姜黃素對島狀皮瓣缺血再灌注損傷的影響

周全　胡建中　黃瑩　賓雨飛

〔摘要〕 目的 探討姜黃素（curcumin）對大鼠島狀皮瓣（skin flap）缺血再灌注損傷（lschemia-reperfusion injury）的保護(hù)作用。方法? 將105只SD大鼠隨機(jī)平均分成3組（n=35），每組按術(shù)后6、10、20、30 h及7 d分為5個亞組（n=7）。對照組（Ⅰ組）：不做缺血再灌注處理。缺血再灌注組（Ⅱ組）：手術(shù)當(dāng)天至術(shù)后7 d，每日腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.4 mL/kg。姜黃素治療組（Ⅲ組）：將生理鹽水替換為姜黃素注射液50 mg/kg。在以大鼠旋髂深血管皮支（deep circumflex iliac vessels）為蒂的背部島狀皮瓣缺血再灌注損傷模型上，分別測定皮瓣組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。并對皮瓣進(jìn)行圖像分析，觀察皮瓣存活率。結(jié)果 與Ⅰ組進(jìn)行比較，Ⅱ組MDA含量及MPO活性明顯升高（P<0.01），SOD活性明顯降低（P<0.01）。與Ⅱ組進(jìn)行比較，Ⅲ組MDA含量及MPO活性明顯降低（P<0.01），SOD活性表達(dá)明顯升高（P<0.01）。術(shù)后7 d皮瓣存活率為Ⅰ組>Ⅲ組>Ⅱ組（P<0.01）。結(jié)論 姜黃素具有抗炎、抗氧化、提高清除氧自由基能力的作用，減輕皮瓣缺血再灌注損傷，促進(jìn)皮瓣存活。

〔關(guān)鍵詞〕 姜黃素;皮瓣;缺血再灌注;丙二醛;髓過氧化物酶;超氧化物歧化酶

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.01.006

Effect of Curcumin on Ischemia-Reperfusion Injury in Rat Island Skin Flaps

ZHOU Quan1， HU Jianzhong1*， HUANG Ying2， BIN Yufei3

（1. Xiangya Hospital of Central South University， Changsha， Hunan 410005， China; 2. The First Affiliated

Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 3. Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the protective effect of curcumin against ischemia-reperfusion injury in rat island skin flaps. Methods A total of 105 Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups （n=35 for each group）; each group was divided into five subgroups （n=7 for each group） according to the time after operation （6 h， 10 h， 20 h， 30 h， and 7 d）. The control group （group I） was not subjected to any ischemia-reperfusion treatment except an intraperitoneal injection of normal saline at a dose of 0.4 ml/kg daily from the day of operation to 7 days after operation. The ischemia-reperfusion group （group II） was subjected to ischemia-reperfusion treatment in addition to the same postoperative treatment as group I. The curcumin treatment group （group III） was subjected to ischemia-reperfusion treatment in addition to the same postoperative treatment as group I except that normal saline was replaced by curcumin injection （50 mg/kg）. The activities of superoxide dismutase （SOD） and myeloperoxidase （MPO） and the content of malondialdehyde （MDA） were measured in a rat model of ischemia-reperfusion injury in the dorsal island flaps pedicled to the deep circumflex iliac vessels. The viability of the skin flaps was evaluated by analyzing the flaps. Results Compared with group I， group II had significant increases in both the content of MDA and the activity of MPO （P<0.01）， but a significant decrease in SOD activity （P<0.01）. Compared with group II， group III had significant decreases in both the content of MDA and the activity of MPO （P<0.01）， but a significant increase in SOD activity （P<0.01）. The viability of the skin flaps 7 days after operation was highest in group I， followed by group III and then group II， with significant differences observed between the groups （P<0.01）. Conclusion Curcumin has anti-inflammatory and antioxidant effects， as well as the ability to enhance oxygen free radical scavenging， which together alleviate ischemia-reperfusion injury of skin flaps and improve their viability.

〔Keywords〕 curcumin; skin flap; ischemia-reperfusion; malondialdehyde; myeloperoxidase; superoxide dismutase

缺血再灌注損傷長久以來一直影響著組織及皮瓣移植后能否存活，是皮瓣外科中的研究熱點(diǎn)，但其復(fù)雜機(jī)制目前尚未完全清楚。大量研究表明，中性粒細(xì)胞的浸潤和氧自由基淤積在缺血再灌注損傷中起著極其重要的作用[1-2]。姜黃素提取自郁金、姜黃等姜黃屬中藥的塊莖中，是一種具有抗氧化、抗炎、清除自由基等作用的酚類色素，其防治缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)及臨床研究已涉及到心、肺、腦等臟器，但用于皮瓣移植仍少見報(bào)道[3-5]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察姜黃素對大鼠背部缺血再灌注皮瓣組織存活面積及組織生化的影響，探討其作用機(jī)制，以期確定姜黃素在提高皮瓣移植術(shù)后存活率中的作用，為其臨床實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動物

健康雌性SD大鼠105只，體質(zhì)量200～250 g，湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物公司提供，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。室溫（23±2）℃，濕度60%～70%，分籠飼養(yǎng)，統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)飼料，隨意食水，適應(yīng)一周。實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求處置動物。

1.2? 主要試劑

姜黃素干粉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%，德國sigma公司）。二甲基亞砜（德國sigma公司）。大鼠髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、考馬斯亮蘭蛋白檢測試劑盒及SOD檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所提供）。

1.3? 主要儀器

HR-200電子天平（日本日立公司），756MC紫外分光光度儀（上海儀器廠），Leica M665手術(shù)顯微鏡（美國萊卡公司），HITACHI 20PR-520型低溫高速離心機(jī)（日本日立公司），Canon數(shù)碼相機(jī)（日本Canon公司），微量移液器（美國Gilson公司）

1.4? 姜黃素溶液的制備

取姜黃素粉末0.1 g，加入1 mL二甲基亞砜助溶，再用微量移液槍逐漸加0.9%無菌生理鹽水定容至10 mL溶液，反復(fù)吹打，使其充分溶解，制得溶液每1 mL中含姜黃素100 mg。

1.5? 皮瓣缺血再灌注損傷造模

腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（35 mg/kg）麻醉動物，按照M Takikawa ，Y Sumi 等描述的方法[6-7]，于大鼠背側(cè)右下部形成一個以旋髂深血管皮支為蒂的島狀皮瓣，大小為3.0 cm×6.0 cm。充分游離旋髂深血管皮支，并切斷結(jié)扎其他穿支，以保證其唯一供血，以無損傷血管夾夾閉旋髂深血管皮支近段發(fā)出部位，4.5倍手術(shù)顯微鏡觀察并確定血流被完全阻斷后，以每小時10%水合氯醛（5 mg/kg）腹腔內(nèi)注射保持麻醉狀態(tài)，烤燈保溫，5 h后移除動脈夾，再次手術(shù)顯微鏡觀察并確認(rèn)血流通暢恢復(fù)，提示皮瓣缺血再灌注損傷成功造模，以3～0絲線原位縫合皮瓣。術(shù)后動物單籠飼養(yǎng)，禁食水6 h。

1.6? 動物分組與干預(yù)[7]

將105只SD大鼠統(tǒng)一編號后按數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，35只/組。每組按術(shù)后6、10、20、30 h及7 d分為5個亞組（n=7）。（1）對照組（Ⅰ組）：沿大鼠背部中軸，雙髖連線切取長6.0 cm、寬3.0 cm島狀皮瓣，切斷結(jié)扎其他血管，充分游離并僅保留旋髂深血管皮支，原位縫合皮瓣。術(shù)后當(dāng)天到術(shù)后7 d，連續(xù)干預(yù)，每天1次腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.4 mL/kg。（2）缺血再灌注組（Ⅱ組）：按Ⅰ組方法制作皮瓣并游離旋髂深血管皮支，無損傷動脈夾夾閉并確認(rèn)血流阻斷，維持麻醉，烤燈保溫，5 h后去除血管夾，原位縫合皮瓣。術(shù)后當(dāng)天到術(shù)后7 d，連續(xù)干預(yù)，每天1次腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.4 mL/kg。（3）姜黃素治療組（Ⅲ組）：皮瓣造模同Ⅱ組，術(shù)后當(dāng)天到術(shù)后7 d，連續(xù)干預(yù)，每天1次腹腔內(nèi)姜黃素注射液50 mg/kg。

1.7? 標(biāo)本取材及處理

Ⅰ組于術(shù)后6、10、20、30 h分別于皮瓣中段邊緣取全層皮瓣組織0.3 cm×0.6 cm。Ⅱ組、Ⅲ組于術(shù)后6 h（再灌注1 h）、10 h（再灌注4 h）、20 h（再灌注15 h）、30 h（再灌注25 h）同法取材。所取組織部分制成2%、5%組織勻漿，離心后冰凍保存上清液待做生化檢測。術(shù)后7 d，觀察每組剩余7只大鼠皮瓣大體情況并攝像，硫酸紙稱重法計(jì)算皮瓣成活率。

1.8? 觀察指標(biāo)

1.8.1? 組織生化檢測? 按試劑盒說明書，比色法測定MPO，WST-1法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，TBA法測定MDA含量，上述指標(biāo)均用皮瓣組織中蛋白含量（考馬斯亮蘭蛋白定量法測得）校正。

1.8.2? 皮瓣成活率? 術(shù)后7 d，用硫酸紙描下皮瓣存活面積及皮瓣總面積，硫酸紙稱重法計(jì)算皮瓣成活率[8]。

皮瓣成活率=皮瓣成活部分硫酸紙質(zhì)量/皮瓣總面積硫酸紙質(zhì)量×100%

1.9? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。皮瓣存活率以“x±SD”描述，經(jīng)哈特萊最大F值法檢驗(yàn)，方差不齊（P<0.05），故采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法H檢驗(yàn)（Kruskal-wallis法）分析。組間兩兩比較采用統(tǒng)計(jì)量為？字2值的Nemenyi檢驗(yàn)，結(jié)論均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織生化指標(biāo)多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。使用Levene檢驗(yàn)判斷方差是否齊性，方差不齊性時采用Welc法。均數(shù)間的多重比較采用Q檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果用“x±s”表示，結(jié)論判斷以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 實(shí)驗(yàn)動物樣本量分析

105只實(shí)驗(yàn)SD大鼠全部進(jìn)入結(jié)果分析，無脫失。

2.2? 皮瓣大體情況及成活率

對照組、缺血再灌注組、姜黃素治療組皮瓣大體觀察見圖1?？瞻讓φ战M皮瓣存活情況良好，毛發(fā)正常持續(xù)生長，縫合皮緣愈合良好，皮瓣彈性同正常皮膚;缺血再灌注組壞死發(fā)黑面積大于對照組及姜黃素治療組，毛發(fā)稀疏，部分脫落，皮瓣縫合邊緣大部未愈合，皮瓣硬結(jié)如板狀;姜黃素治療組僅有皮瓣周邊部分縫合區(qū)，皮瓣遠(yuǎn)軸心血管處有壞死情況，中央部分雖因姜黃素黃染，但并無壞死發(fā)黑現(xiàn)象。毛發(fā)有部分脫落。

皮瓣存活率見表1。Ⅰ組（對照組）>Ⅲ組>Ⅱ組，Ⅲ組皮瓣存活率大于Ⅱ組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.3? 組織生化SOD、MDA、MPO測定結(jié)果

Ⅱ組、Ⅲ組于再灌注后1、5、15、25 h（即術(shù)后6、10、20、30 h），Ⅰ組于術(shù)后6、10、20、30 h，MDA含量呈現(xiàn)為Ⅱ組>Ⅲ組>Ⅰ組，組間比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

Ⅱ組與Ⅰ組比較，術(shù)后6 h時MPO活性升高（P<0.05），術(shù)后10、20、30 h時MPO活性明顯升高（P<0.01）。Ⅲ組與Ⅱ組比較，術(shù)后6 h時MPO含量降低（P<0.05），術(shù)后10、20、30 h時MPO活性明顯降低（P<0.01）。見表3。

Ⅱ組、Ⅲ組于再灌注后1、5、15、25 h（即術(shù)后6、10、20、30 h），Ⅰ組于術(shù)后6、10、20、30 h，SOD活性呈現(xiàn)為：Ⅲ組>Ⅰ組>Ⅱ組，各組間比較差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表4。

3 討論

中藥姜黃是姜科姜黃屬多年生草本植物，取根莖入藥，其性溫?zé)o毒。具有活血行氣、止痛通經(jīng)、抗菌降壓等功效。現(xiàn)代藥理研究表明，姜黃具有抑制血小板聚集、鎮(zhèn)痛、抗NO、抗氧化、抗炎等多種作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在中醫(yī)臨床各科。姜黃屬植物主要含姜黃素類和揮發(fā)油，前者為二苯基庚羥類，分為酚性和非酚性類。其中的姜黃素是中藥姜黃的主要有效成分[9]。姜黃素的分子結(jié)構(gòu)中同時具有酚和β二酮結(jié)構(gòu)，其酚性羥基可以捕獲并清除自由基。姜黃素捕獲自由基后經(jīng)過氧化反應(yīng)會產(chǎn)生姜黃素的二聚體，該二聚體具有穩(wěn)定的二氫呋喃結(jié)構(gòu)，在姜黃素的抗氧化過程中起重要作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等的缺血再灌注損傷中，姜黃素均有顯著的防治作用[10]。但在整形外科，姜黃素如何影響及作用于皮瓣移植后的缺血再灌注損傷尚不十分明確。同時姜黃素不易溶于水，易溶于二甲基亞砜、乙醇等有機(jī)溶劑中，本實(shí)驗(yàn)選擇了二甲基亞砜助溶，而二甲基亞砜屬于有毒性溶劑[11]，如何安全有效制備姜黃素注射液還有待于進(jìn)一步研究。

自由基是生物體新陳代謝時產(chǎn)生的基團(tuán)，具有高度氧化活性，起著調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號傳遞、細(xì)胞生長、抑制細(xì)菌等作用。但如果體內(nèi)自由基累積過多時，又會對細(xì)胞產(chǎn)生高度毒性，損壞DNA或阻礙DNA修復(fù)，對細(xì)胞造成顯著的損傷[12]。氧自由基的大量產(chǎn)生及體內(nèi)氧自由基清除速度下降是缺血再灌注損傷發(fā)生的重要因素之一[13]。隨著再灌注過程的發(fā)生，組織中的氧自由基大量堆積，引起組織細(xì)胞損傷[14]。而MDA、SOD等均是反映氧自由基淤積而引起細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。MDA是機(jī)體中組織脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其反映了脂質(zhì)過氧化程度以及氧自由基的含量。SOD是組織中的自由基清除劑，對于及時有效清除過量氧自由基，保護(hù)細(xì)胞不受毒性氧自由基損害有重要作用。這兩項(xiàng)指標(biāo)已被廣大學(xué)者認(rèn)可并作為檢測缺血再灌注損傷的可靠依據(jù)[15]。本實(shí)驗(yàn)中SOD呈現(xiàn)為：Ⅲ組>Ⅰ組>Ⅱ組，MDA呈現(xiàn)為：Ⅱ組>Ⅲ組>Ⅰ組，由此可見姜黃素能夠抑制大量氧自由基的釋放，促進(jìn)氧自由基的清除，有效減輕皮瓣組織缺血再灌注損傷，提高其存活率。

髓過氧化物酶存在于中性粒細(xì)胞（PMNs）的嗜天青顆粒中，是其特異標(biāo)志物。通過測定組織中MPO活性可以靈敏和定量的反映PMNs的含量，所以MPO活性已經(jīng)廣泛應(yīng)用于測定組織缺血再灌注損傷后PMNs的浸潤程度[16]。已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，姜黃素是有效的抗炎、抗氧化劑， 當(dāng)炎癥發(fā)生時，姜黃素可以抑制能夠產(chǎn)生活性氧簇酶類的活性，如脂肪氧化酶（LOX）、環(huán)氧化酶（COX-1、COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）。同時也可以抑制多種炎性因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ）[17-18]。亦有研究表明，姜黃素也通過抑制轉(zhuǎn)錄因子如核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB），激活蛋白-1（AP-1）而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。且S Cuzzocrea等已經(jīng)證實(shí)抗炎及抗氧化可有效減輕缺血再灌注損傷[19-20]。本實(shí)驗(yàn)中，MPO呈現(xiàn)為：Ⅱ組>Ⅲ組>Ⅰ組，說明姜黃素可以有效減輕炎癥后中性粒細(xì)胞浸潤，降低炎癥反應(yīng)對缺血皮瓣組織的損傷，從而提高其存活率。但姜黃素減輕中性粒細(xì)胞浸潤程度在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中對于不同細(xì)胞器是否有區(qū)別、是通過何種通路影響MPO活性等仍然需要進(jìn)一步研究。

通過本實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)：姜黃素具有抗氧化與提高機(jī)體自身清除氧自由基的作用，可有效減輕缺血再灌注皮瓣中過量氧自由基帶來的損傷;姜黃素具有抗炎作用，可有效減少中性粒細(xì)胞浸潤，從而減輕缺血再灌注皮瓣因炎癥浸潤造成的損傷;姜黃素可以有效減輕大鼠背部島狀皮瓣缺血再灌注損傷，從而提高皮瓣存活率。

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