殺螟丹、螺蟲乙酯和銅鎘二元復合污染的聯(lián)合毒性

殷鴻洋，趙 遠，鄭 義，保 聰，黃新新，丁英杰，蔡 強*

（1.常州大學環(huán)境與安全工程學院，江蘇 常州 213164；2.浙江清華長三角研究院，浙江 嘉興 314006；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300；4.瓦赫寧根大學海洋動物生態(tài)組，荷蘭 6708WD；5.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海200135）

隨著工農(nóng)業(yè)發(fā)展，重金屬的排放和農(nóng)藥的使用對環(huán)境和生物造成了嚴重的影響。原環(huán)境保護部和原國土資源部發(fā)布的全國土壤污染狀況調(diào)查公報顯示，鎘、銅污染物點位超標率分別為7.0%和2.1%[1]。雖然銅是生命體生長發(fā)育所必需的微量元素，但是過量的銅會對動植物體產(chǎn)生毒害作用，鎘則有明顯的毒害作用[2]。銅、鎘等重金屬污染一旦進入環(huán)境和生物體內(nèi)則難以降解[3-4]。我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥的使用量居世界第一，每年達50～60萬t，最終進入環(huán)境的農(nóng)藥達使用量的80%～90%[5]。雖然可以使用中低毒的農(nóng)藥代替劇毒、高殘留農(nóng)藥，但是低毒農(nóng)藥對環(huán)境中的生物仍存在毒性影響。在我國，中低毒農(nóng)藥殺螟丹和螺蟲乙酯都是最常用的殺蟲劑[6-7]，用于農(nóng)業(yè)害蟲防治的殺螟丹對魚類胚胎毒性較高[8]，螺蟲乙酯則會對水生生物產(chǎn)生不利影響[9-12]。

生態(tài)環(huán)境中常出現(xiàn)混合污染的情況，其中農(nóng)業(yè)活動常造成重金屬和農(nóng)藥各組分之間的相互影響，并共同作用于生物體產(chǎn)生聯(lián)合毒性。例如草甘膦常與波爾多液共同使用以控制植物的霉病，這可能導致草甘膦和銅的復合污染[13]。耕種過程中過量使用磷肥會造成鎘污染[14]，超量加入重金屬到飼料中也會使動物糞便和秸稈混合的有機肥料存在重金屬污染[15]。

重金屬與農(nóng)藥的復合污染在環(huán)境中普遍存在，銅、鎘與殺螟丹、螺蟲乙酯的復合污染不可避免，雖然已有學者對這4種污染物的單一毒性效應和機理做了研究，但是重金屬與中低毒農(nóng)藥聯(lián)合毒性研究還很少。本試驗采用費氏弧菌為受試生物，研究重金屬銅、鎘與殺螟丹、螺蟲乙酯構成的二元混合體系的聯(lián)合毒性，通過混合毒性指數(shù)法（MTI法）評價其聯(lián)合毒性效應，為重金屬和農(nóng)藥復合污染的生態(tài)風險評估和環(huán)境保護提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

費氏弧菌（Vibrio fischeri）凍干粉，菌株符合國際標準，由浙江清華長三角研究院提供，-20℃避光保存。將胰蛋白胨、酵母膏、甘油、磷酸氫二胺、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉配制成培養(yǎng)液，分裝到50 mL的錐形瓶中，滅菌30 min。將上述培養(yǎng)至對數(shù)期的發(fā)光細菌分裝至離心管中，4℃、5000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，收集菌體。將菌體重新懸浮于含一定濃度氯化鈉和脫脂牛奶、蔗糖等保護劑的溶液中，分裝于安瓿瓶中，每瓶0.5 mL，于-70℃預凍3 h，真空冷凍干燥24 h后封口。

Cu（NO3）2濃度為 1000 mg·L-1；Cd（NO3）2濃度為1000 mg·L-1；ZnSO4·7H2O純度為99.5%；殺螟丹農(nóng)藥標準物質(zhì)純度為98.1%；螺蟲乙酯標樣純度為99.0%；NaCl和丙酮均為分析純。如無特殊說明，以上試劑均采用去離子水稀釋。

細胞培養(yǎng)板（WHB-24），美國康寧公司；微孔板型多功能檢測儀（E7031），美國普洛麥格公司。

1.2 實驗方法

用1 mL 2%NaCl溶液復蘇費氏弧菌凍干粉，復蘇至發(fā)光穩(wěn)定且發(fā)光強度到100萬光子數(shù)，再稀釋至10 mL，振蕩混勻。

1.2.1 單一毒性實驗

將樣品稀釋為5個設定的質(zhì)量濃度，每個濃度3次平行，設置陰性質(zhì)控（空白對照，2%NaCl溶液）和陽性質(zhì)控（10 mg·L-1ZnSO4·7H2O溶液）。在96孔板中加入復蘇并稀釋后的菌液20 μL，用微孔板型多功能檢測儀測試發(fā)光菌的初始發(fā)光強度，測試合格后，每孔加入180 μL的受試樣品，20℃恒溫反應15 min和30 min后測其發(fā)光強度，計算抑制率為10%和90%時對應的樣品濃度，設為正式實驗的濃度范圍區(qū)間。根據(jù)預實驗得到的質(zhì)量濃度范圍，設計10個幾何級數(shù)質(zhì)量濃度梯度，每個濃度3組平行，并設置空白對照和陽性質(zhì)控，參照預實驗方法，測試反應15 min和30 min后的發(fā)光強度，并計算EC50。

1.2.2 聯(lián)合毒性實驗

根據(jù)重金屬銅、鎘和農(nóng)藥殺螟丹、螺蟲乙酯對費氏弧菌的單一毒性實驗結果，以15 min EC50值為1個毒性單位，按等毒性單位比1∶1、1∶2和2∶1設計銅-殺螟丹、鎘-殺螟丹、銅-螺蟲乙酯、鎘-螺蟲乙酯的二元聯(lián)合毒性試驗。測定不同毒性單位比的混合物對費氏弧菌15、30、45、60、75、90 min的EC50。

1.3 混合毒性指數(shù)法計算聯(lián)合毒性

式中：TUi為混合物中i組分的毒性單位；Ci為混合物中對生物產(chǎn)生半抑制影響的i組分濃度；EC50i為受試樣本i的單一EC50值；TUi，max為混合物中所有組分毒性單位的最大值；MTI為混合毒性指數(shù)。

根據(jù)MTI值對聯(lián)合毒性的類型進行判斷：MTI＜0，拮抗作用；MTI=0，獨立作用；0＜MTI＜1，部分相加作用；MTI=1，簡單相加作用；MTI＞1，協(xié)同作用[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過對比陰性質(zhì)控樣發(fā)光強度與受試樣本發(fā)光強度，計算受試樣本對費氏弧菌的抑制率，對相同暴露時間、不同濃度的抑制率進行曲線擬合，并計算各受試樣本的EC50值。

2 結果與分析

2.1 單一毒性

實驗中陽性質(zhì)控10 mg·L-1ZnSO4·7H2O對費氏弧菌的抑制率在40%～60%，陰性質(zhì)控2%NaCl對費氏弧菌的校正系數(shù)Cf值均在0.6～1.8之間，符合費氏弧菌凍干粉水質(zhì)檢測的國際標準ISO 11348-3和GB/T 15441—2012。受試樣品中丙酮的濃度為0.5%，對費氏弧菌的抑制率低于2%。

重金屬銅、鎘和農(nóng)藥殺螟丹、螺蟲乙酯對費氏弧菌的單一毒性結果如圖1和圖2所示。重金屬銅、鎘對費氏弧菌的毒性很強，暴露15 min后的EC50值分別為0.53 mg·L-1和0.74 mg·L-1，30 min后的EC50值分別為0.51 mg·L-1和0.67 mg·L-1，屬于劇毒毒性。農(nóng)藥殺螟丹和螺蟲乙酯相比銅、鎘對費氏弧菌的毒性較低，屬于中低毒性。殺螟丹對費氏弧菌15 min和30 min的EC50值分別為79.06 mg·L-1和55.68 mg·L-1，螺蟲乙酯對費氏弧菌15 min和30 min的EC50值分別為116.68 mg·L-1和105.25 mg·L-1。

圖1 重金屬銅和鎘對費氏弧菌作用15 min和30 min的EC50Figure 1 The 15 min and 30 min EC50of heavy metal copper and cadmium to Vibrio fischeri

2.2 聯(lián)合毒性

重金屬銅、鎘和農(nóng)藥殺螟丹、螺蟲乙酯的二元聯(lián)合毒性結果列于表1和表2，采用MTI法評價暴露不同時間后混合物聯(lián)合毒性的結果列于表3至表6。

銅-殺螟丹的混合體系中，當毒性單位比為1∶1時，15 min和30 min的聯(lián)合毒性評價結果為部分相加作用，表明其聯(lián)合毒性介于獨立和相加作用之間，而在45 min表現(xiàn)為簡單相加作用，60 min后表現(xiàn)為協(xié)同作用，說明毒性隨時間增加而增強。配比為1∶2時，前45 min的評價結果相同，均為拮抗作用，表明兩種物質(zhì)聯(lián)合毒性小于各物質(zhì)單獨毒性之和，說明毒性有所減弱。但是隨著時間的增長，混合物對費氏弧菌的毒性增強，由拮抗變?yōu)椴糠窒嗉幼饔?。配比?∶1時，隨著時間的增長，聯(lián)合毒性由拮抗變?yōu)楹唵蜗嗉印?/p>

圖2 農(nóng)藥殺螟丹和螺蟲乙酯對費氏弧菌作用15 min和30 min的EC50Figure 2 The 15 min and 30 min EC50of pesticides cartap and spirotetramat to Vibrio fischer

表1 銅-殺螟丹、鎘-殺螟丹二元混合體系對費氏弧菌的EC50值Table 1 The EC50of binary mixtures of copper-cartap and cadmium-cartap

表2 銅-螺蟲乙酯、鎘-螺蟲乙酯二元混合體系對費氏弧菌的EC50值Table 2 The EC50of binary mixtures of copper-spirotetramat and cadmium-spirotetramat

表3 銅-殺螟丹二元混合體系聯(lián)合毒性評價Table 3 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of copper-cartap

表4 鎘-殺螟丹二元混合體系聯(lián)合毒性評價Table 4 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of cadmium-cartap

鎘-殺螟丹的混合體系中，隨著暴露時間的增長，聯(lián)合毒性由拮抗作用變?yōu)橄嗉幼饔?，?5 min時毒性明顯增強，表現(xiàn)為部分相加，隨后的暴露時間里，毒性小幅增長。

銅-螺蟲乙酯的混合體系中，毒性單位比為1∶2時，混合物對費氏弧菌表現(xiàn)為拮抗作用，隨著時間的增長，拮抗作用減弱。毒性單位比為1∶1和2∶1時，混合物對費氏弧菌的聯(lián)合毒性為部分相加作用。

表5 銅-螺蟲乙酯二元混合體系聯(lián)合毒性評價Table 5 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of copper-spirotetramat

表6 鎘-螺蟲乙酯二元混合體系聯(lián)合毒性評價Table 6 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of cadmium-spirotetramat

鎘-螺蟲乙酯的混合體系中，毒性單位比為1∶1時，15 min和30 min表現(xiàn)為獨立作用，隨后毒性增強，表現(xiàn)為部分相加作用。毒性單位比為1∶2時，表現(xiàn)為拮抗作用。毒性單位比為2∶1時，隨著時間的增長，聯(lián)合毒性從拮抗作用變?yōu)椴糠窒嗉幼饔谩?/p>

3 討論

從圖1可得出受試樣本對費氏弧菌的毒性順序為銅＞鎘，毒性順序與其他生物如蚯蚓、人體等不同，可能是因為銅對水生細菌的毒性較大[17]。本研究中銅、鎘對費士弧菌的毒性大小順序與Tong等[18]和Mansour等[19]研究結果相同，但EC50值與其研究的數(shù)值有差異，可能是因為費氏弧菌的發(fā)光強度與其他因素（如溫度、鹽度、細菌質(zhì)量濃度）有關。

圖2中，殺螟丹的毒性大于螺蟲乙酯，這與兩種物質(zhì)在其他生物體的毒性順序相同。殺螟丹對南亞野鯪的 96 h LC50為 0.36 mg·L-1[20]，周勝利[8]用 98% 殺螟丹原藥對斑馬魚胚胎進行暴露，發(fā)現(xiàn)96 h LC50為0.28 mg·L-1，而螺蟲乙酯對非洲鯰魚胚胎的急性毒性LC50為8.44 mg·L-1[6]，從兩種物質(zhì)對于魚類胚胎的急性毒性LC50可以發(fā)現(xiàn)殺螟丹毒性大于螺蟲乙酯。暴露15 min后，4種物質(zhì)對費氏弧菌的單一毒性大小順序為銅＞鎘＞殺螟丹＞螺蟲乙酯，暴露30 min，毒性大小順序未發(fā)生改變且差異不顯著，因此不再延長暴露時間。

殺螟丹、螺蟲乙酯在與重金屬銅、鎘聯(lián)合時，會抑制銅、鎘的毒性，出現(xiàn)拮抗和部分相加作用。在表3和表4重金屬與殺螟丹的毒性單位比為1∶2和2∶1的混合體系中，當殺螟丹占比較大時，聯(lián)合毒性減弱，這可能是因為殺螟丹對細胞膜有損傷作用[21]，抑制了費氏弧菌對銅、鎘的吸收從而降低了毒性。在表5和表6重金屬和螺蟲乙酯的毒性單位比為1∶2和2∶1的混合體系中，螺蟲乙酯在混合體系中占比越大，則拮抗作用越強，這可能是因為螺蟲乙酯抑制了費氏弧菌的生長，降低了其機體能量平衡和代謝相關基因的表達，降低了細胞膜的通透性[22]，從而降低了銅、鎘滲入細胞膜內(nèi)所產(chǎn)生的毒害作用。

在4種混合體系中，隨銅、鎘在混合體系中占比增加，聯(lián)合毒性增強，且在暴露45 min后聯(lián)合毒性有較為明顯的增強，說明殺螟丹和螺蟲乙酯可能只是減緩了銅、鎘進入費氏弧菌的速率。在費氏弧菌為受試生物探究重金屬與農(nóng)藥聯(lián)合毒性的實驗中，常以15 min和30 min時的EC50作為聯(lián)合毒性的評價標準[23]。在殺螟丹、螺蟲乙酯和重金屬的聯(lián)合毒性實驗中發(fā)現(xiàn)，由于農(nóng)藥減緩了重金屬進入費氏弧菌的時間，因此應延長對費氏弧菌的暴露時間至45 min以上。

從4種混合體系的聯(lián)合毒性評價中可以明顯看到，隨著時間的增長毒性增強。污染物的毒性隨時間動態(tài)變化，不同的污染物隨時間可能有不同的毒性變化規(guī)律[24]。如Zhu等[25]采用濃度-時間-效應曲面研究了6種三嗪類除草劑對Q67的毒性，發(fā)現(xiàn)其毒性具有明顯的時間依賴性，即毒性隨著時間的延長而逐漸增加，但不同毒物的毒性增幅不同。此外，混合體系類型、混合配比對聯(lián)合作用效應也會產(chǎn)生影響。如螺蟲乙酯占比較高時，會抑制重金屬進入細胞，部分表現(xiàn)為拮抗作用；當螺蟲乙酯占比較低時，則表現(xiàn)為部分相加作用。因此在實際的生態(tài)風險評價中，要結合實際殘留量來加以分析。

綜上所述，殺螟丹與重金屬的混合體系中，最終表現(xiàn)為相加作用或協(xié)同作用。雖然在混合體系中較高濃度的螺蟲乙酯會抑制重金屬離子的毒性，但實際水環(huán)境的農(nóng)藥殘留和重金屬混合體系中，螺蟲乙酯殘留常占比較低，因此實際情況仍體現(xiàn)了毒性增強。殺螟丹和螺蟲乙酯在國內(nèi)外廣泛使用，如殺螟丹占到湄公河三角洲稻米和稻田養(yǎng)殖場殺蟲劑使用量的19%[26]，且我國土壤環(huán)境和水環(huán)境中銅、鎘含量普遍較高。農(nóng)藥殘留和重金屬都能通過降雨侵蝕和地表徑流進入水生環(huán)境并共同作用于水生生物產(chǎn)生聯(lián)合毒性。因此，雖然單一物質(zhì)毒性相對較低，但是隨著暴露時間的增長，殺螟丹、螺蟲乙酯與銅、鎘的聯(lián)合毒性仍不容忽視，其中殺螟丹與重金屬的聯(lián)合毒性風險更大。

4 結論

在充分暴露的條件下，殺螟丹、螺蟲乙酯與銅、鎘聯(lián)合毒性增強，整體表現(xiàn)為相加作用或協(xié)同作用，但當螺蟲乙酯在混合體系中所占毒性單位比較大時，表現(xiàn)為拮抗作用。

由于農(nóng)藥能減緩金屬離子進入費氏弧菌的速率，因此農(nóng)藥殺螟丹和螺蟲乙酯與重金屬銅、鎘的聯(lián)合暴露，體現(xiàn)為暴露初期重金屬毒性受到抑制，而后聯(lián)合毒性緩慢增強。采用發(fā)光細菌法評價聯(lián)合毒性時，應將暴露時間從30 min延長至45 min以上。殺螟丹和螺蟲乙酯雖是中低毒農(nóng)藥，但與重金屬銅、鎘混合時，對水生生物產(chǎn)生的聯(lián)合毒性增強，并需進一步實驗判定長期暴露的毒性。