熱回流法優(yōu)化半楓荷總黃酮提取工藝

廖娜　梁秋玲　高幸玲　陳潔　黃初冬　韋啟球

摘??? 要： 運(yùn)用熱回流提取法制備半楓荷總黃酮，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)考察總黃酮提取的最佳工藝.研究表明： 在熱回流提取法提取半楓荷總黃酮的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇濃度80%、料液比1∶50（g/mL）、提取時(shí)間為2 h、提取溫度90 ℃，此條件下半楓荷總黃酮提取率為6.08%，RSD值為4.79%，表明該優(yōu)化工藝穩(wěn)定、可行、提取率高.

關(guān)鍵詞：總黃酮;半楓荷;熱回流法;正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R284.2??????????????? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2019.02.014

0??? 引言

半楓荷（Semiliquidambar cathayesis）是一種藥用植物，具有舒筋活血、抗炎、祛風(fēng)除濕等多種功效.半楓荷的根、莖、葉均可入藥，由于其在民間用藥療效顯著，生物活性和化學(xué)成分受到廣大研究者的關(guān)注.據(jù)研究顯示，半楓荷根中含有多酚、有機(jī)酸類、甾醇、維生素、酰胺[1]、三萜和鞣花酸衍生物等物質(zhì)[2-3].在生物活性方面，半楓荷枝干多酚具有抗菌、抗氧化活性[4]，半楓荷根提取物具有鎮(zhèn)痛、抗炎[5]、活血化瘀作用[6].

黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)是二苯基丙烷（C6-C3-C6），是自然界的天然產(chǎn)物.由于具有抗菌[7]、抗病毒[8]、抗氧化、抗炎[9]、抗癌[10]等能力，是中草藥的主要活性成分.目前，有關(guān)半楓荷的報(bào)導(dǎo)，主要集中在半楓荷根的提取物的生物活性和單體化學(xué)成分研究，而對(duì)其枝干及總黃酮成分關(guān)注甚少.本文以半楓荷枝干為原料，運(yùn)用熱回流提取法制備半楓荷總黃酮，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)考察總黃酮提取的最佳工藝.

1??? 材料與方法

1.1?? 材料、試劑與儀器

半楓荷枝干采自廣西武宣，由戴月副教授和韋運(yùn)東副教授鑒定;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度： 98%），百靈威科技有限公司;T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FA2004分析天平，上海舜宇平恒科學(xué)儀器有限公司;TDL-5000BR離心機(jī)，上?？茖W(xué)安亭儀器廠;其他試劑均為市售分析純.

1.2?? 方法

1.2.1?? 標(biāo)準(zhǔn)曲線

參考文獻(xiàn)[11-12]標(biāo)曲的制作方法，稍加修改制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.精密稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，配制成????? 0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液.量取配制好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.25 mL、2.5 mL、3.75 mL、5.0 mL、6.25 mL、7.5 mL于25 mL的容量瓶中，分別加入0.7 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min后加入0.7 mL 10% Al（NO3）3溶液，6 min后加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，定容至刻度，搖勻.15 min后于509 nm處測(cè)吸光度A.以吸光度A值為縱坐標(biāo)，濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)作圖.

1.2.2?? 半楓荷預(yù)處理

將粉碎好的半楓荷粉末用石油醚脫脂直至石油醚變?yōu)闊o色[13]，除去葉綠素等雜質(zhì)，晾干.

1.2.3?? 半楓荷總黃酮的提取

稱量約0.500 g的半楓荷粉末，加入乙醇溶液，在一定的條件下加熱回流提取[14].提取完后晾至室溫后，置于50 mL的離心管中，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min.吸取上清液至50 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，即為半楓荷總黃酮的提取液.

1.2.4?? 金縷半楓荷總黃酮含量測(cè)定

精密移取半楓荷總黃酮的提取液1 mL，置于25 mL的容量瓶中，依次加入同上的5% NaNO2、10%??? Al（NO3）3、1 mol/L NaOH，定容至刻度，搖勻.15 min后，于509 nm處測(cè)量吸光度A.提取率的計(jì)算公式如下：

[金縷半楓荷總黃酮提取率（%）=濃度×稀釋體積×提取液體積×100取樣體積×樣品質(zhì)量]

1.2.5?? 單因素分析

分別考察提取時(shí)間C（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min），乙醇濃度A（50%、60%、70%、80%、90%），提取溫度D（60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃），料液比B（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）等因素對(duì)半楓荷總黃酮提取率的影響.

1.2.6?? 正交試驗(yàn)分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)總黃酮提取率均有影響，因而采用上述4個(gè)因素為考察對(duì)象，以半楓荷總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34），重復(fù)試驗(yàn)3次.正交試驗(yàn)因素水平表設(shè)計(jì)見表1.

1.2.7?? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010處理數(shù)據(jù).

2???? 結(jié)果與討論

2.1??? 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為： y=10.829x+0.003 7， R2=0.999 7.試驗(yàn)結(jié)果見圖1，結(jié)果表明，蘆丁在0.005～0.060 mg/mL質(zhì)量濃度區(qū)間與吸光度值具有很好的相關(guān)性.

2.2?? 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1??? 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

試驗(yàn)結(jié)果見圖2，據(jù)圖2可以看出，半楓荷總黃酮提取率在提取時(shí)間0.5～1.5 h時(shí)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，半楓荷總黃酮的提取率最大，有可能是半楓荷樣品粉末與提取溶劑接觸更為充分，提取率逐漸增加.而后，隨著提取時(shí)間延長，提取率降低，可能是雜質(zhì)溶出量增多，而提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，導(dǎo)致金縷半楓荷總黃酮溶解的量變少.

2.2.2??? 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

圖3表明，半楓荷總黃酮熱回流提取率受乙醇濃度的影響很明顯.當(dāng)乙醇濃度逐漸增大時(shí)，半楓荷總黃酮提取率先是逐漸增高，而后降低.當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，提取率達(dá)到最大值，可能是半楓荷總黃酮中水溶性黃酮的含量低于醇溶性黃酮的含量，導(dǎo)致當(dāng)乙醇濃度到達(dá)80%后提取率反而呈下降趨勢(shì).

2.2.3??? 溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

隨著提取溫度的增加，半楓荷總黃酮提取率不斷增加（圖4），可能是溫度的升高有利于黃酮類物質(zhì)的溶出，當(dāng)溫度為80 ℃時(shí)達(dá)到最大值.但隨著溫度的升高，提取率略微下降，可能是因?yàn)闇囟冗^高，導(dǎo)致黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)被破壞或發(fā)生氧化.

2.2.4??? 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

隨著料液比的增加，提取率在逐漸增加（圖5），可能是溶劑的增加加快與半楓荷粉末的充分接觸，使黃酮類化合物更快的溶出.當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時(shí)，提取率不再增加.

2.3?? 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

以半楓荷總黃酮提取率為研究對(duì)象，運(yùn)用正交試驗(yàn)原理考察、分析，試驗(yàn)結(jié)果見表2.極差分析結(jié)果顯示，各因素對(duì)總黃酮提取率的影響大小依次為B>D>A>C，即料液比>提取溫度>乙醇濃度>回流時(shí)間.因此，根據(jù)試驗(yàn)的結(jié)果，選擇A2B3C3D3為最佳提取條件，即乙醇濃度80 %、料液比1∶50（g/mL）、提取時(shí)間為2 h、提取溫度90 ℃.

2.4??? 驗(yàn)證試驗(yàn)

在乙醇濃度80 %、料液比1∶50（g/mL）、提取時(shí)間為2 h、提取溫度90 ℃的試驗(yàn)條件下開展試驗(yàn).試驗(yàn)結(jié)果表明（表3），正交試驗(yàn)確定的半楓荷總黃酮最佳提取工藝穩(wěn)定、可行，半楓荷總黃酮含量高于多酚含量[4，15].

表2? 正交試驗(yàn)表及試驗(yàn)結(jié)果

Tab.2? Orthogonal array design arrangement and experimental results

[實(shí)驗(yàn)號(hào)?A /%?B /（g·mL-1）?C /h?D/°C ?總黃酮提取率/%?1?70?1∶30?1.0?70?5.72 ?2?70?1∶40?1.5?80?5.37 ?3?70?1∶50?2.0?90?6.39 ?4?80?1∶30?1.5?90?6.08 ?5?80?1∶40?2.0?70?5.77 ?6?80?1∶50?1.0?80?6.11 ?7?90?1∶30?2.0?80?5.82 ?8?90?1∶40?1.0?90?5.59 ?9?90?1∶50?1.5?70?5.48 ?K1?17.48?17.62?17.42?16.97?-?K2?17.96?16.73?16.93?17.30?K3?16.89?17.98?17.98?18.06?R?? 1.07?? 1.25?? 1.05?? 1.09?]

3??? 結(jié)論

本文以乙醇濃度、料液比、時(shí)間、溫度4個(gè)因素，應(yīng)用熱回流法進(jìn)行單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，得到最佳提取條件：即乙醇濃度80%、料液比1∶50（g/mL）、提取時(shí)間為2 h、提取溫度90 ℃.在該條件下，金縷半楓荷總黃酮提取率為6.08%，RSD值為4.79%，半楓荷總黃酮含量較高，可能是半楓荷的藥用成分.本研究所優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可行、提取率高，可為半楓荷總黃酮的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ).

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Optimization of total flavonoids extraction from Semiliquidambar

Cathayesis by refluxing method

LIAO Na， LIANG Qiuling， GAO Xingling， CHEN Jie， HUANG Chudong， WEI Qiqiu*

（Health Science Center， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545005， China）

Abstract： To optimize the total flavonoids extraction from Semiliquidambar Cathayesis， the total flavonoids of Semiliquidambar Cathayesis was extracted wih refluxing method using single factor and orthogonal test. The results showed with the optimum extraction technology of the reflux extraction method， under the condition of ethanol concentration 80%， material to liquid ratio 1∶50 （g/mL）， extraction time 2 h， and extraction temperature at 90 °C， the extraction rate of total flavonoids was 6.08%， and the RSD was 4.79%. Therefore， the optimum?extraction process was stable， feasible and?efficient.

Key words： total flavonoids; Semiliquidambar Cathayesis; fefluxing method; orthogonal test