牛糞堆肥過程中nosZ型反硝化細菌動態(tài)變化

許本姝，門夢琪，武曉桐，姜 欣，盛思遠，韓 悅，朱海峰，孟慶欣，鄧利廷，許修宏

（東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030）

隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)與農(nóng)業(yè)的發(fā)展，家畜糞便、農(nóng)作物秸稈等有機廢棄物已成為主要的環(huán)境污染物，影響生態(tài)平衡和人類健康[1]。堆肥是將上述有機廢棄物混合，經(jīng)生化降解而制成的一種有機肥料，能夠使有限的資源得到二次利用。制造堆肥必須先收集適當?shù)牟牧?，以秸稈與糞便作為堆肥原料不僅能夠減小有機廢物對環(huán)境帶來的壓力，同時能調(diào)節(jié)能源結構，促進農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的協(xié)調(diào)發(fā)展，對實現(xiàn)環(huán)境資源的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[2]。

氮素是堆肥過程中的重要營養(yǎng)元素，影響堆肥的進程及堆肥質(zhì)量。在反硝化作用過程中，氮元素以氣體的形式釋放到大氣中，影響堆肥的質(zhì)量[3-4]。反硝化反應的過程為，氧化亞氮還原酶基因（nosZ）參與其過程中最后一步，并將N2O轉化為N2，使反硝化過程得到完全反應的同時又能夠減少溫室氣體的產(chǎn)生。因此，學者們常以nosZ功能基因為標記研究反硝化細菌[5-6]。

堆肥反應是一個復雜的生物過程，不同深度堆肥中理化參數(shù)差異較大，對微生物群落組成也會產(chǎn)生不同的影響[7-8]。國外學者對細菌、真菌在堆肥不同區(qū)域的群落結構變化進行了研究[9-10]。然而動態(tài)堆肥過程中不同深度的反硝化細菌群落動態(tài)變化則鮮見報道，且關于理化參數(shù)與反硝化細菌之間關系的研究也相對欠缺。

本試驗以牛糞和稻草為原料，以nosZ功能基因為標記，通過高通量測序技術研究好氧堆肥過程中不同時期與深度的nosZ型反硝化細菌群落結構與多樣性的變化，并且分析理化參數(shù)對反硝化細菌群落結構以及多樣性的影響。對理解堆肥氮循環(huán)理論和促進堆肥技術的改進具有科學價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

在哈爾濱市香坊農(nóng)場實驗基地于2016年7月1日進行堆肥試驗，堆肥中的牛糞與水稻秸稈來自黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)畜牧業(yè)基地。堆肥材料的主要成分見表1。將稻稈干燥后切成3～5 cm小段后與牛糞混合均勻，調(diào)節(jié)起始C/N值為30∶1，建成約3 m×1.5m×1.5 m的堆體，堆肥全程共50 d，在堆肥的第8、23 d和41 d進行翻堆處理。

表1 堆肥材料的主要成分Table 1 Properties of raw materials for composting

1.2 樣品采集

堆體高1.5 m。在堆肥試驗開始的第0、2、18、39 d和50 d進行取樣，取樣時將堆體分為上（距堆體頂部20 cm）、中（距堆體頂部75 cm）、下（距堆體底部20 cm）三層，在各層均勻地取三個點分別采集500 g樣品，并按層次充分混勻，重復三次，整個堆肥過程共采集39份樣品，按堆肥天數(shù)與深度分類并分別命名為I0（第0 d）、T1（第2 d上層）、M1（第2 d中層）、B1（第2 d下層）、T2（第18 d上層）、M2（第18 d中層）、B2（第18 d下層）、T3（第39 d上層）、M3（第39 d中層）、B3（第39 d下層）、T4（第50 d上層）、M4（第50 d中層）、B4（第50 d下層）。采集后的部分樣品經(jīng)干燥、粉碎并過100目篩后常溫儲存，其余樣品置于-80℃冰箱中用于后期分析。

1.3 測定內(nèi)容與方法

在堆肥過程中，每日用精密數(shù)字溫度計測定每個層次（由上到下20、75、130 cm）與環(huán)境的溫度。含水率（WC）采用恒重法測定。將新鮮堆肥樣品與去離子水以1∶10（W/V）混合，用電導儀和pH數(shù)字儀分別測量pH值與EC值。全碳（TC）和全氮（TN）分別采用重鉻酸鉀容量法和凱氏定氮法測定[11]，碳氮比（C/N）為TC與TN的比值。氨態(tài)氮（ˉN）與硝態(tài)氮（NO-3ˉN）的含量利用流動分析儀進行測定。種子發(fā)芽率（Germination index，GI）是判斷堆肥腐熟程度的重要指標，利用獨行菜（Lepidium sativum L.）種子[12]測定種子發(fā)芽率。堆肥樣品與去離子水的比例為1∶10（質(zhì)量濃度比），振蕩24 h后取5 mL提取液注入有濾紙的培養(yǎng)皿中，并將20粒獨行菜種子分布均勻地放置于濾紙上，在培養(yǎng)箱中25°C遮光培養(yǎng)48 h，并用蒸餾水代替堆肥提取液作為對照組。計算方法：

GI=（堆肥浸提液的種子發(fā)芽率×種子根長）/（對照組種子發(fā)芽率×種子根長）×100%

除溫度以外的所有指標均進行三次重復測定。

1.4 樣品DNA的提取與PCR擴增

用CTAB法從堆肥樣品中提取總DNA[13]，使用Omega凝膠回收試劑盒（Omega Bio-Tek，Inc.，GA，USA）并根據(jù)說明書提示將提取粗DNA進行純化。純化后的DNA存儲在-80℃條件下以減少樣本的變化。以各個樣品的DNA為模板，以nosZ-1F（5′-CGY TGT TCM TCG ACA GCC AG-3′）和nosZ-1622R（5′-CGS ACC TTS TTG CCS TYG CG-3′）為引物擴增nosZ基因[14]。PCR反應體系與條件為：共75 μL PCR體系包含37.5 μL Taq-HS PCR Forest Mix（2X），模板 1 μL，上下游引物各 0.6 μL，補充 dd H2O到 75 μL。94℃預變性4 min；95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃再延伸7 min，最后4℃反應終止。PCR產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并使用Omega凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。

1.5 nosZ型反硝化細菌高通量測序

將純化后的PCR產(chǎn)物在四川貝博特生物科技有限公司Illumina Miseq平臺進行測序。原始數(shù)據(jù)提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號為SUB4856116。

1.6 生物信息處理

根據(jù)PE reads之間的重疊關系進行拼接過濾并去除嵌合體，在97%的相似度水平下進行聚類獲得可操作分類單元（OTU，Operational taxonomic units），使用Mothur（Version v.1.30）軟件，對樣品alpha多樣性指數(shù)進行評估（Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)），基于Silva數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋。利用QIIME軟件（Version 1.8.0）生成物種豐度表，利用R語言Vegan包中的RDA分析來反應各樣品微生物群落結構與理化參數(shù)之間的相關性。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件對堆肥的理化參數(shù)進行單因素方差分析（One way-ANOVA，Tukey HSD法），對反硝化細菌的多樣性與豐富度進行Spearman相關性分析，概率值P＜0.05代表相關關系顯著。

2 結果與討論

2.1 堆肥過程中理化參數(shù)及GI指標的變化

堆體高1.5 m。堆肥各層的溫度分布如圖1所示，箭頭表示翻堆時間。在整個過程中，堆肥經(jīng)歷了升溫（0～12 d）、高溫（13～27 d）、降溫（28～46 d）和腐熟（47～50 d）四個時期，堆體的溫度在堆肥開始后立即升高，堆體上層與中層的溫度在堆肥開始的第4 d即達到了55℃，而下層的溫度在第11 d才達到55℃，這種現(xiàn)象是由于堆肥下層的通風較差，氧氣含量較低，微生物代謝緩慢，導致下層溫度升高較慢[15-16]。堆肥過程中，各層溫度均達到了55℃并持續(xù)了5 d以上，足以殺死堆體中的病原菌而使堆肥達到無害化[17]。堆肥進行到第28 d，堆體的上中下層的溫度同時開始下降，并在第47 d達到了腐熟期。整個堆肥過程中，上層和中層的溫度基本上高于下層，并且翻堆會造成堆體溫度明顯波動。

圖1 堆肥過程中溫度的變化Figure 1 Changes of temperature during composting process

在堆肥過程中的升溫與高溫階段，pH值緩慢升高，這可能是由于隨著堆肥的進行，通過氨化作用使有機酸分解[18]，使pH值從7.93增加到8.90（見表2）。而到了降溫期，堆肥的pH值開始下降，最終達到了有機肥料可施用標準的微堿性環(huán)境（pH值范圍7.5～9.0）[19]。在堆肥的高溫階段，上層與中層的pH值分別達到了8.9和8.62，而下層只達到了8.20（P＜0.05），這可能是由于堆肥上層相對于堆體其他層次通風量較大，參與氨化作用的微生物大多為好氧微生物，因此在堆肥上層的活動相對劇烈[20]。電導率（EC）與堆肥中的含鹽量有著十分緊密的關系，EC值超過4.3 mS·cm-1時會不利于作物的正常生長[21]。從表1數(shù)據(jù)得知，堆肥過程中EC最高值為2.14 mS·cm-1，因此符合要求標準。含水率（WC）在堆肥過程中呈下降趨勢，在堆肥的第50 d含水率下降至45.21%～53.44%，且下層的含水率較上層和中層稍高，這可能是由于上層和中層的通風條件加速了含水量的降低[15]。NH+4ˉN在堆肥過程中先升高再減低，這是由于堆肥前期氨化細菌通過氨化作用使堆肥中的氮素分解為NH+4ˉN，導致ˉN含量逐漸增加，而到了堆肥后期，硝化作用使堆體中的轉化為-N，另外由于NH3的揮發(fā)，ˉN含量開始下降[22]。在堆肥的高溫期與降溫期，NH+4ˉN上層和中層的含量顯著高于下層（P＜0.05）。且上層的NH+4ˉN含量持續(xù)高于中層和下層的現(xiàn)象持續(xù)至堆肥結束，這可能是由于堆體上層具有相比底層較高的溫度環(huán)境和相比中層較好的通風條件，因此有利于氨化細菌的繁殖與氨化反應的進行[23]。而NO-3-N含量在堆肥升溫期過后急速上升。這與以往的研究結果相一致，過高的溫度會抑制硝化細菌的活性，隨著堆體溫度的降低，硝化細菌活性增強，氨態(tài)氮經(jīng)硝化作用轉化為硝態(tài)氮，導致NO-3-N含量升高[24]。C/N是判斷堆肥腐熟度的指標之一，一般情況下，C/N小于20即可判定堆肥基本腐熟[25]，通過表2可知，除中層的C/N值稍高于腐熟標準（20.14），其他各層的C/N值均達到了要求。種子發(fā)芽率（GI）是判斷堆肥腐熟程度的重要指標，當發(fā)芽率大于80.0%時證明堆肥的毒性已經(jīng)喪失并腐熟[26]。本實驗上中下層的種子發(fā)芽率均達到了標準值，證明堆肥各層均已達到腐熟標準并對植物失去毒性。

2.2 堆肥中nosZ型反硝化細菌群落的豐富度及多樣性

在所有堆肥樣品中共獲得了872 502個序列（見表3），各個樣品序列條數(shù)在12 717～55 863。在97%相似度的基礎上劃分共獲得449個OTU，序列長度范圍為200～500 bp。所有樣品基因文庫的覆蓋率指數(shù)均高于0.99，表明獲得的測序結果足以代表堆肥中nosZ型反硝化細菌群落結構的真實情況。測序結果表明在不同采樣地點的OTU數(shù)量和分布各不相同。nosZ型反硝化基因的OTU數(shù)量在堆肥開始時最高，隨著堆肥的推進OTU數(shù)量逐漸減少，在腐熟階段達到最低。這可能是在堆肥的最初階段，堆體中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度較高，利于反硝化細菌的生長[18]。此外，在整個堆肥過程中，上層的OTU數(shù)量始終高于中層和底層。Alpha多樣性統(tǒng)計結果見表3，樣品內(nèi)物種Simpson指數(shù)代表樣品中物種組成的多樣性，數(shù)值大小與物種多樣性呈反比，數(shù)值越大代表多樣性越低[27]。本研究的堆肥體系中Simpson指數(shù)先增大后減小，說明反硝化細菌的多樣性先降低后升高，并且在堆肥的降溫期，上層與下層的多樣性呈顯著性差異（P＜0.05）。ACE指數(shù)表示樣品中反硝化細菌的豐富度，ACE指數(shù)越高，反硝化細菌的豐富度越高[28]。ACE指數(shù)在堆肥過程中先減小后增大，表明反硝化細菌的豐富度與多樣性趨勢相似，先降低后升高。堆肥過程中豐富度的變化可能是由于溶解有機碳（DOC）濃度引起的，有研究表明nosZ基因豐富度與溶解有機碳濃度顯著相關[29]。此外在堆肥過程中，堆體各層的豐富度并沒有體現(xiàn)出顯著性差異。

表2 堆肥過程中理化及GI指標的變化Table 2 Changes of physic-chemical and GI indices during composting process

表3 堆肥過程中MiSeq測序結果及多樣性指數(shù)Table 3 MiSeq sequencing results and diversity indices during composting process

2.3 堆肥中nosZ型反硝化細菌的群落組成

39個堆肥樣品中的449條OTU分屬于1門3綱8目12科14屬15種。圖2為nosZ型反硝化細菌在屬水平上群落組成的動態(tài)變化，圖中顯示了過濾掉unclassified后豐度水平前10的物種，并將其他豐度水平物種合并為Others。假單胞菌屬（Pseudomonas）、鮑特氏菌屬（Bordetella）、陶厄氏菌屬（Thauera）、無色桿菌屬（Achromobacter）、Polymorphum、卡斯特蘭尼氏菌屬（Castellaniella）、生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、螯臺球菌屬（Chelatococcus）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）為各樣品中主要的反硝化細菌。堆肥第0 d，假單胞菌屬（54%）、鮑特氏菌屬（17%）、陶厄氏菌屬（12%）、生根瘤菌屬（11%）為優(yōu)勢菌屬。當堆肥進行到升溫期，陶厄氏菌屬的相對豐度顯著上升，成為升溫期的優(yōu)勢菌屬，且上層與下層其相對豐度相比中層較高。這是由于陶厄氏菌屬是β-變形菌門下的革蘭氏陰性細菌，大多數(shù)為桿狀且具有反硝化能力，并適合在中性pH和中溫環(huán)境中生長[30-31]，與此同時無色桿菌屬的相對豐度在升溫階段也稍有增加。堆肥高溫期各層反硝化細菌群落結構開始出現(xiàn)明顯的差異，堆肥上層和下層的假單胞菌屬含量上升并分別達到了83%和66%。有研究表明土壤N2O的排放量與溫度呈正相關，并且在N2O排放量較高的階段檢測到了大量假單胞菌的nosZ基因片段[32-33]。而中層的假單胞菌屬的相對豐度僅為38%，這可能是中層與下層氧氣含量的差異引起的。此外，無色桿菌屬在中層的相對豐度也迅速增加。在堆肥開始的第39 d，假單胞菌屬含量降低，上層與中層的螯臺球菌屬、卡斯特蘭尼氏菌、無色桿菌屬的相對豐度增加，鮑特氏菌屬在堆肥下層的相對豐度迅速增加并達到了68%。堆肥的腐熟期，三層之間的群落組成相似，鮑特氏菌屬依然為優(yōu)勢細菌，有研究表明鮑特氏菌屬更適合在中溫與中性的環(huán)境下生長[34]。假單胞菌屬在堆肥過程中的初始、升溫及高溫階段相對豐度均為最高，為堆肥過程中的優(yōu)勢菌屬。有研究表明假單胞菌屬具有生長速度快及高效脫氮的特點[35]。因此根據(jù)該菌屬的生長習性調(diào)節(jié)堆肥理化參數(shù)能夠有效控制堆肥反硝化反應的進程并可減少溫室氣體N2O的排放。

2.4 堆肥中nosZ型反硝化細菌群落組成與理化指標的相關性

圖2 堆肥樣品中nosZ型反硝化細菌在屬分類水平上群落組成的動態(tài)變化Figure 2 Changes of community composition of nosZ type denitrification bacteria during composting process at the level of genus

堆肥中的群落結構主要是受環(huán)境因素（溫度、pH、氮、含水率等）和堆肥基質(zhì)的影響[36]。了解理化參數(shù)與微生物之間的關系，找出影響微生物群落的主要因素，可以有效地調(diào)控微生物群落，從而改善堆肥過程[37]。因此，采用冗余分析（RDA）方法分析堆肥過程中理化因素對反硝化細菌群落結構的影響，本實驗對堆肥豐度前10的反硝化細菌屬與理化因素之間的關系進行了分析。如圖3a所示，前兩個排序軸分別解釋了40.15%和21.24%的變化，因此理化因素顯著影響堆肥過程中反硝化細菌的群落結構。箭頭的矢量線長短表示著不同理化參數(shù)與樣品之間的相關性大小，矢量線越長相關性越大[38]。因此根據(jù)箭頭連線的長度可看出，各理化因素中C/N（CN）、含水率（WC）、pH為影響樣品反硝化細菌群落結構最為顯著的環(huán)境因子，其次為EC、溫度（Temp）、NH+4ˉN（AN）、NO-3ˉN（NN）。含水率是影響堆肥中微生物活性關鍵的影響因素[39]。有研究指出若堆肥中含水率過高會導致堆體內(nèi)部形成厭氧環(huán)境，更有利于大部分為厭氧菌的反硝化細菌生長繁殖[26]。Meng等[40]利用PCRDGGE技術分析反硝化細菌群落結構，結果表明pH和溫度顯著影響nosZ型反硝化細菌群落結構。圖中各點代表堆肥樣品，點與點之間的關系由點之間的距離表示，距離越近代表樣品組成越相似，從圖3a可以觀察到，堆肥前期（0～2 d）的樣品匯聚在第一象限，而堆肥后期（18～50 d）的樣品集中在第四象限內(nèi)，堆肥升溫期中層的樣品與同時期其他兩層樣品之間的連線以及降溫期的各樣品之間連線距離較遠，因此這兩個時期反硝化細菌的群落結構受層次影響較大。圖3b顯示了堆肥過程中的nosZ型反硝化細菌優(yōu)勢菌屬（相對豐度前10）與理化參數(shù)之間的關系。螯臺球菌屬與溫度呈極顯著正相關（P＜0.01），Polymorphum與NO-3ˉN含量呈極顯著正相關（P＜0.01），卡斯特蘭尼氏菌屬與C/N呈顯著負相關（P＜0.05），生根瘤菌屬與NO-3ˉN含量呈顯著負相關，與NH+4ˉN和溫度呈顯著正相關（P＜0.05），與含水率和C/N呈極顯著性負相關（P＜0.01），無色桿菌屬與溫度呈顯著正相關（P＜0.05），紅假單胞菌屬與溫度和NH+4ˉN呈顯著正相關（P＜0.05），鹽單胞菌屬和陶厄氏菌屬均與C/N呈顯著正相關（P＜0.05），與NO-3ˉN含量呈顯著負相關（P＜0.05）。

2.5 理化參數(shù)對nosZ型反硝化細菌群落多樣性與豐富度的影響

堆肥過程中的反硝化細菌的多樣性與溫度、pH、NH+4ˉN、NO-3ˉN之間呈極顯著相關性（P＜0.01）（見表4），與C/N、含水率之間呈顯著相關性（P＜0.05）。并且影響程度由大到小依次為：溫度＞pH＞NO-3ˉN＞NH+4ˉN＞C/N＞含水率，其中溫度、pH、NH+4ˉN、含水率、C/N與反硝化細菌的多樣性呈反比，NO-3ˉN與反硝化細菌的多樣性呈正比。表明在本研究的堆肥過程中，反硝化細菌對溫度和pH敏感性較強。堆肥過程中反硝化細菌的豐富度僅與溫度呈極顯著相關性（P＜0.01），豐富度隨著溫度升高而減小。這與以往研究結果一致，過高的溫度和pH值會影響微生物的活性，抑制微生物的生長[17，40]。

3 結論

（1）在牛糞稻草堆肥過程中，不同時期的nosZ型反硝化細菌群落結構差異顯著，反硝化細菌的多樣性和豐富度在堆肥過程中均先降低后升高。假單胞菌屬、陶厄氏菌屬為堆肥升溫期的反硝化優(yōu)勢菌屬，假單胞菌屬、無色桿菌屬為高溫期的優(yōu)勢菌屬，鮑特氏菌屬為堆肥腐熟期的優(yōu)勢菌屬。除此之外，堆肥降溫期不同深度堆肥中菌群結構與多樣性指數(shù)差異顯著，各層次優(yōu)勢菌屬各不相同?？梢?，nosZ型反硝化細菌群落結構與多樣性在堆肥不同階段和不同深度均存在差異。

圖3 理化參數(shù)與樣品（a）及nosZ型反硝化細菌（b）在屬水平上的RDA分析Figure 3 RDA analysis of physic-chemical parameters between samples（a）and denitrifying bacteria（b）at the genus level

表4 理化參數(shù)與反硝化細菌群落Simpson和ACE指數(shù)的Spearman相關性系數(shù)Table 4 Spearman correlations coefficient between physic-chemical parameters and denitrifying bacteria Simpson as well as ACE indices

（2）理化因素對反硝化細菌有著不同程度的影響，C/N、含水率、pH對反硝化細菌群落結構影響最為顯著，螯臺球菌屬與溫度呈極顯著正相關（P＜0.01），Polymorphum與硝態(tài)氮含量呈極顯著正相關（P＜0.01），生根瘤菌屬與含水率和C/N呈極顯著負相關（P＜0.01）。溫度、pH、氨態(tài)氮與反硝化細菌多樣性呈極顯著負相關（P＜0.01），硝態(tài)氮與反硝化細菌的多樣性呈極顯著正相關（P＜0.01），溫度與反硝化細菌豐富度呈顯極著負相關（P＜0.01）。