門氏護(hù)胃方中連翹與其他藥材配伍煎煮前后連翹酯苷A和連翹苷提取率變化的研究

梁惠珍 靳貝貝 裴香萍 門九章 李慧 魏金娜

中圖分類號 R927.2;R932 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）17-2365-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.12

摘 要 目的：考察門氏護(hù)胃方中連翹單藥及與其他藥材配伍煎煮前后連翹酯苷A和連翹苷提取率的變化。方法：采用高效液相色譜法測定連翹單味藥材（5 g×7付）、連翹（5 g×7付）與姜半夏配伍、門氏護(hù)胃方[包括連翹（5 g×7付）、姜半夏等6味藥材]經(jīng)水煎煮后藥液中連翹酯苷A和連翹苷的提取量并計(jì)算提取率。色譜柱為 Diamonsil C18，流動相為乙腈-0.2%甲酸溶液，梯度洗脫，檢測波長為278 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min。結(jié)果：連翹酯苷A與連翹苷進(jìn)樣量線性范圍分別為0.61～6.1、0.246～2.46 μg（r=0.999 7、0.999 9），在精密度、穩(wěn)定性（20 h內(nèi)）和重復(fù)性試驗(yàn)中RSD均<2%（n=6），平均回收率為96.10%～99.37%（RSD≤2.36%，n=6）;在連翹單味藥材中，連翹酯苷A和連翹苷的提取率分別為96.90%、66.67%;在連翹-姜半夏配伍樣品水煎液中，二者的提取率分別為101.61%、54.55%;在門氏護(hù)胃方樣品水煎液中，二者的提取率分別為98.39%、84.85%。結(jié)論：連翹與姜半夏配伍后連翹酯苷A的提取率增加、連翹苷的提取率略有減少;連翹與門氏護(hù)胃方中其他藥材配伍后，二者的提取率均略有增加。

關(guān)鍵詞 門氏護(hù)胃方;連翹酯苷A;連翹苷;配伍;含量測定;高效液相色譜法

Study on Changes of Extraction Rates of Forsythiaside A and Forsythin in Forsythia suspense Compatible with Other Medicinal Materials of Menshi Huwei Formula before and after Decoction

LIANG Huizhen1，JIN Beibei1，PEI Xiangping1，MEN Jiuzhang2，LI Hui3，WEI Jinna4（1.College of TCM， Shanxi University of TCM， Shanxi Jinzhong 030619， China;2.Clinical College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Shanxi University of TCM， Shanxi Jinzhong 030619， China;3.College of TCM， Heilongjiang University of TCM， Harbin 150040， China;4.College of TCM， Tianjin University of TCM， Tianjin 301617， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the changes of extraction rates of forsythiaside A and forsythin in Forsythia suspensa compatible with other medicinal material of Menshi huwei formula before and after decoction. METHODS： HPLC method was used to determine the extraction amounts and to calculate the extraction rates of forsythiaside A and forsythin in F. suspensa （5 g×7 doses）， F. suspensa （5 g×7 doses） compatible with Pinelliae rhizoma praeparatum cum zingibere et alumine （PRZA）， Menshi huwei formula [including 6 ingredients as F. suspense （5 g×7 doses）， PRZA] after decocted with water. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% formic acid solution （gradient elution）. The detection wavelength was set at 278 nm， and the column temperature was 30 ℃. The flow rate was 1.0 mL/min. RESULTS： The linear range of forsythiaside A and forsythin were 0.61-6.1， 0.246-2.46 μg （r=0.999 7， 0.999 9）， respectively; RSDs of precision， stability （within 20 h） and reproducibility tests were all lower than 2% （n=6）. Average recovery rates were 96.10%-99.37% （RSD≤2.36%，n=6） respectively. In F. suspensa， extraction rates of forsythiaside A and forsythin were 96.90% and 66.67%. In F. suspensa compatible with PRZA， extraction rates of them were 101.61% and 54.55%. In Menshi huwei formula， extraction rates of them were 98.39% and 84.85%. CONCLUSIONS： After F. suspensa is compatible with PRZA， the extraction rates of forsythiaside A is increased while forsythin is decreased. After compatible with other medicinal material in Menshi huwei formula， extraction rates of both are increased slightly.

KEYWORDS ? Menshi huwei formula; Forsythiaside A; Forsythin; Compatibility; Content determination; HPLC

門氏護(hù)胃方是山西首屆名醫(yī)門九章教授的經(jīng)驗(yàn)方，由人參、連翹、炙甘草、姜半夏等藥味組成，具有溫中止嘔、補(bǔ)脾散寒的功效，用于治療癌癥患者，特別是嘔吐嚴(yán)重的癌癥患者放化療后的胃腸道反應(yīng)。方中連翹和姜半夏均具有止嘔的作用，在該方中起著舉足輕重的作用。連翹味苦，性微寒[1-2]，其止嘔之功，在我國古代本草及醫(yī)學(xué)專著中均無記載，而有文獻(xiàn)報(bào)道其首見于日本的《皇漢醫(yī)學(xué)》中[3-4]?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)證明，連翹對多種原因?qū)е碌膼盒膰I吐均具有很好的抑制作用，如抑制化療引起的嘔吐，減少嘔吐次數(shù)[5]，還能抑制家犬皮下注射阿撲嗎啡引起的嘔吐以及順鉑所致的模型水貂的嘔吐[6]。姜半夏的鎮(zhèn)吐作用已有研究證實(shí)其水煎液能減少順鉑所致嘔吐、阿撲嗎啡所致嘔吐、洋地黃所致嘔吐等[7-8]。連翹酯苷A和連翹苷是連翹的主要有效成分，具有抗炎[9-13]、抗氧化[9，14]等藥理作用，雖然尚無文獻(xiàn)報(bào)道二者具有止嘔作用，但其抗炎作用可能與連翹的止嘔之功有著密切的關(guān)系[15]。由于相關(guān)研究較少，故本文設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用高效液相色譜法測定在門氏護(hù)胃方的復(fù)方配伍中，以及連翹與姜半夏配伍前后，煎煮液中連翹酯苷A和連翹苷提取率的變化，旨在研究該制劑中具有止嘔作用的中藥配伍前后有效成分的變化情況，以探索門氏護(hù)胃方配方的合理性。

1 材料

1.1 儀器

Waters-e2695高效液相色譜儀，包括四元泵洗脫系統(tǒng)、自動進(jìn)樣系統(tǒng)、2998光電二極管矩陣檢測器（PDA）及柱溫箱（美國Waters公司）;SB-5200 DTDN超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司）;AB-135十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;500g-11005托盤天平（慈溪市華徐衡器實(shí)業(yè)有限公司）;FA/JA1004萬分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）;FW100高速萬能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）;DHG-9075A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）;萬用電爐（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

人參（批號：20160601）、炙甘草（批號：20160401）、連翹（批號：20140210）、姜半夏（批號：20171101）、干姜（批號：20160801）、白術(shù)（批號：20160301）等藥材飲片均來源于福建承天藥業(yè)有限公司，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室主任裴香萍副教授分別鑒定為五加科植物人參（Panax ginseng C. A. Mey.）的干燥根莖、豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根莖、木犀科植物連翹[Forsythia suspensa（Thunb.）Vah]的干燥果實(shí)、天南星科植物半夏[Pinellia ternata（Thunb.）Breit.]的干燥塊莖、姜科植物姜（Zingiber officinale Rosc.）的干燥根莖、菊科植物白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz.）的干燥根莖。

連翹酯苷A對照品（批號：111810-201606，純度：≥98%）、連翹苷對照品（批號：110821-201615，純度：≥98%）均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純;水為娃哈哈純凈水;甲醇、甲酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 連翹單藥樣品粉末的制備 取連翹藥材7付量，共35 g，加10倍量的水煎煮30 min，濾過，藥渣再加8倍量水煎煮25 min，濾過，合并兩次濾液，濃縮至稠膏狀，置于60 ℃烘箱中，烘干，即得。

2.1.2 連翹-姜半夏配伍樣品粉末的制備 取連翹和姜半夏藥材7付量（連翹5 g，姜半夏9 g），共98 g，按照連翹單藥樣品的制備方法制備，即得。

2.1.3 門氏護(hù)胃方復(fù)方樣品粉末的制備 取門氏護(hù)胃方復(fù)方藥材7付量（人參6 g，干姜4 g，白術(shù)12 g，姜半夏9 g，連翹5 g，炙甘草6 g），共294 g，按照連翹單藥樣品的制備方法制備，即得。

2.1.4 連翹陰性樣品Ⅰ粉末的制備 取姜半夏藥材7付量，共63 g，按照連翹單藥樣品的制備方法制備，即得。

2.1.5 連翹陰性樣品Ⅱ粉末的制備 取缺連翹的門氏護(hù)胃方復(fù)方藥材7付量（人參6 g，干姜4 g，白術(shù)12 g，姜半夏9 g，炙甘草6 g），共259 g，按照連翹單藥樣品的制備方法制備，即得。

2.1.6 連翹和姜半夏雙陰性樣品粉末的制備 取缺連翹和姜半夏的門氏護(hù)胃方復(fù)方藥材7付量（人參6 g，干姜4 g，白術(shù)12 g，炙甘草6 g），共196 g，按照連翹單藥樣品的制備方法制備，即得。

2.2 含量測定方法

2.2.1 混合對照品貯備溶液的制備 精密稱取連翹酯苷A對照品15.25 mg、連翹苷對照品6.15 mg至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 （1）供試品溶液Ⅰ的制備。取連翹單藥樣品粉末0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min（功率：200 W，頻率：50 kHz），放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。（2）供試品溶液Ⅱ的制備。取連翹-姜半夏配伍樣品粉末1.0 g，精密稱定，按照供試品溶液Ⅰ的制備方法制備，即得。（3）供試品溶液Ⅲ的制備。取門氏護(hù)胃方復(fù)方樣品粉末3.0 g，精密稱定，按照供試品溶液Ⅰ的制備方法制備，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 （1）陰性樣品溶液Ⅰ的制備。取連翹陰性樣品Ⅰ粉末0.7 g，精密稱定，按照供試品溶液Ⅰ的制備方法制備，即得。（2）陰性樣品溶液Ⅱ的制備。取連翹陰性樣品Ⅱ粉末3.0 g，精密稱定，按照供試品溶液Ⅰ的制備方法制備，即得。（3）雙陰性樣品溶液的制備。取連翹和姜半夏雙陰性樣品粉末3.0 g，精密稱定，按照供試品溶液Ⅰ的制備方法制備，即得。

2.2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為乙腈-0.2%甲酸溶液，梯度洗脫;流速為1.0 mL/min;檢測波長為278 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10或20 μL。梯度洗脫程序見表1。

精密吸取混合對照品貯備溶液10 μL，供試品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及陰性樣品溶液Ⅰ、Ⅱ和雙陰性樣品溶液各20 μL，注入液相色譜儀中，結(jié)果陰性樣品溶液對主要成分峰均未見干擾。理論板數(shù)按連翹酯苷A、連翹苷峰計(jì)應(yīng)分別不低于5 000、3 000。色譜圖見圖1。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對照品貯備溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，置于5 mL量瓶中，分別制備成連翹酯苷A為0.061 0、0.152 5、0.244 0、0.305 0、0.457 5、0.610 0 mg/mL，連翹苷為0.024 6、0.061 5、0.098 4、0.123 0、0.184 5、0.246 0 mg/mL的對照品溶液。分別吸取上述對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，測定并記錄其峰面積。以連翹酯苷A（A）和連翹苷（B）進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為yA=856 479xA+103 552、yB=71 392xB+12 997，相關(guān)系數(shù)分別為rA=0.999 7、rB=0.999 9，表明連翹酯苷A進(jìn)樣量線性范圍為0.61～6.1 μg，連翹苷進(jìn)樣量線性范圍為0.246～2.46 μg。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品貯備溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，連翹酯苷A和連翹苷峰面積的RSD分別為0.47%、1.45%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別在0、4、8、12、16、20 h進(jìn)樣，分別測定，記錄峰面積。結(jié)果，供試品溶液Ⅰ中的連翹酯苷A和連翹苷峰面積的RSD分別為0.72%、0.56%（n=6）;供試品溶液Ⅱ中二者的峰面積的RSD分別為0.33%、1.73%（n=6），供試品溶液Ⅲ中二者的峰面積的RSD分別為0.88%、0.51%（n=6），表明供試品溶液中連翹酯苷A和連翹苷在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取連翹單藥樣品粉末0.3 g，連翹-姜半夏配伍樣品粉末1.0 g，門氏護(hù)胃方復(fù)方樣品粉末3.0 g，各6份，精密稱定，分別按供試品溶液Ⅰ制備方法制備，測定，計(jì)算含量。結(jié)果，連翹酯苷A和連翹苷在連翹單藥樣品中平均含量分別為54.95、7.72 mg/g，RSD分別為1.04%、0.40%（n=6）;在連翹-姜半夏配伍樣品中，二者的平均含量分別為17.86、1.97 mg/g，RSD分別為0.98%、0.91%（n=6）;在復(fù)方樣品中，二者平均含量分別為5.70、0.84 mg/g，RSD分別為1.53%、0.88%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取連翹單藥樣品粉末0.15 g、連翹-姜半夏配伍樣品粉末0.5 g、門氏護(hù)胃方復(fù)方樣品粉末1.5 g，各6份，精密稱定，分別加入連翹酯苷A和連翹苷對照品適量，按照供試品溶液Ⅰ制備方法制備，依法測定連翹酯苷A和連翹苷的含量。結(jié)果，二者的平均回收率為96.10%～99.37%（RSD≤2.36%，n=6），準(zhǔn)確度較好，詳見表2。

2.2.10 樣品含量測定 取連翹單藥樣品粉末0.3 g、連翹-姜半夏配伍樣品粉末1.0 g、門氏護(hù)胃方復(fù)方樣品粉末3.0 g，各3份，精密稱定，分別按供試品溶液Ⅰ制備方法制備，測定，計(jì)算樣品中連翹酯苷A和連翹苷的含量，詳見表3。

2.3 配伍前后各樣品中連翹酯苷A和連翹苷的提取量

以連翹原藥材的質(zhì)量（g）為參比，計(jì)算連翹單藥樣品、連翹-姜半夏配伍樣品、門氏護(hù)胃方復(fù)方樣品中連翹酯苷A和連翹苷的平均提取量（mg/g）;以原藥材提取量（按2015年版《中國藥典》（一部）中“連翹”項(xiàng)下的含量測定方法[1]測定的量）為參比，計(jì)算連翹單藥樣品、連翹-姜半夏配伍樣品、門氏護(hù)胃方復(fù)方樣品中連翹酯苷A和連翹苷的提取率。計(jì)算公式：樣品提取量=從樣品中提取出的成分的量/連翹原藥材的質(zhì)量;原藥材提取量=從連翹原藥材中提取出的成分的量/連翹原藥材的質(zhì)量（《中國藥典》方法[1]）;提取率=樣品提取量/原藥材提取量×100%。按《中國藥典》方法對連翹原藥材進(jìn)行測定，得到連翹酯苷A和連翹苷的平均提取量分別為8.07、1.65 mg/g。以連翹原藥材的質(zhì)量為參比，得出在連翹單藥樣品中連翹酯苷A和連翹苷的平均提取量分別為7.82、1.10 mg/g，提取率分別為96.90%、66.67%;在連翹-姜半夏配伍樣品中連翹酯苷A和連翹苷的平均提取量分別為8.20、0.90 mg/g，提取率分別為101.60%、54.55%;在門氏護(hù)胃方復(fù)方樣品中連翹酯苷A和連翹苷的平均提取量分別為7.94、1.40 mg/g，提取率分別為98.39%、84.85%。可見，連翹在與姜半夏配伍后，連翹酯苷A的提取率略有增加，而連翹苷的提取率減少;在門氏護(hù)胃方復(fù)方配伍后，二者的提取率均增加。

3 討論

從本研究結(jié)果可以得出，連翹在與姜半夏配伍后，連翹酯苷A的提取率略有增加，連翹苷的提取率略有減少;而在門氏護(hù)胃方復(fù)方配伍后，二者的提取率均略有增加，即2個(gè)成分的提取率發(fā)生了變化，尤其是連翹在與姜半夏配伍后連翹酯苷A的提取率超過了100%，推測可能是在配伍提取過程中，由于姜半夏中的皂苷等物質(zhì)的增溶助溶作用，大大增加了連翹酯苷A的提取率。而連翹苷屬于雙環(huán)氧木脂素，存在光學(xué)異構(gòu)體，煎煮過程中會受到光照、氧化和酸堿度的影響[16-17]，導(dǎo)致成分轉(zhuǎn)化、含量降低而使提取率明顯降低。因此，在與姜半夏配伍后，連翹苷可能更易受到姜半夏中酸性成分的影響，最終導(dǎo)致提取率降低。門氏護(hù)胃方復(fù)方中由于成分種類較多，影響2個(gè)成分提取率的因素更加交互錯(cuò)雜可能會增加2個(gè)成分的提取率，比如在缺連翹的陰性樣品中，以及在缺連翹、姜半夏的雙陰性樣品的圖譜中，保留時(shí)間在20 min的吸收峰明顯增大，其有可能是影響連翹和姜半夏在復(fù)方配伍中成分變化的重要因素，但其成分來源及結(jié)構(gòu)和性質(zhì)信息有待進(jìn)一步的研究。而2個(gè)成分在門氏護(hù)胃方復(fù)方配伍中的提取率增加，表明該復(fù)方配伍合理，有增強(qiáng)藥效的作用。

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（收稿日期：2019-02-15 修回日期：2019-04-22）

（編輯：劉 萍）