疏水性農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌毒性的微板發(fā)光測(cè)定法研究

陽辛鳳， 葛會(huì)林， 李萍萍， 張 群， 劉春華

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心/農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(?？?/海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?571101)

農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留引起的質(zhì)量安全問題是國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注的焦點(diǎn)，儀器分析是對(duì)農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)的重要手段。然而，儀器分析常常是對(duì)一定范圍內(nèi)的特定農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，在殘留農(nóng)藥不明確的情況下，發(fā)光菌檢測(cè)法(luminescence bacteria test，簡(jiǎn)稱LBT)以其快速、簡(jiǎn)單和可進(jìn)行綜合毒性評(píng)價(jià)而比儀器分析更具優(yōu)勢(shì)。發(fā)光細(xì)菌(luminescence bacteria)是一類能在生長(zhǎng)過程中發(fā)出450～490 nm可見熒光的非致病性革蘭氏陰性菌，發(fā)光菌法是通過發(fā)光菌與有毒物直接接觸而引起發(fā)光值發(fā)生變化的直接生物毒性測(cè)試方法[1]。該方法最初被應(yīng)用于飲用水安全評(píng)價(jià)，例如，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)組織(international organization for standardization，簡(jiǎn)稱ISO)頒布了ISO 11348-3—2007《水質(zhì)水樣對(duì)弧菌類光發(fā)射抑制影響的測(cè)定(發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn))》[2]，我國(guó)頒布了應(yīng)用發(fā)光菌明亮發(fā)光桿菌進(jìn)行水質(zhì)毒性測(cè)試的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15441—1995《水質(zhì)急性毒性的測(cè)定 發(fā)光細(xì)菌法》[3]。LBT還可應(yīng)用于水質(zhì)狀況評(píng)價(jià)[4-5]、環(huán)境污染毒性評(píng)價(jià)和檢測(cè)[6]、重金屬毒性評(píng)價(jià)[7]、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥獸藥殘留檢測(cè)[8-10]、食品中食品添加劑檢測(cè)[11-12]和農(nóng)產(chǎn)品生物毒素檢測(cè)[13]等。利用發(fā)光細(xì)菌對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥、獸藥、抗生素等污染物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是目前農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究領(lǐng)域新熱點(diǎn)，與儀器分析相比，LBT具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏和成本低等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中有著廣泛應(yīng)用的前景，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全具有指導(dǎo)意義。

在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估領(lǐng)域，目前LBT多用于親水性農(nóng)藥的檢測(cè)，如敵百蟲、樂果、乙酰甲胺磷、抗蚜威、甲霜靈等[10，14]。發(fā)光菌菌懸液是以水為連續(xù)相的混合體系，親水性農(nóng)藥溶液與菌懸液混合后，農(nóng)藥通過與發(fā)光菌直接接觸抑制發(fā)光。然而，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用農(nóng)藥多數(shù)是疏水性的，在建立LBT方法時(shí)，以水為溶劑配制疏水性農(nóng)藥溶液時(shí)須要添加助溶劑，常用的是二甲基亞砜(DMSO)[14-15]。楊潔等以1%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，簡(jiǎn)稱DMSO)為助溶劑溶解疏水性農(nóng)藥莎稗磷、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯時(shí)得到的溶液呈乳濁液狀態(tài)[14]。這表明疏水性農(nóng)藥在1% DMSO溶液中溶解性差，由此可能造成LBT結(jié)果與真實(shí)毒性有差異。本研究發(fā)現(xiàn)，以1% DMSO為溶劑時(shí)，多菌靈等疏水性農(nóng)藥溶解性很弱，濃度越高，溶液越渾濁，伴有沉淀析出，在1～500 μg/mL的寬廣濃度范圍，費(fèi)氏弧菌與疏水性農(nóng)藥作用后其發(fā)光抑制率變化幅度小，不能獲得發(fā)光抑制率在0～100%范圍的劑 量- 效應(yīng)曲線(dose-response curve，簡(jiǎn)稱DRC)；而以甲醇為溶劑時(shí)，可以在較窄的濃度范圍獲得發(fā)光抑制率在0～100%范圍的DRC。以甲醇作為疏水性農(nóng)藥的溶劑進(jìn)行LBT測(cè)定目前未見報(bào)道，甲醇在眾多有機(jī)溶劑中對(duì)發(fā)光菌的毒性是最小的[16-17]，而且對(duì)農(nóng)藥溶解性能極佳，是潛在的可用于LBT的溶劑。

本研究旨在通過分析以甲醇為溶劑時(shí)疏水性農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光的抑制效應(yīng)，探索疏水性農(nóng)藥影響費(fèi)氏弧菌發(fā)光的規(guī)律，為初步建立利用發(fā)光細(xì)菌快速檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中疏水性農(nóng)藥殘留的方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Synergy 2多功能微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-Tek)、HVE-50全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本Hirayama)、Milli-Q?超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)、QYC-2012C 全溫培養(yǎng)搖床(上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、Eppendorf移液器(德國(guó)Eppendorf)、96微孔板(美國(guó)Corning)。

標(biāo)準(zhǔn)品多菌靈、溴氰菊酯、毒死蜱(純度均為98.5%)均購(gòu)自德國(guó)Dr Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈均為色譜純(美國(guó)Fisher)；Difco海生菌肉湯2216購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 試驗(yàn)菌種

菌種為1H00021費(fèi)氏弧菌(Vibriofisheri)，購(gòu)自中國(guó)海洋微生物菌種保藏管理中心。

費(fèi)氏弧菌液體培養(yǎng)基：稱取2216海生菌肉湯粉末 37.4 g，加水1.0 L，加熱攪拌使充分溶解，分裝至三角瓶，121 ℃ 條件下高壓滅菌20 min。

費(fèi)氏弧菌的搖瓶培養(yǎng)：挑取1環(huán)費(fèi)氏弧菌斜面培養(yǎng)物，接入海生菌肉湯2216液體培養(yǎng)基中，于22 ℃、120 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)好的菌液在暗室內(nèi)以肉眼可見明亮的熒光，取100 μL菌液于96微孔板中，放入多功能微孔板檢測(cè)儀上檢測(cè)，菌液發(fā)光值(relative light unit，簡(jiǎn)稱RLU)不低于100萬光子數(shù)。

1.3 農(nóng)藥對(duì)發(fā)光菌毒性的測(cè)定

多菌靈、溴氰菊酯、毒死蜱分別溶解于甲醇中，再以甲醇進(jìn)行稀釋，配制得到系列濃度的溶液，通過預(yù)備試驗(yàn)獲得適宜的濃度范圍，確保系列濃度的農(nóng)藥溶液對(duì)費(fèi)氏弧菌1H00021的發(fā)光抑制率在0～100%之間均勻分布。

3種疏水性農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光毒性作用體系總體積為200 μL。移取系列濃度的農(nóng)藥溶液各30 μL，分別加入到96微孔板中(第1橫排)，以同體積甲醇為空白對(duì)照，每個(gè)濃度重復(fù)3次(即第2、第3橫排為第1橫排的重復(fù))，最后加入 170 μL 費(fèi)氏弧菌1H00021菌懸液，立即將96微孔板放入多功能微孔板檢測(cè)儀，振板5 min，測(cè)定毒物與發(fā)光菌作用 20 min 時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度。

采用空白樣品發(fā)光強(qiáng)度平均值I0與農(nóng)藥各濃度樣品對(duì)應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度平均值I計(jì)算對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性，以發(fā)光抑制率E表示[8]：E=(1-I/I0)×100%。

1.4 劑量-效應(yīng)曲線(DRC)模擬

采用Origin 8.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，擬合劑量-效應(yīng)曲線，根據(jù)擬合模型利用Origin 8.5 “From Y to X”功能計(jì)算得到農(nóng)藥與費(fèi)氏弧菌1H00021作用20 min時(shí)的半效應(yīng)濃度(EC50)，并以此判斷農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌1H00021毒性的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醇對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光毒性

LBT毒性測(cè)定時(shí)，低濃度二甲基亞砜水溶液(DMSO≤1%)常被用于溶解疏水性農(nóng)藥，如阿維菌素等[14]。但在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，多菌靈等3種目標(biāo)農(nóng)藥在1% DMSO水溶液中均有顆粒析出現(xiàn)象，因此未采用1% DMSO作為本試驗(yàn)的溶劑。甲醇對(duì)農(nóng)藥溶解性能極佳，而且有研究表明[16-17]，常用有機(jī)溶劑中，乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、四氫呋喃、異丙醇等7種有機(jī)溶劑對(duì)淡水發(fā)光菌青?；【鶴67均有抑制毒性，其中甲醇毒性最小，因此甲醇是潛在的可用于LBT的溶劑，但甲醇對(duì)費(fèi)氏弧菌毒性尚未見報(bào)道。本研究測(cè)定甲醇對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度的影響(圖1)，結(jié)果表明，LBT檢測(cè)體系中隨著甲醇濃度的增加，費(fèi)氏弧菌的發(fā)光強(qiáng)度減弱。甲醇為親核試劑，具有負(fù)電性，是氫鍵的接受體，當(dāng)發(fā)光細(xì)菌接觸到甲醇時(shí)，甲醇能與發(fā)光菌體細(xì)胞內(nèi)的黃素單核苷酸發(fā)生氫鍵鍵合，從而阻礙氫的傳遞，進(jìn)而抑制發(fā)光菌的發(fā)光[16]。

2.2 疏水性農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光毒性檢測(cè)體系的建立

毒物進(jìn)入發(fā)光菌生長(zhǎng)環(huán)境中后，通過直接抑制細(xì)菌發(fā)光反應(yīng)過程的酶活性，或是抑制細(xì)菌胞內(nèi)發(fā)光反應(yīng)相關(guān)的代謝反應(yīng)進(jìn)而抑制發(fā)光強(qiáng)度。本試驗(yàn)設(shè)置LBT體系總體積為 200 μL 及作用于費(fèi)氏弧菌時(shí)間為20 min，通過測(cè)定不同體積比的農(nóng)藥溶液作用于費(fèi)氏弧菌的發(fā)光毒性，確定檢測(cè)體系中疏水性農(nóng)藥溶液與費(fèi)氏弧菌菌懸液的適宜體積比(圖2)；通過測(cè)定不同濃度農(nóng)藥溶液與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間在5、10、15、20、25、30 min下的發(fā)光抑制率，確定幾種疏水性農(nóng)藥與費(fèi)氏弧菌接觸反應(yīng)的適宜時(shí)間(圖3)。

由圖2可知，檢測(cè)體系總體積為200 μL及作用時(shí)間為 20 min 時(shí)，在疏水性農(nóng)藥溶液與費(fèi)氏弧菌菌懸液的體積比分別為10/190、25/175、30/170、40/160這4種不同比例下(甲醇比例依次增加)，各稀釋度的多菌靈溶液(0.2～100.0 μg/mL)對(duì)費(fèi)氏弧菌1H00021的發(fā)光抑制強(qiáng)度有明顯區(qū)別?？傮w來說，4種比例下費(fèi)氏弧菌1H00021的發(fā)光值均隨著多菌靈濃度的增加而下降；隨檢測(cè)體系甲醇比例的增加，費(fèi)氏弧菌發(fā)光值降低。比例為10/190費(fèi)氏弧菌的發(fā)光值最高，但發(fā)光值曲線較為平直，即使多菌靈濃度大幅度升高，發(fā)光值也僅有微弱下降；發(fā)光值最高的原因可能是體系中甲醇比例最低(5%)，對(duì)發(fā)光抑制作用弱；發(fā)光值曲線變化較為平緩，原因可能是對(duì)費(fèi)氏弧菌產(chǎn)生發(fā)光毒性抑制的僅僅是溶解狀態(tài)的多菌靈，當(dāng)水相比例較高，超過一定比例時(shí)，多菌靈會(huì)沉淀析出，析出的這部分多菌靈對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光無抑制作用。比例為40/160時(shí)，費(fèi)氏弧菌發(fā)光值最低，發(fā)光值曲線亦較為平直，原因可能是體系中甲醇濃度過高(20%)，甲醇對(duì)費(fèi)氏弧菌產(chǎn)生了強(qiáng)烈抑制。比例為30/170時(shí)，費(fèi)氏弧菌發(fā)光值較高，且介于10/190和40/160之間，發(fā)光值曲線具有較適宜的斜率，表現(xiàn)為隨著多菌靈濃度的升高，發(fā)光值也相應(yīng)降低；發(fā)光值較高的原因可能是盡管體系中甲醇達(dá)到了15%，但由于費(fèi)氏弧菌初始發(fā)光值高，以及15%甲醇對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光作用影響有限，故發(fā)光值仍然較高；發(fā)光值曲線具有較適宜的斜率，原因可能是在30/170的比例下，多菌靈保持了良好的溶解，溶解狀態(tài)的多菌靈均能充分地與費(fèi)氏弧菌接觸，抑制其發(fā)光?？梢?，體積比30/170是一個(gè)平衡點(diǎn)，既不會(huì)大幅度抑制費(fèi)氏弧菌的發(fā)光作用，又能兼顧疏水性農(nóng)藥的良好溶解性及毒性，因而農(nóng)藥濃度與發(fā)光率之間有良好的相關(guān)性。袁東星等認(rèn)為，即使農(nóng)藥濃度與發(fā)光強(qiáng)度的相關(guān)性不呈嚴(yán)格的線性關(guān)系，在農(nóng)藥殘留的實(shí)際檢測(cè)中仍具有實(shí)際意義。因?yàn)楝F(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)經(jīng)常要求半定量即可[18]。圖2的曲線完全符合這一要求。綜合上述結(jié)果，以30/170作為疏水性農(nóng)藥LBT方法中農(nóng)藥溶液與費(fèi)氏弧菌菌懸液的體積比。

圖3-a至圖3-c分別為多菌靈、溴氰菊酯、毒死蜱與費(fèi)氏菌接觸時(shí)間為5～30 min的發(fā)光抑制作用曲線?？傮w來說，費(fèi)氏弧菌1H00021的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，多菌靈、溴氰菊酯和毒死蜱與費(fèi)氏弧菌接觸時(shí)間為10、15、20、25、30 min的發(fā)光抑制作用曲線接近，且略高于接觸時(shí)間5 min時(shí)的發(fā)光抑制作用曲線。鑒于不同毒性物質(zhì)對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光產(chǎn)生影響的速度不同，本研究以作用20 min時(shí)的測(cè)定值作為定量研究的數(shù)據(jù)。

綜合以上結(jié)果，建立疏水性農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌1H00021短期微板發(fā)光毒性測(cè)定方法。疏水性農(nóng)藥溶解于甲醇中，每個(gè)微孔的毒性測(cè)定體系為200 μL，包括30 μL農(nóng)藥溶液，170 μL費(fèi)氏弧菌菌懸液，最佳檢測(cè)時(shí)間為20 min。

2.3 3種疏水性農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光毒性

對(duì)發(fā)光菌毒性研究表明，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，農(nóng)藥的質(zhì)量濃度與發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度變化呈函數(shù)關(guān)系，可據(jù)此擬合劑量-效應(yīng)曲線(DRC)對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行定量或半定量。本研究應(yīng)用Origin 8.5線性擬合功能和非線性擬合功能擬合3種農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌1H00021的劑量-效應(yīng)關(guān)系，擬合模型及相關(guān)參數(shù)見圖4、表1。線性擬合時(shí)，毒死蜱相關(guān)系數(shù)最低，為0.842 8。非線性擬合時(shí)，3種疏水性農(nóng)藥擬合模型的相關(guān)系數(shù)r均大于0.97，DRC都可用Log3P1函數(shù)有效表征。因此，雖然線性擬合函數(shù)和Log3P1函數(shù)都能較好地描述脂溶性農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光毒性，但Log3P1函數(shù)優(yōu)于線性擬合函數(shù)。

利用Origin8.5的“從y至x”功能可計(jì)算各個(gè)效應(yīng)下的濃度，如半數(shù)抑制濃度EC50等。EC50是農(nóng)藥毒性大小的表征。由表1可知，無論是線性擬合函數(shù)，還是Log3P1函數(shù)，3種脂溶性農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌毒性大小順序均為多菌靈>溴氰菊酯>毒死蜱。然而，由于擬合函數(shù)的差異，當(dāng)函數(shù)的相關(guān)系數(shù)高時(shí)，由線性擬合和Log3P1函數(shù)計(jì)算得到的EC50相同或接近，如多菌靈EC50均為0.024 μg/mL。然而，隨著相關(guān)系數(shù)降低，相關(guān)性逐漸減弱，由線性擬合和Log3P1函數(shù)計(jì)算得到的EC50的差異逐漸增大，如溴氰菊酯、毒死蜱。

有毒物質(zhì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光的抑制，主要源于對(duì)發(fā)光反應(yīng)核心熒光素酶活性的抑制，其遵循酶活性抑制動(dòng)力學(xué)原理，因此以毒物濃度對(duì)發(fā)光抑制率作線性回歸方程不一定是最適合的[19]。本試驗(yàn)同樣表明線性擬合的局限性如多菌靈，線性擬合與非線性擬合結(jié)果是一致的，但對(duì)于溴氰菊酯和毒死蜱，非線性擬合得到的函數(shù)具有更好的相關(guān)性。

3種疏水性農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制率隨污染物濃度的增加而逐漸增大。與溴氰菊酯、毒死蜱相比，多菌靈對(duì)費(fèi)氏弧菌的EC50最小，毒性效應(yīng)最強(qiáng)，這可能是因?yàn)槎嗑`屬于殺菌劑，而溴氰菊酯和毒死蜱屬于殺蟲劑，費(fèi)氏弧菌對(duì)殺菌劑毒性更為敏感。

已報(bào)道的毒物DRC具有多種形狀，主要類型有線性[14]、S形[8，16，20]和J形[16]等。郭柔杉等采用費(fèi)氏弧菌評(píng)價(jià)果汁中亞硝酸鈉、食用色素的生物毒性時(shí)[11-12]、李翔等評(píng)價(jià)黃曲霉毒素對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光毒性時(shí)[13]，以毒物濃度為橫坐標(biāo)繪制的DRC曲線是非線性的，而以毒物濃度對(duì)數(shù)(lgC)為橫坐標(biāo)繪制的DRC曲線則是線性的。本研究擬合得到的DRC呈S形，與湯淼等的研究結(jié)果[8]一致。

以上結(jié)果表明，3種疏水性農(nóng)藥的濃度與費(fèi)氏弧菌發(fā)光的抑制存在定量關(guān)系，因此可以利用費(fèi)氏弧菌發(fā)光法快速評(píng)價(jià)其生物毒性。

3 結(jié)論

建立疏水性農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌1H00021短期微板發(fā)光毒性測(cè)定方法。疏水性農(nóng)藥溶解于甲醇中，每個(gè)微孔的毒性測(cè)定體系為200 μL，包括30 μL農(nóng)藥溶液、170 μL費(fèi)氏弧菌菌懸液，最佳檢測(cè)時(shí)間為20 min。擬合得到疏水性農(nóng)藥對(duì)1H00021毒性的DRC，以EC50為表征的3種疏水性農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌1H00021的發(fā)光毒性順序?yàn)槎嗑`﹥溴氰菊酯﹥毒死蜱。3種疏水性農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌1H00021的發(fā)光毒性存在良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，可以利用費(fèi)氏弧菌微板發(fā)光法快速評(píng)價(jià)疏水性農(nóng)藥的生物毒性。

表1 3種農(nóng)藥的線性擬合和Log3P1函數(shù)擬合結(jié)果

注：y=a+b×x，其中，x為濃度值(C)的對(duì)數(shù)，a、b分別是用Origin 8.5對(duì)效應(yīng)y和濃度x進(jìn)行擬合得到的參數(shù)。y=a-b×ln(x+c)，其中a、b、c分別是用Origin 8.5對(duì)效應(yīng)y和濃度x進(jìn)行擬合得到的參數(shù)。