體分散體B具有一定的緩釋效果。

本實(shí)驗(yàn)制備的小檗紅堿固體分散體能顯著提高藥物溶解度，且能延緩體外釋放行為。推測該固體分散體可提高小檗紅堿口服生物利用度，可為小檗紅堿的應(yīng)用與相關(guān)制劑研究提供參考。