苗藥小血藤對缺血性腦卒中大鼠的作用研究

王勝 龔毅 袁青青 劉曉龍 錢海兵

[摘要]目的研究苗藥小血藤對缺血性腦卒中大鼠的治療作用，并初步探討其可能的作用機制。方法用改良線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞（middlc cerebral artery occlusion，MCAO）模型。將造模成功的大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、陽性組、苗藥小血藤高、中、低劑量組（3.75、1.875、0.9375g/kg），給予相應(yīng)藥物1次/d灌胃給藥，連續(xù)7d。TTC染色觀察腦梗死面積;試劑盒檢測血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量;HE染色觀察腦組織病理改變。結(jié)果與模型組比較，小血藤水煎液各劑量組腦梗死面積明顯減少（P<0.05），大鼠腦組織勻漿中所含SOD活性顯著提高（P<0.05）;MDA含量顯著降低（P<0.05）;HE染色發(fā)現(xiàn)，小血藤水煎液各劑量組可一定程度上改善MCAO大鼠海馬區(qū)病理損傷。結(jié)論小血藤水煎液對MCAO導(dǎo)致的腦缺血大鼠可以減少梗死面積，促進其神經(jīng)功能恢復(fù)，對缺血造成的損傷具有一定的保護作用，其機制可能與小血藤抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]小血藤;缺血性腦卒中;超氧化物歧化酶;丙二醛

[中圖分類號]R255.2[文獻標(biāo)志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.009

苗藥小血藤，為茜草科（Rubiaceae）茜草屬RubiaLinn，植物茜草Rubia cordifolia L的根，其主要功效為涼血止血，活血化瘀。小血藤在苗族地區(qū)被廣泛運用于體虛血少患者，治月經(jīng)不調(diào)、鼻腔出血以及痔瘡等。前期藥理學(xué)研究表明，其具有保護神經(jīng)、抗炎免疫、解聚血小板聚集等作用，所含茜草多糖具有延緩腦細(xì)胞衰老的作用，可通過上調(diào)Bel-2蛋白的表達，保護線粒體避免cyt C的釋出，提高線粒體Ca²⁺緩沖含量，從而達到抑制腦細(xì)胞凋亡的作用。本研究擬觀察小血藤對缺血腦損傷大鼠的保護作用，并初步探討其可能的機制，以期為后續(xù)進行小血藤抗腦缺血藥物的研究提供藥理學(xué)研究基礎(chǔ)。

1材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2014-0011。飼養(yǎng)室溫20-25℃，濕度50%-70%，實驗動物術(shù)前1周進行適應(yīng)性飼養(yǎng)，體質(zhì)量（270±20）g。

1.2藥物

苗藥小血藤由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室提供（水煎濃縮液相當(dāng)于生藥材1s/mL，4℃保存?zhèn)溆茫?尼莫地平片，亞寶藥業(yè)集團股份有限公司（批號20181024）。

1.3 試劑

水合氯醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司（批號20180627）;HE染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司（批號20180820）;TTC染劑，北京索萊寶科技有限公司（批號10110031）;MDA測定試劑盒，南京建成生物工程研究所（批號20181226）;SOD測定試劑盒，南京建成生物工程研究所（批號20181220）。

1.4 儀器

酶標(biāo)儀（北京新風(fēng)機電技術(shù)公司）：組織包埋機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）;組織切片機（萊卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易公司）;電子天平（北京艾科勒有限公司）;隔水式電熱恒溫箱（蘇州威爾實驗用品有限公司）;醫(yī)用離心機（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）;移液器（德國Eppendorf公司）。

2方法

2.1 造模及造模成功判定

參照Longa改良線栓法制備大鼠右側(cè)永久性大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）動物實驗?zāi)Ｐ?。造模?4h，采用盲法進行神經(jīng)功能評分（參照Bederson和Longa等5級4分的評分篩選法）。1-3分的大鼠即造模成功。將得0分和4分者剔除。

0分：無神經(jīng)功能缺損，提起鼠尾懸空時兩前肢向地面伸直：1分：輕微神經(jīng)功能缺損，提起鼠尾懸空時手術(shù)對側(cè)前肢屈曲，肩內(nèi)收，前臂伸直;2分：中度神經(jīng)功能缺損，向病灶對側(cè)轉(zhuǎn)圈的現(xiàn)象：3分：重度神經(jīng)功能缺損，向手術(shù)對側(cè)傾倒，無法行走;4分：無自主活動伴意識障礙。

2.2 分組及給藥方法

將造模成功的MCAO大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組，陽性組，苗藥小血藤高、中、低劑量組，每組10只：術(shù)后24h，每組大鼠開始給予相應(yīng)藥物干預(yù)，1次/d，灌胃給藥，連續(xù)7d：小血藤水煎液高、中、低劑量組按3.75、1.875、0.9375g（kg·d）灌胃（分別相當(dāng)于人臨床擬用量的15倍、7.5倍、3.75倍）：陽性組給予尼莫地平片水溶液，15mg（kg·d）灌胃（相當(dāng)于人臨床擬用量的7.5倍）：假手術(shù)組與模型組同體積生理鹽水灌胃。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 血清SOD、MDA測定 取材前所有大鼠禁食不禁水12h，并于末次給藥2h后稱體質(zhì)量記錄，大鼠仰位固定，4%水合氯醛（0.75mL/100g）腹腔注射麻醉;腹主動脈取血，靜置30min后，分離出血清（3000r/min，15min），按試劑盒說明書測定血清SOD活性與MDA含量。

2.3.2TTC染色測定腦梗死面積 腹主動脈取血后，迅速斷頭，自大腦縱裂將腦剪開，放置于冰盤上取出大腦，立即放人-20℃低溫冰箱冷凍30min，剔除掉嗅球和小腦，于局灶缺血的中部做2mm冠狀切片，每只大鼠采集腦片5-6片，切好腦組織在TTC溶液中浸沒染色，37℃恒溫培養(yǎng)箱避光染色30min，每隔15min翻面1次，染色后，用4%多聚甲醛溶液將其固定。正常腦組織染色呈深紅色，梗死灶呈蒼白色。觀察并拍照記錄，用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計腦梗死面積比例。

2.3.3 腦組織病理形態(tài)觀察 將固定于4%多聚甲醛中的大鼠腦組織取出，通過常規(guī)脫水、石蠟包埋切片、HE染色、封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)變化。

2.4統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)計量資料均以“x±s”表示，采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間比較方差齊時用LSD檢驗，方差不齊時用Dunnetts T3檢驗，當(dāng)P<0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1 小血藤對大鼠血清SOD、MDA含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組SOD含量明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，給藥各組大鼠血清的SOD活力明顯上升（P<0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組MDA含量明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠血清MDA含量明顯下降（P<0.05）。結(jié)果見表1。

3.2 小血藤對腦缺血后大鼠腦梗死面積的影響

非缺血損傷腦組織TFC染色呈紅色，缺血區(qū)域腦組織TTC染色呈白色。詳見圖1。缺血面積統(tǒng)計表明，模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯手術(shù)后梗死。與模型組相比較，各給藥組大鼠腦組織梗死面積顯著減少（P<0.05）。詳見表2。

3.3 小血藤對腦缺血后大鼠腦組織病理形態(tài)改變的影響

大鼠腦組織HE染色觀察，光鏡下觀察各組大鼠海馬錐體細(xì)胞的病理改變情況。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬腦組織皮質(zhì)較薄，細(xì)胞數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)欠清晰，局灶性細(xì)胞水腫溶解，神經(jīng)元細(xì)胞染色深。與模型組比較，小血藤水煎液各劑量組和陽性組大鼠海馬區(qū)損傷減輕，細(xì)胞數(shù)量較多，排列較為整齊。詳見圖2。

4討論

腦卒中又稱中風(fēng)，是一種突發(fā)的腦血管疾病，其中缺血性腦卒中約占全部腦卒中的80%左右，主要是由于大腦血栓的形成或栓塞引起急性局部大腦供血不足導(dǎo)致，同時大腦有限的代償能力不足以彌補血液減少或中止時大腦儲存的能量衰竭引起的腦組織缺血性損傷。病理損傷可分為缺血中心區(qū)和缺血半暗帶兩類，前者腦細(xì)胞往往在缺血后不可逆壞死，后者則大腦側(cè)支循環(huán)損傷較輕，其中由葡萄糖的代謝功能障礙產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)損傷是缺血半暗帶產(chǎn)生的主要因素。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是腦卒中早期重要的損傷機制，缺血時活性氧的增加通過耗竭內(nèi)源性的抗氧化物質(zhì)，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起細(xì)胞膜、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的損傷，H₂O₂，損傷細(xì)胞膜影響細(xì)胞離子通道的通透性，增加鈣離子內(nèi)流是增加氧化損傷的因素之一。SOD作為生物體內(nèi)非常重要的抗氧化酶一種蛋白酶，SOD活性的高低反映機體清除氧自由基的能力，可減少ROS對細(xì)胞膜的損傷，降低說明體內(nèi)抗氧化能力不足，細(xì)胞將產(chǎn)生應(yīng)激性反應(yīng)從而引起氧化應(yīng)激損傷?？梢源呋趸镒杂苫缁?，清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用，也是氧化損傷中生物體內(nèi)的主要防御機制。MDA是機體內(nèi)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其在體內(nèi)的含量在一定程度上表明過氧化應(yīng)激造成的損害程度。有研究表明尼莫地平可抑制H₂O₂誘導(dǎo)的鈣超載損傷、降低血管對鈣的敏感性、抑制H₂O₂對血管的直接收縮，防止H₂O₂對血管的氧化應(yīng)激性損傷;明顯降低腦血管組織勻漿中的MDA含量，增強SOD等活性，具有一定的抗氧化保護腦損傷作用。中藥黃芪、人參等可改善腦組織代謝、抗氧化應(yīng)激，減輕腦組織損傷。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，小血藤不同劑量組大腦組織的SOD活力明顯上升（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05），表明小血藤可以減輕因缺血而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，具有一定的神經(jīng)保護作用。

缺血后腦梗死面積直接反映了損傷程度，因此對腦缺血動物模型進行腦組織梗死面積的測定對于評價腦缺血損傷程度具有重要意義。本實驗研究結(jié)果顯示，小血藤對腦缺血導(dǎo)致的腦梗死面積具有明顯的減輕作用。HE染色，在光鏡下觀察各組大鼠海馬錐體細(xì)胞的病理改變情況。結(jié)果顯示，與模型組比較，小血藤水煎液各劑量組和陽性組大鼠海馬病變程度總體較輕，提示小血藤水煎液能改善MCAO大鼠腦組織海馬損傷。

綜上表明，小血藤水煎液可明顯減少MCAO大鼠腦缺血組織的范圍和界限，在一定程度上具有改善MCAO大鼠海馬損傷的功能，其機制可能與通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的相應(yīng)指標(biāo)，提高機體抗氧化水平，增強修復(fù)能力有關(guān)，其他方面的機制是否與鈣離子通道有關(guān)等，尚待深入研究。