糖絡(luò)寧對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)功能及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α-XBP-1-CHOP通路的影響

李瀟 姚偉潔 楊鑫偉 史浩田 高變娥 朱笳悅 許利平

〔摘要〕 目的 探討糖絡(luò)寧對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy， DPN）大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress， ER stress）IRE1α-XBP-1-CHOP通路的影響。方法 建立DPN大鼠模型，設(shè)置空白對(duì)照組（Control）、模型對(duì)照組（Model）、氧化三甲胺組（TMAO）、糖絡(luò)寧低劑量組（LTLN）和糖絡(luò)寧高劑量組（HTLN），分別灌胃給藥12周。采用放射免疫試劑盒測(cè)定穩(wěn)態(tài)胰島素抵抗指數(shù);采用透射電鏡和勞克堅(jiān)勞藍(lán)染色觀察坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu);測(cè)定鼠尾熱痛閾值、神經(jīng)傳導(dǎo)速度和蛋白基因產(chǎn)物9.5（protein gene product 9.5， PGP 9.5）蛋白的表達(dá)并檢測(cè)周圍神經(jīng)功能;采用Western blot法檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78， GRP 78）、X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein1， XBP-1）、凋亡蛋白C/EBP同源蛋白（CCAAT/enhancer binding protein Homologous protein， CHOP）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2， Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax）和磷酸化真核翻譯起始因子2α （phospho-ukaryotic translation initiation factor 2α， P-eIF 2α）的蛋白表達(dá);通過免疫熒光組織化學(xué)法檢測(cè)肌醇激酶1 （inositol requiring enzyme1α， IRE 1α）、生長停滯及 DNA損傷基因34 （growth-arrest and DNA damage-inducible gene 34， GADD 34）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化蛋白（endoplasmic oxidoreductin-1-like， Ero1α）指標(biāo)。結(jié)果 與模型組比，糖絡(luò)寧高、低劑量組能夠有效改善坐骨神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和功能，并能夠影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α-XBP-1-CHOP凋亡通路提高GRP 78、Bcl-2和P-eIF 2α的表達(dá)（P<0.05），降低P-IRE1α、XBP-1、CHOPGADD 34、Bax和Ero1α的表達(dá)（P<0.05）。結(jié)論 糖絡(luò)寧能夠通過抑制ER stress中IRE1α-XBP-1-CHOP凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而減輕ER stress誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，改善坐骨神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和功能從而防治DPN。

〔關(guān)鍵詞〕 糖絡(luò)寧;糖尿病周圍神經(jīng)病變;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;X盒結(jié)合蛋白1;凋亡蛋白C/EBP同源蛋白

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R587.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.07.011

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Tangluoning （TLN） on the IRE1α-XBP-1-CHOP pathway under endoplasmic reticulum （ER） stress in diabetic peripheral neuropathy （DPN） rats. Methods DPN rat model was established， with Control group， Model group， Trimethylamine oxide （TMAO） group， Low-dose Tangluoning （LTLN） group and High-dose Tangluoning （HTLN） group， and they were treated with intragastric administration for 12 weeks. Homeostasis model of assessment for insulin resistance index（HOMA-IR）was determined by a radioimmune outfit. The sciatic nerve structure was observed by transmission electron microscope （TEM） and luxol fast blue （LFB）. Thermal perception threshold （TPT） of the rat tail， motor nerve conduction velocity （MNCV） and sensor nerve conduction velocity （SNCV）， and the expression of protein gene product 9.5 （PGP 9.5） were measured. And the peripheral neurological function was determined. Western blot analysis was used to assess the expressions of glucose-regulated protein 78 （GRP 78）， X-box binding protein 1 （XBP-1）， CCAAT/enhancer binding protein Homologous protein （CHOP）， B cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2 Associated X Protein （Bax） and phospho-ukaryotic translation initiation factor 2α （P-eIF2α）. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of inositol requiring enzyme 1 （IRE1α）， growth-arrest and DNA damage-inducible gene 34 （GADD34） and endoplasmic oxidoreductin-1-like （Ero1α）. Results Compared with the Model group， TLN could significantly improve the morphological structure and neurological function of the sciatic nerve. TLN had an impact on the IRE1α-XBP-1-CHOP pathway under ER stress by enhancing the expressions of GRP78， Bcl-2 and P-eIF 2α （P<0.01）， and reducing the expressions of P-IRE 1α， XBP-1， CHOP， GADD 34， Bax and Ero1α （P<0.01）. Conclusion TLN can inhibit the expressions of correlative proteins in the IRE1α-XBP-1-CHOP pathway under ER stress to alleviate the cell apoptosis induced by ER stress， and improve the structure and function of the sciatic nerve， in order to prevent the DPN.

〔Keywords〕 Tangluoning; diabetic peripheral neuropathy; endoplasmic reticulum stress; XBP-1; CHOP

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)報(bào)告，2015年有4.15億人患有糖尿病[1]，超50%會(huì)發(fā)展成為糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）[2]，DPN會(huì)導(dǎo)致慢性疼痛，足潰瘍，甚至截肢[3]。DPN的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，近期研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）參與了DPN的發(fā)生發(fā)展[4-5]。

糖絡(luò)寧由高彥彬教授長期臨床實(shí)踐總結(jié)而來的經(jīng)驗(yàn)方，是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，結(jié)合絡(luò)病學(xué)說，根據(jù)肝腎虧虛，絡(luò)氣虛滯，絡(luò)脈瘀阻病機(jī)，以益氣養(yǎng)陰、滋補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)為治則的基礎(chǔ)上辨證處方。在臨床上能夠有效治療DPN，如提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度（nerve conduction velocity， NCV）和糖尿病神經(jīng)積分[6]。前期研究中已證明糖絡(luò)寧能夠改善氧化應(yīng)激[7]。近期有研究表明，氧化應(yīng)激并不是引起DPN發(fā)生的直接因素，由ER stress引起的細(xì)胞凋亡要早于氧化應(yīng)激的發(fā)生[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)從ER stress誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑探討糖絡(luò)寧的作用機(jī)制。

高血糖，脂代謝異常是誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要因素之一[5]。我們選擇高脂飼料飼養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素（streptozocin， STZ）的方法模擬臨床高糖高脂，胰島素抵抗（insulin resistance， IR）的情況復(fù)制DPN大鼠模型。通過觀察糖絡(luò)寧對(duì)DPN大鼠穩(wěn)態(tài)胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model of assessment for insulin resistance index， HOMA-IR），神經(jīng)形態(tài)和功能，以及ER伴侶蛋白（glucose-regulated protein 78， GRP 78）的影響，確定DPN的發(fā)生存在ER stress的參與。并通過觀察糖絡(luò)寧對(duì)ER stress凋亡途徑相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78， GRP 78）、X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein1， XBP-1）、凋亡蛋白C/EBP同源蛋白（CCAAT/enhancer binding protein Homologous protein， CHOP）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2， Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax）和磷酸化真核翻譯起始因子2α（phospho-ukaryotic translation initiation factor 2α，P-eIF 2α）蛋白的影響，探討糖絡(luò)寧是否能夠通過干預(yù)ER stress凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)減輕ER stress誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

1 材料

1.1? 藥物

糖絡(luò)寧由黃芪、丹參、川牛膝、雞血藤、狗脊、赤芍、木瓜、延胡索組成，飲片均購自北京市中醫(yī)院同仁堂，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院羅容副教授鑒定符合《中華人民共和國藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)。糖絡(luò)寧復(fù)方按處方劑量加入10倍量蒸餾水室溫浸泡1 h后，沸水煎煮2次，每次1 h。過濾后合并兩次藥液，濃縮制成一定濃度水煎液，4 ℃冷藏備用。

1.2? 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠（200±20）g來自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，購自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（京）2012-0001。所有實(shí)驗(yàn)過程均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)（倫理編號(hào)：AEEI-2014-086）審核，大鼠在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)水進(jìn)食。

1.3? 主要試劑和抗體

鏈脲佐菌素（S0130）、氧化三甲胺（317594），Mouse anti-GRP 78抗體（sc-376768）、Mouse anti-CHOP抗體（sc-7351）、Mouse anti-Ero1α抗體（sc-100805）、Mouse anti- Bax抗體（sc-7480）、Rabbit anti-GADD34抗體（sc-8327）、Rabbit anti-P-eIF2α抗體（sc-293100）、Rabbit anti-IRE1α抗體（sc-20790）均來自Santa Cruz;Rabbit anti-P-IRE1α抗體（ab48187）、Rabbit anti-XBP-1抗體（ab37152）、Rabbit anti-PGP 9.5抗體（ab108986）均來自Abcam;辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（ZB-2305）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（ZB-2301）、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（ZF-0312）、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（ZF-0311）、Mouse anti-β-actin抗體（TA-09）均來自中杉金橋。

1.4? 主要儀器

3K15低溫離心機(jī)（Sigma）;SpectraMax Plus 384全波長酶標(biāo)儀（Molecular Devices）;DV215CD電子天平（OHAUS）ECLIPSE 80i高級(jí)研究型顯微鏡（Nikon）;

LWD300-38LTI三目倒置相差顯微鏡（上海測(cè)維光電）;YLS-12A光照鼠尾測(cè)痛儀;JEM-1400高襯度透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）。

2 方法

2.1? DPN模型的建立[9]及分組干預(yù)

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成5組，空白對(duì)照組（Control）、模型對(duì)照組（Model）、氧化三甲胺組（TMAO）、糖絡(luò)寧低劑量組（LTLN）和糖絡(luò)寧高劑量組（HTLN），其中，Model、TMAO、LTLN組和HTLN組大鼠給予高脂飼料（配方：10%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，0.5%膽酸鹽，67%基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)4周，Control組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。定期測(cè)定血脂，待高血脂形成后禁食12 h造高血糖模型，Model、 TMAO、LTLN組和HTLN組大鼠腹腔注射35 mg/kg STZ，Control組注射相同容積的枸櫞酸緩沖液。一周后測(cè)大鼠空腹血糖。大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）≥16.7 mmol/L被認(rèn)定高血糖模型成立復(fù)制DPN模型，除Control組外，各組繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)。TMAO組110 mg/（kg·d），LTLN組5.45 g/（kg·d）和HTLN組10.9 g/（kg·d）大鼠分別灌胃給藥12周。

2.2? DPN模型和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 IRE1α-XBP-1-CHOP通路的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1? HOMA-IR的測(cè)定[10]? 大鼠給藥12周后禁食12 h，尾靜脈取血并離心（4 ℃、 3 000 r/min、 15 min），測(cè)定空腹血糖（fasting blood glucose， FBG）和空腹胰島素水平（fasting insulin， FINS）。

HOMA-IR= （FBG×FINS）/22.5

2.2.2? 鼠尾熱痛閾值（thermal perception threshold，TPT）的測(cè)定? TPT的測(cè)定采用楊鑫偉等[11]的實(shí)驗(yàn)方法。使用鼠尾熱痛儀熱源刺激大鼠尾尖，測(cè)定時(shí)間閾設(shè)定為16 s以防傷害鼠尾。

2.2.3? 坐骨神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（nerve conduction velocity，NCV）的測(cè)定? 大鼠處死前麻醉，坐骨神經(jīng)NCV的測(cè)定采用楊鑫偉等[11]的實(shí)驗(yàn)方法。將左側(cè)坐骨神經(jīng)暴露，刺激電極和記錄電極置于坐骨神經(jīng)下面，用單方波脈沖刺激測(cè)定NCV。

2.2.4? 坐骨神經(jīng)的處理? 測(cè)完NCV以后的坐骨神經(jīng)分離出來并轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存。另一側(cè)坐骨神經(jīng)分離出來后分成兩部分，一部分固定在10%中性甲醛中，并進(jìn)行包埋處理，橫切成厚度為5 μm的切片，用于勞克堅(jiān)藍(lán)染色和免疫熒光檢測(cè)。另一部分用于透射電鏡超微結(jié)構(gòu)的觀察。

2.2.5? 坐骨神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)觀察? 坐骨神經(jīng)用電鏡液4 ℃固定保存，然后將樣本送至首都醫(yī)科大學(xué)電鏡中心進(jìn)行透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。

2.2.6? 勞克堅(jiān)藍(lán)染色（Luxol fast blue， LFB）分析坐骨神經(jīng)脫髓鞘現(xiàn)象? 坐骨神經(jīng)經(jīng)過脫蠟水化處理后，使用勞克堅(jiān)藍(lán)染液37 ℃孵育過夜。使用95%乙醇漂洗，并浸泡在碳酸鋰中反應(yīng)5 s，繼續(xù)使用70%乙醇浸泡10 s。脫水透明后，使用中性樹膠封片，每樣本隨機(jī)選取6個(gè)不同區(qū)域，使用NIS-Elements BR 3.0 system進(jìn)行拍片（40×），并對(duì)坐骨神經(jīng)髓鞘區(qū)域進(jìn)行積分密度測(cè)定，在分析時(shí)采用積分光密度（integral optical density， IOD）一欄數(shù)據(jù)反應(yīng)坐骨神經(jīng)髓鞘積分密度，輸入SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。髓鞘積分密度低時(shí)，產(chǎn)生脫髓鞘現(xiàn)象。

2.3? Western blot法分析坐骨神經(jīng)中相關(guān)蛋白

將坐骨神經(jīng)置于RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）中勻漿，離心10 min（4 ℃， 12 000 r/min），吸取上清液，使用bicinchoninic acid （BCA）試劑盒測(cè)定蛋白濃度后制備樣本。在12% SDS-PAGE凝膠孔中加入等量（30 μL）蛋白進(jìn)行電泳分離，并使用半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉將PVDF膜室溫孵育2 h并使用相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜，TBS-T浸洗后，繼續(xù)室溫孵育山羊抗小鼠或山羊抗兔抗體1 h，使用TBS-T浸洗后，加入超敏發(fā)光液后進(jìn)行暗室曝光，在膠片上形成圖像。使用β-actin抗體作為內(nèi)參。用image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行定量分析。使用一抗如下：小鼠單克隆抗體GRP 78（1∶1 000），CHOP （1∶500），Bcl-2（1∶1 000）和Bax （1∶1 000），兔多克隆抗體PGP 9.5（1∶2 000），XBP-1（1∶2 000）和P-eIF2α （1∶1 000）。

2.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用“x±s”描述，多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊性選擇LSD分析，方差不齊性選擇Tambane's T2分析。各種檢驗(yàn)的顯著性水平均設(shè)定為P<0.05。

3 結(jié)果

3.1? 糖絡(luò)寧對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變模型的影響

3.1.1? 糖絡(luò)寧對(duì)DPN大鼠HOMA-IR的影響? HOMA-IR升高表明發(fā)生了胰島素抵抗，是DPN發(fā)生的主要誘導(dǎo)因素[11]。大鼠經(jīng)誘導(dǎo)高血糖成模12周后，Model組HOMA-IR與Control組相比顯著升高（P<0.01）， LTLN組和HTLN組HOMA-IR與Model組相比顯著降低（P<0.01），表明糖絡(luò)寧能夠降低HOMA-IR。見圖1。

3.1.2? 糖絡(luò)寧對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)的影響? 如圖2A，Control組坐骨神經(jīng)纖維排列整齊，密度均一且無泡沫細(xì)胞。Model組中，髓鞘纖維松弛，出現(xiàn)部分脫髓鞘且有大量泡沫細(xì)胞。LTLN組和HTLN組與Model組相比，髓鞘纖維松弛和髓鞘脫失現(xiàn)象均有所減輕。在坐骨神經(jīng)勞克堅(jiān)藍(lán)染色結(jié)果中，Control組髓鞘排列緊密，分布均勻，無脫髓鞘現(xiàn)象。Model組中，髓鞘排列松散，分布不均，并有嚴(yán)重的脫髓鞘現(xiàn)象。如圖2B，LTLN組和HTLN組髓鞘排列趨于整齊，分布趨于均勻，脫髓鞘現(xiàn)象也有所減輕。如圖2D，與Control組相比，Model組髓鞘積分密度顯著下降，LTLN組和HTLN組與Model組相比顯著升高（P<0.05）。PGP 9.5蛋白能夠特異性的標(biāo)記神經(jīng)元和神經(jīng)纖維，與Control組相比，Model組PGP 9.5蛋白表達(dá)降低，與Model組相比，LTLN組和HTLN組PGP 9.5蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），見圖2E。

3.1.3? 糖絡(luò)寧對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)功能的影響? ?NCV的降低和TPT的升高是DPN的病理特征[12]。與Control組相比，高血糖模型成立12周后Model組NCV（包括MNCV和SNCV）顯著降低（P<0.01）。與Model組相比，LTLN組和HTLN組NCV顯著升高（P<0.01，P<0.05）。誘導(dǎo)高血糖成模12周后，Model組痛閾值與Control組相比顯著升高（P<0.01）。LTLN組TPT與Model組相比顯著降低（P<0.05）。見圖3。

3.2? 糖絡(luò)寧對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)ER stress誘導(dǎo)的凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Control組比較，Model組CHOP、Bcl-2、Bax、 GADD 34和Ero1α的表達(dá)顯著升高（P<0.05，P<0.01）;與Model組比較，LTLN組和HTLN組CHOP、Bax、GADD34和Ero1α表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01），Bcl-2表達(dá)顯著升高（P<0.01）。見圖4C-E。

與Control組相比，Model組GRP 78、IRE1α/P-IRE1α和XBP-1顯著升高（P<0.05，P<0.01），表明ER stress已經(jīng)發(fā)生。Model組P-eIF 2α與Control組相比顯著降低（P<0.01）。與模型組相比，LTLN組和HTLN組GRP 78和P-eIF 2α表達(dá)顯著升高（P<0.05，P<0.01），IRE1α/P-IRE1α和XBP-1表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見圖5C-E。

4 討論

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，具有高發(fā)病率與高致殘率的特點(diǎn)。高血糖是DPN發(fā)病的始動(dòng)因素，經(jīng)典的DPN發(fā)病途徑包括多元醇途徑、氧化應(yīng)激、己糖胺途徑等。近年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是DPN發(fā)病的重要發(fā)病機(jī)制。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是調(diào)控蛋白合成和聚集的場(chǎng)所[13]。蛋白質(zhì)在ER中經(jīng)折疊修飾成為具有活性的功能蛋白質(zhì)。只有正確折疊的蛋白質(zhì)才能被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，而錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)留在ER中繼續(xù)完成折疊過程。高血糖導(dǎo)致未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白蓄積在ER中，引發(fā)ER stress。ER stress通過未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）使ER恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。但當(dāng)ER stress持續(xù)時(shí)間過長時(shí)，UPR則不能減輕ER stress，ER stress誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑會(huì)被激活[14]。TMAO是天然化學(xué)伴侶[15]，能夠吸引伴侶蛋白治療蛋白質(zhì)折疊類疾病，清除錯(cuò)誤蛋白在ER異常積累，防止細(xì)胞凋亡，是減輕ER stress的常用實(shí)驗(yàn)研究藥物[16]。

GRP 78作為UPR伴侶蛋白，能夠促進(jìn)錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)進(jìn)行正確折疊[17]，也有維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，延長不利因素刺激下的細(xì)胞生存期的作用。ER stress發(fā)生時(shí)，未折疊蛋白的堆積使GRP 78從膜蛋白上解離，與結(jié)合未折疊蛋白結(jié)合。而IRE1α作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白，游離狀態(tài)時(shí)會(huì)形成二聚體并產(chǎn)生自身磷酸化作用，磷酸化的IRE1α能夠剪接轉(zhuǎn)錄因子X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein1，XBP1）前體mRNA分子中的內(nèi)含子[18]。XBP1的持續(xù)表達(dá)激活位于細(xì)胞核中的ERS凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP。CHOP是ER stress誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中最重要的標(biāo)志性蛋白[19]。過表達(dá)的CHOP能夠上調(diào)Bcl-2家族中促凋亡因子Bax并下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2[20]。研究表明，促凋亡蛋白如Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是細(xì)胞凋亡重要的調(diào)節(jié)器[21]，抑制Bcl-2會(huì)破壞ER膜的完整性和Ca2+的平衡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CHOP還可以誘導(dǎo)Ero1α表達(dá)引起細(xì)胞凋亡[22]。此外，CHOP能夠激活GADD 34的表達(dá)，磷酸化的eIF2α能夠減緩甚至?xí)和ｅe(cuò)誤蛋白的合成，但是GADD 34的表達(dá)會(huì)使eIF2α去磷酸化，從而使得錯(cuò)誤蛋白繼續(xù)合成，加重ER stress[23]。

本實(shí)驗(yàn)中，糖絡(luò)寧能夠促進(jìn)GRP 78的表達(dá)，這與Gu J等人[24]的發(fā)現(xiàn)是相同的，同時(shí)也證明DPN發(fā)生時(shí)ER stress參與其病變過程。我們發(fā)現(xiàn)糖絡(luò)寧能抑制IRE1α和XBP-1的表達(dá)，從而抑制CHOP的表達(dá)，表明糖絡(luò)寧能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的IRE1α-XBP-1-CHOP通路。同時(shí)糖絡(luò)寧通過增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)，顯示糖絡(luò)寧能夠調(diào)節(jié)IRE1α-XBP-1-CHOP通路引起細(xì)胞凋亡的兩個(gè)重要蛋白因子而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外糖絡(luò)寧能夠抑制GADD 34、Ero1α的表達(dá)，增強(qiáng)eIF 2α的磷酸化，再次表明糖絡(luò)寧能夠抑制ER stress誘導(dǎo)IRE1α-XBP-1-CHOP通路的細(xì)胞凋亡。

脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)蛋白分布在ER上，高脂飼料喂養(yǎng)會(huì)使脂質(zhì)代謝異常，導(dǎo)致蛋白合成異常，從而使得錯(cuò)誤或未折疊蛋白在ER腔內(nèi)堆積，誘發(fā)ER stress的發(fā)生[25]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[26]表明，糖絡(luò)寧能夠減輕血糖和血脂水平，從而減輕ER stress。ER stress的發(fā)生還會(huì)誘導(dǎo)IR的發(fā)生，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖絡(luò)寧能夠降低HOMA-IR，也表明糖絡(luò)寧有助于減輕ER stress。神經(jīng)傳導(dǎo)速度和痛閾值的改變能夠反映DPN神經(jīng)功能損傷的嚴(yán)重程度，本試驗(yàn)結(jié)果表明，糖絡(luò)寧能夠通過增加坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，降低鼠尾熱痛閾值來改善DPN大鼠神經(jīng)功能的障礙。PGP 9.5蛋白廣泛存在于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，能夠特異性的標(biāo)記神經(jīng)元和神經(jīng)纖維，PGP 9.5蛋白表達(dá)下降表明神經(jīng)纖維受到損傷，本試驗(yàn)結(jié)果表明，糖絡(luò)寧能夠增加PGP 9.5蛋白的表達(dá)，改善神經(jīng)纖維損傷。脫髓鞘是DPN的典型病理改變[27]，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明糖絡(luò)寧能夠改善坐骨神經(jīng)的脫髓鞘。ER stress是髓鞘損傷的一個(gè)重要的病理機(jī)制，因此，糖絡(luò)寧能夠改善DPN與影響ER stress凋亡途徑中IRE1α-XBP-1-CHOP通路密切相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖絡(luò)寧能夠降低HOMA-IR，改善DPN大鼠的結(jié)構(gòu)和功能，糖絡(luò)寧防治DPN的作用機(jī)理與改善ER stress誘導(dǎo)的IRE1α-XBP-1-CHOP凋亡途徑有關(guān)，主要為抑制ER stressIRE1α-XBP-1-CHOP凋亡途徑相關(guān)蛋白CHOP、GADD 34、Ero1α和Bax的表達(dá)，增強(qiáng)GRP 78、P-eIF 2α和Bcl-2的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

[1] VINCENT A M CBC， SMITH A L， FELDMAN E L. Diabetic neuropathy： cellular mechanisms astherapeutic targets[J]. Nature Reviews Neurology， 2011， 7（11）：573-583.

[2] GUARIGUATA L， WHITING D R， HAMBLETON I， et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035[J]. Diabetes Research and Clinical Practice， 2014， 103（2）：137-149.

[3] FORBES J M， COOPER M E. Mechanisms of diabetic complications[J]. Physiological Reviews， 2013， 93（1）：137-188.

[4] BACK S H， KAOFMAN R J. Endoplasmic reticulum stress and type 2 diabetes[J]. Annual Review of Biochemistry， 2012， 81：767-793.

[5] 陳? 聰，喻? 嶸，吳勇軍，等.葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78在糖尿病常見慢性并發(fā)癥中的作用研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（1）：53-56.

[6] 高彥彬，周? 暉，張濤靜，等.糖絡(luò)寧治療糖尿病周圍神經(jīng)病變臨床研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（6）：1673-1677.

[7] 姚偉潔，楊鑫偉，李情琴，等.糖絡(luò)寧對(duì)STZ誘導(dǎo)DPN大鼠氧化應(yīng)激的影響[J].中國中醫(yī)急癥，2015，24（12）：2087-2089.

[8] SERGEY P W， ROMAN S， HANNA S， et al. Endoplasmic reticulum stress plays a key role in the pathogenesis of diabetic peripheral neuropathy[J]. Diabetes， 2013， 623（3）：944-952.

[9] YANG X， YAO W， LI Q， et al. Mechanism of Tang Luo Ning effect on attenuating of oxidative stress in sciatic nerve of STZ-induced diabetic rats [J]. Journal of Ethnopharmacology， 2015， 174 （11）：1-10.

[10] DING Y， DAI X， ZHANG Z， et al. Proanthocyanidins protect against early diabetic peripheral neuropathy by modulating endoplasmic reticulum stress[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry， 2014， 25（7）：765-772.

[11] 楊鑫偉，姚偉潔，史浩田，等.糖痹康對(duì)DPN大鼠山梨醇通路的影響[J].北京中醫(yī)藥，2016，35（1）：45-48

[12] ZHOU L， DING S， LI Y， et al. Endoplasmic Reticulum Stress May Play a Pivotal Role in Lipid Metabolic Disorders in a Novel Mouse Model of Subclinical Hypothyroidism[J]. Scientific Reports， 2016， 6：31381.

[13] BAO L， CAI X， DAI X， et al. Grape seed proanthocyanidin extracts ameliorate podocyte injury by activating peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1alpha in low-dose streptozotocin-and high-carbohydrate/high-fat diet-induced diabetic rats[J]. Food & Function， 2014， 5（8）：1872-1880.

[14] YANG X， YAO W， LI Q， et al. Mechanism of Tang Luo Ning effect on attenuating of oxidative stress in sciatic nerve of STZ-induced diabetic rats[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2015， 174（11）：1-10.

[15] YANG X W， LIU F Q， GUO J J， et al. Antioxidation and anti-inflammatory activity of Tang Bi Kang in rats with diabetic peripheral neuropathy[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine， 2015， 15：66.

[16] CHEN W J， CAI B， CHEN H T， et al： The Role of ADIPOQ Methylation in Experimental Non-alcoholic Fatty Liver Disease[J]. Journal of Digestive Diseases， 2016，17（12）：829-836.

[17] LIU C， KE X， WANG Y， et al. The level of netrin-1 is decreased in newly diagnosed type 2 diabetes mellitus patients[J]. BMC Endocrine Disorders， 2016， 16（1）：319-326.

[18] LIN W， POPKO B. Endoplasmic reticulum stress in disorders of myelinating cells[J]. Nature Neuroscience， 2009，12（4）：379-385.

[19] NING B， DENG M， ZHANG Q， et al. beta-Asarone Inhibits IRE1/XBP1 Endoplasmic Reticulum Stress Pathway in 6-OHDA-Induced Parkinsonian Rats[J]. Neurochemical Research， 2016，

41（8）：2097-2101.

[20] LIU Q S， PANG Z R， LIU R， et al. Effective compounds group of Mongolian prescriptions BAIMAI-SAN protect against peripheral neuropathy in lower limbs of rats through neuro protective effect[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2011，135（3）：786-791.

[21] CHOI S K， LIM M， YEON S I， et al. Inhibition of endoplasmic reticulum stress improves coronary artery function in type 2 diabetic mice[J]. Experimental Physiology， 2016，101（6）：768-777.

[22] BO YU LW， BING XIAO， FANG HAN， et al. Single Proonged Stress induces ATF6 alpha-dependent Endoplasmic reticulum stress and the apoptotic process in medial Frontal Cortex neurons[J]. BMC Neuroscience， 2014，15（67）：119-128.

[23] XIONG Z， JIANG R， LI X， et al. Different Roles of GRP78 on Cell Proliferation and Apoptosis in Cartilage Development[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2015，16（9）：21153-21176.

[24] GU J， ChEN J， YANG N， et al. Combination of Ligusticum chuanxiong and Radix Paeoniae ameliorats focal cerebral ischemic in MCAO rats via endoplasmic reticulum stress-dependent apoptotic signaling pathway[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2016，187（4）：313-24.

[25] MARCINIAK J S， RON D. Endoplasmic Reticulum tress Signaling in Disease[J]. Physiological Reviews， 2006， 86（4）：340-350.

[26] 史浩田，姚偉潔，楊鑫偉，等.糖絡(luò)寧對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠PERK-CHOP-Caspase-12通路的影響.環(huán)球中醫(yī)藥2017，10（3）：269-274.

[27] LIU Q S， PANG Z R， LIU R， et al. Effective compounds group of Mongolian prescriptions BAIMAI-SAN protect against peripheral neuropathy in lower limbs of rats through neuro protective effect[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2011， 135（3）：786-791.