8個(gè)廠家74批次丹參片中脂溶性成分丹參酮ⅡＡ的含量比較研究

秦學(xué)玲　蔣新平　馬娜　楊璐璐　秦興衛(wèi)

【摘 要】 目的：比較8個(gè)廠家74批次丹參片中脂溶性成分丹參酮ⅡA的含量差異。方法：采用RP-HPLC法，色譜柱：Aglient C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱;流動(dòng)相：甲醇-水（75∶25）; 柱溫30℃;流速為1mL·min.-1;檢測波長270nm，選取本次國家評價(jià)性抽驗(yàn)的8個(gè)廠家74批次丹參片樣品對其進(jìn)行含量測定，并采用頻數(shù)分布圖和箱形圖對其含量測定結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果：丹參酮ⅡA進(jìn)樣量在0.00885～0.221 μg范圍內(nèi)與色譜峰峰面積呈良好線性關(guān)系;平均回收率（n=6）為99.6%，RSD為0.02%; 8個(gè)廠家74批次丹參片中脂溶性成分丹參酮ⅡA的含量差異較大。結(jié)論：所建立的方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證簡便快捷、準(zhǔn)確、重復(fù)性好 ，為丹參片的質(zhì)量控制提供參考依據(jù);不同廠家生產(chǎn)的和同一廠家生產(chǎn)的不同批次之間含量差異均較大，有待于進(jìn)一步提高丹參原藥材質(zhì)量和規(guī)范丹參片生產(chǎn)工藝;采用的頻數(shù)分布圖和箱形圖對測定結(jié)果的分析直觀、準(zhǔn)確可靠。

【關(guān)鍵詞】 丹參片;脂溶性成分;丹參酮ⅡA;高效液相色譜法;頻數(shù)分布圖;箱形圖

【中圖分類號】R286 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）15-0031-04

丹參片是《中國藥典）一部收載的品種，具有活血化瘀的作用， 用于瘀血閉阻所致的胸痹，癥見胸部疼痛、痛處固定、舌質(zhì)紫暗;冠心病心絞痛見上述證候者[1-5]。軍事訓(xùn)練傷急性損傷后期或軟組織慢性損傷，有瘀斑或瘀血并伴腫痛，口服丹參片有活血化瘀及緩解腫痛的作用。研究表明，丹參中的活性成分主要有脂溶性的丹參酮類和水溶性的酚酸類成分[6-14]。丹參片在中國藥典2015年版一部中的含量測定項(xiàng)為HPLC法測定丹參中丹酚酸B的含量，而丹參片的另一類主要成分即脂溶性成分未作相應(yīng)的含量測定控制[1]。而且臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，不同廠家生產(chǎn)的丹參片質(zhì)量和療效存在很大差異，為此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HPLC法對本次國家評價(jià)性抽驗(yàn)的8個(gè)不同廠家74批次丹參片樣品，在檢測波長為270nm下對脂溶性成分丹參酮ⅡA的含量進(jìn)行了測定研究。通過方法學(xué)驗(yàn)證，該方法操作簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為丹參片的整體質(zhì)量控制監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù);并采用頻數(shù)分布圖和箱形圖對其含量進(jìn)行比較分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜（HPLC）島津LC20AT系統(tǒng);天平：Mettler AE240電子天平（瑞士梅特勒公司）;對照品丹參酮ⅡA（批號：110766-201520標(biāo)示量為98.9%）購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇為色譜級（美國Merck公司），水為重蒸水（自制），其它試劑均為國產(chǎn)分析純;丹參片為2015年國家評價(jià)性抽驗(yàn)抽取的樣品。

2 溶液制備

2.1 對照品溶液 精密稱取丹參酮ⅡA對照品22.36mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解

并稀釋至刻度，再精密量取1mL，置100mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1mL含22.11μg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液 取本品10片，糖衣片除去糖衣，研細(xì)，取約1g，精密稱定，置具塞錐形

瓶中，精密加入甲醇溶液50mL，稱定重量，超聲處理30min（功率：280w;頻率：40 kHz），

放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 陰性樣品溶液 取缺丹參的丹參片陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)下的方法，制得陰性樣品溶液，即得。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)? 色譜柱：Aglient C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱;流動(dòng)相：甲醇-水（75∶25）; 柱溫30℃;流速為1mL·min.-1;檢測波長270nm。進(jìn)樣量：10μL。在此色譜條件下，丹參酮ⅡA對照品，樣品和缺丹參的陰性樣品的分離色譜圖如圖1所示。

3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取2.1項(xiàng)下配制的對照品溶液 1mL、1mL、1mL、2mL、3mL、20mL至25mL、10mL、5mL、5mL、5mL、25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得線性關(guān)系各濃度對照品溶液。精密吸取上述各濃度對照品溶液10μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到丹參酮ⅡA的回歸方程為： y=3813.8x+36.125（R.2=1.0000）線性范圍為0.00885～0.221μg。結(jié)果表明線性關(guān)系良好。

3.3 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液③，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，測定峰面積值，結(jié)果丹參酮ⅡA峰面積的RSD為0.01%。表明儀器精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于0、2、4、12、16和24h進(jìn)樣10μL進(jìn)行測定，結(jié)果丹參酮ⅡA峰面積的RSD為0.01%。表明供試品溶液中的待測成分丹參酮ⅡA在室溫放置24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丹參片樣品（批號：150305），按“2.2”項(xiàng)下的方法平行制得6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10μL進(jìn)行測定并計(jì)算，結(jié)果平均含量值為1.037 mg·g.-1， RSD為和0.02%。表明其重復(fù)性良好。

3.6 回收率試驗(yàn) 取丹參片樣品（批號：150305）適量，精密稱取6份，每份約0.5g， 置具塞錐形瓶中，精密加入丹參酮ⅡA對照品溶液⑦ （質(zhì)量濃度為176.91μg·mL.-1）3mL，再精密加入甲醇溶液50mL，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10μL進(jìn)行測定。結(jié)果丹參酮ⅡA平均回收率（n=6）為99.6%，RSD為0.02%。表明該方法的回收率良好。

3.7 樣品的測定 取8個(gè)廠家74批次丹參片樣品，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10μL進(jìn)行測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表1和圖2。

3.8 結(jié)果 由表1和圖2可以看出，8個(gè)廠家74批次丹參片中丹參酮ⅡA含量變化幅度較大，批間差異明顯，最高含量為每片0.6533mg，最低含量為每片0.0484mg，最高者為最低者的13.5倍; B企業(yè)和F企業(yè)樣品中丹參酮ⅡA含量明顯高于其他企業(yè);D企業(yè)和H企業(yè)樣品中丹參酮ⅡA含量居中;A企業(yè)、C企業(yè)E企業(yè)和G企業(yè)樣品中丹參酮ⅡA含量明顯偏低;其中D和H企業(yè)存在明顯的批間差異。

4 討論

4.1 提取溶劑的選擇 分別以甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇、70%甲醇和90%甲醇超聲提取30min。結(jié)果以甲醇提取效率最高，故選擇甲醇為提取溶劑。

4.2 提取方法的選擇 以甲醇為提取溶劑，分別進(jìn)行超聲15、30和60min及加熱回流0.5、1和2h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲提取與加熱回流提取效果相當(dāng)，超聲30min與60min效果相當(dāng)，故提取方法確定為超聲提取30min。

4.3 流動(dòng)相種類的選擇 分別以①甲醇-體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸;②甲醇-體積分?jǐn)?shù)為0.1%的磷酸;③乙腈-體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸;④乙腈-體積分?jǐn)?shù)為0.1%的磷酸;⑤甲醇-水;⑥乙腈-水對供試品溶液進(jìn)行了含量測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用甲醇-水作流動(dòng)相效果最佳。

4.4 檢測波長的選擇 我們參考相關(guān)文獻(xiàn)和中國藥典，選用λ=270nm作為丹參酮ⅡA含量測定的檢測波長。

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（收稿日期：2019-05-09 編輯：程鵬飛）