卡松對柳州白蓮洞遺址表面霉菌的抑制作用

黃國霞　葉亮　藍小鳳　陳華英　李佳明　劉成相

摘?? 要：本文主要探究了白蓮洞遺址表面的霉菌的種類，以及卡松對分離的霉菌的抑制作用.將在遺址表面采集的土樣配制成土懸液，采用平板涂布法在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)霉菌并分離純化得到6種主要的霉菌，分別為地霉屬、根霉屬、青霉屬、毛霉屬、曲霉屬（黃曲霉、黑曲霉）.用濾紙片法考察不同濃度的卡松溶液對霉菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)對曲霉、地霉、根霉、青霉的抑菌效果良好，時效長，對毛霉的抑菌效果相對較差.

關(guān)鍵詞：白蓮洞;土遺址;霉菌;分離;鑒定

中圖分類號：Q935???????????? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2019.02.015

0??? 引言

白蓮洞遺址位于廣西柳州市東南郊12 km的白面山南麓，是華南地區(qū)一處罕見的更新世晚期至全新世早期的洞穴文化遺存（距今3.7—0.7萬年）[1].1956年由裴文中、賈蘭坡教授在廣西調(diào)查巨猿和人類化石時發(fā)現(xiàn).20世紀70—80年代在考古隊全面地清理和發(fā)掘后，出土了大量的文化遺物，其中包括人牙化石、動物化石、火坑、石器等[2-3]. 白蓮洞遺址面積超過150 m2，所處白面山海拔249.8 m，高出附近的地平面約152 m.洞口朝南，洞口高5～6 m，洞內(nèi)含文化遺存的堆積物非常豐富，約有3 m多厚，堆積物跨度為舊石器時代晚期、過渡期和新石器時代早、中期3個不同時期，是研究華南地區(qū)新舊石器時代演變十分重要、十分珍貴的實證材料[4]，也是人們了解遠古文化的重要窗口.洞內(nèi)主要文化層如圖1所示.

遺址距今歷史久遠，被發(fā)現(xiàn)之后進行了一些挖掘活動，巖體也逐步受到破壞[5]，導(dǎo)致滲水，洞內(nèi)環(huán)境有一定的濕度、溫度，空氣中含有大量霉菌孢子，所以一些藻類、地衣等低等植物以及霉菌類等在土壤表面快速繁殖生長.尤其霉菌強烈的酸解和絡(luò)解作用造成土壤松散，影響著對土遺址原始信息的保護以及保存壽命的長短[6-8].因此，弄清楚土壤中霉菌的類別及如何對其進行消殺在對遺址的保護工作中具有重要意義.

卡松屬異噻唑啉酮類非氧化性殺菌防腐劑[9]，可以透過細胞膜進入細胞中，抑制蛋白的合成，也可以通過與DNA結(jié)合阻斷核酸的復(fù)制來抑制微生物的繁殖，同時還引發(fā)基因變異導(dǎo)致細胞最終死亡.卡松具有毒性低，抗菌作用范圍廣，用量少，效果強，不會改變產(chǎn)品的顏色[10]，配伍性能好，較寬的pH適用范圍等眾多優(yōu)點，特別是對環(huán)境影響小，在自然環(huán)境中的降解物主要為低毒或無毒的物質(zhì)，不會污染環(huán)境.目前，在日化、涂料、水處理等行業(yè)中已有廣泛應(yīng)用，系國際上公認的安全、高效、廣譜性限用防腐劑[11]，但在文物保護中的應(yīng)用未見有相關(guān)報道.

本文選取具有代表性的土壤，在實驗室中對土壤中所含的霉菌進行培養(yǎng)純化分離和鑒定，用卡松對分離出來的霉菌進行抑菌實驗，旨在對后續(xù)的保護工作提供依據(jù).

1??? 采樣與實驗方法

1.1?? 土壤采集

在洞中含文化遺存的堆積層表面，采集具有代表性的少量土壤塊.裝于無菌封口袋中帶回實驗室.

1.2?? 實驗方法

1.2.1? 培養(yǎng)基的配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：稱取200 g新鮮馬鈴薯去皮，切成塊加水煮沸約20 min（注意火力的控制，可適當補水），直到馬鈴薯塊能被玻璃棒戳破，用多層紗布過濾，濾液加20.0 g葡萄糖和15.0 g瓊脂攪拌均勻，補足水至1 000 mL，分裝入三角瓶，加塞，于蒸汽壓力滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min.

1.2.2? 制備含菌土懸液

將幾份土樣分別取2 g加到裝有20 mL滅菌水的三角瓶中震搖10 min，使土樣均勻地分散成土懸液.吸取1 mL土懸液到9 mL滅菌水中，稀釋得到10-2濃度的土懸液.

1.2.3? 霉菌的培養(yǎng)

采用平板涂布法，用滅菌移液管分別移取幾份配制好的土懸液于不同的無菌平板中央，用無菌涂布棒涂布均勻.將其置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)并每隔一段時間觀察生長情況.

1.2.4? 霉菌的分離純化

采用平板劃線法，使用接種環(huán)，從培養(yǎng)得到的菌落中選取需要純化的霉菌菌落，沾取少量菌種，在平板上劃線分離，再置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)并觀察.待霉菌生長成熟后，對每個霉菌繼續(xù)做平板劃線分離并培養(yǎng)，確保得到完全分離純化的霉菌菌落.

1.2.5? 霉菌的鑒別

菌落形態(tài)：在分離純化的培養(yǎng)中，觀察菌落中單個霉菌菌落生長時的菌落生長速度、大小形狀、表面形狀、透明度、質(zhì)地、正反面顏色及顏色變化特點，并拍照記錄.

顯微鏡結(jié)構(gòu)：先滴一小滴無菌生理鹽水于載玻片中央，用接種環(huán)從單菌落上挑取少量菌，與無菌生理鹽水混合，蓋上蓋玻片，用濾紙輕輕地吸干蓋玻片周圍多余的水，置于顯微鏡下觀察.若難以觀察出清晰的菌體結(jié)構(gòu)，則需要在制片時滴加一小滴乳酸石碳酸棉蘭染液進行染色再觀察.觀察記錄孢子形狀、孢子著生方式、孢子梗的特征等，并拍照記錄.

根據(jù)菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)，對比《真菌鑒定手冊》和相關(guān)真菌鑒別的文獻，對分離純化出來的霉菌進行判斷鑒別種類[12-14].

1.2.6? 抑菌實驗

在超凈工作臺內(nèi)用接種環(huán)挑取純化的霉菌孢子1～2環(huán)，加入無菌生理鹽水中，振蕩使孢子均勻分散，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度約為106～107 cfu/mL.

用滅菌移液管吸取0.1 mL菌懸液于培養(yǎng)基中央，用無菌涂布棒將菌液涂布均勻.用無菌鑷子將直徑為6 mm的無菌濾紙片放入含菌平板，輕輕按壓使濾紙片與培養(yǎng)基緊緊貼附，每個平板放4個濾紙片.然后用移液槍吸取10 μL不同濃度的卡松溶液滴到相應(yīng)的濾紙片上，使濾紙片充分吸收藥品，同時每個平板做一個生理鹽水對照組，每個濃度做3組平行.處理好的平板放置在28 ℃培養(yǎng)箱中，觀察生長情況，用十字交叉法測量抑菌圈，計算平均值和SD值.

2??? 結(jié)果與分析

2.1?? 分離得到的霉菌

本次從土壤中分離得到6種比較有代表性的霉菌，分別為地霉屬、根霉屬、青霉屬、毛霉屬、曲霉屬（黑曲霉、黃曲霉）.這6種霉菌均生長速率較快、菌落形態(tài)十分鮮明.若在土遺址上生長富集，將會嚴重破壞土遺址的原貌.

通過對分離得到的6種霉菌在培養(yǎng)基上隨時間增長的生長情況、正反面形態(tài)和顏色，以及顯微鏡觀察結(jié)構(gòu)特點的分析，結(jié)合《真菌鑒定手冊》和相關(guān)真菌鑒別的文獻，得到鑒別結(jié)果如下.

2.1.1? 1號菌

菌落形態(tài)：菌落生長速度較慢，生長局限.菌落大小中等，圓形稍起凸，不透明，表面初為顆粒狀，成熟后長出絲呈絲狀，邊緣整齊，質(zhì)地干燥.在PDA培養(yǎng)基上菌落正面呈乳白色，背面初為白色，成熟后呈淡粉色.如圖2（a）、圖2（b）所示.

顯微鏡結(jié)構(gòu)：觀察分生孢子呈長筒形或者鏈形，末端鈍圓，有橫隔.分生孢子生長于分生孢子梗上，分生孢子梗短且光滑，無色.見圖2（c）.由以上信息判斷1號菌為真菌門（Fungi），半知菌亞綱（Fungi Imperfect），叢梗孢目（Moniliales），叢梗孢科（Moniliaceae），卵形孢霉族（Oosporeae），地霉屬（Geotrichum）.

2.1.2? 2號菌

菌落形態(tài)：菌落生長速度一般，生長蔓延，不生長成定形菌落.菌落大小較小，呈不規(guī)則狀，不透明，表面粗糙，絨毛狀，邊緣波狀且顏色較淡，質(zhì)地干燥.在PDA培養(yǎng)基上菌落正面呈亮白色，背面初為白色，成熟后呈淡黃色，與培養(yǎng)基顏色相似.如圖3（a）、圖3（b）所示.顯微鏡結(jié)構(gòu)：有假根且假根發(fā)達、多分枝.菌絲無橫隔，孢囊梗直立或者稍彎曲，頂端長著圓形或球形孢子囊，孢子囊顏色較深.見圖3（c）.由以上信息判斷2號菌為接合菌亞門（Zygomycota），接合菌綱（Zygomycetes），毛霉目（Mucorales），毛霉科（Mucoraceae），根霉屬（Rhizopus）.

2.1.3?? 3號菌

菌落形態(tài)：菌落生長速度較快，生長局限.菌落大小中等，形狀圓形平整，不透明，表面致密呈放射狀，邊緣整齊、呈白色環(huán)狀，質(zhì)地干燥.在PDA培養(yǎng)基上菌落正面初為白色，慢慢變成淡綠色，成熟后呈藍綠色;背面初為淡黃色，逐漸顏色變深成血紅色，滲透到培養(yǎng)基中.如圖4（a）、圖4（b）所示.

顯微鏡結(jié)構(gòu)：呈明顯的帚狀.分生孢子梗呈柱狀不分枝，?；祥L出幾簇小梗整齊、緊密排列，分生孢子橢圓形呈顆粒狀，長于小梗上，形成帚狀體.見圖4（c）.由以上信息判斷3號菌為真菌門（Fungi），半知菌亞綱（Fungi Imperfect），叢梗孢目（Moniliales），叢梗孢科（Moniliaceae），曲霉族（Aspergilleae），青霉屬（penicillium）.

2.1.4?? 4號菌

菌落形態(tài)：菌落生長速度迅速，生長蔓延.菌落大小較大，絨毛狀隆起，不透明，表面呈絲狀，邊緣擴散狀，質(zhì)地干燥.在PDA培養(yǎng)基上菌落正面為白色，背面也為白色，呈發(fā)散是絲狀.如圖5（a）、圖5（b）所示.顯微鏡結(jié)構(gòu)：由菌絲體生長出直立、少量分枝的孢囊梗，無假根，分枝頂部有圓形或橢圓形的孢子囊，孢子囊顏色較深.見圖5（c）.由以上信息判斷4號菌為真菌門（Fungi），接合菌綱（Zygomycetes），毛霉目（Mucorales），毛霉科（Mucoraceae），毛霉屬（Mucor）.

2.1.5 ? 5號菌

菌落形態(tài)：菌落生長速度較快，生長局限.菌落大小中等，呈不規(guī)則狀，中心稍起凸，不透明，表面呈致密顆粒狀，邊緣呈不規(guī)則圓形，白色，質(zhì)地干燥.在PDA培養(yǎng)基上菌落正面初為淡黃色，逐漸變成黃色，成熟后呈深黃色;背面初為白色，逐漸變淡黃色，與培養(yǎng)基顏色相似.如圖6（a）、圖6（b）所示.

顯微鏡結(jié)構(gòu)：菌絲直立、無色，形成分生孢子梗，有隔膜.頂部長出球形或梨形的孢子囊，顏色較深.分生孢子串生.見圖6（c）.由以上信息判斷5號菌為真菌門（Fungi），半知菌亞綱（Fungi Imperfect），叢梗孢目（Moniliales），叢梗孢科（Moniliaceae），曲霉族（Aspergilleae），曲霉屬（Aspergillus），黃曲霉.

2.1.6?? 6號菌

菌落形態(tài)：菌落生長速度較快，生長局限.菌落大小中等，橢圓形，中心稍起凸，不透明，表面呈致密絨毛狀帶有小顆粒，邊緣白色絲狀，質(zhì)地干燥.在PDA培養(yǎng)基上菌落正面初為白色，成熟后呈灰褐色;背面初為白色，逐漸變成黃褐色.如圖7（a）、圖7（b）所示.顯微鏡結(jié)構(gòu)：菌絲直立、無色，形成分生孢子梗，無隔膜.頂部長出球形或圓形的孢子囊，顏色較深.分生孢子結(jié)構(gòu)大、串生.見圖7（c）.由以上信息判斷6號菌為真菌門（Fungi），半知菌亞綱（Fungi Imperfect），叢梗孢目（Moniliales），叢梗孢科（Moniliaceae），曲霉族（Aspergilleae），曲霉屬（Aspergillus），黑曲霉.

2.2?? 卡松對各種霉菌的抑制結(jié)果

不同霉菌對同一濃度卡松的敏感度不同，出現(xiàn)的抑菌圈大小、抑菌時效也不同，需要不同的濃度進行實驗對比.在進行培養(yǎng)2 ～5 d后，霉菌剛長出并且發(fā)現(xiàn)有抑菌圈出現(xiàn)時立即測量抑菌圈，從第一次測量抑菌圈的時間記起，直到抑菌部分全部長滿霉菌時，間隔的這一段時間記為抑菌時效.

2.2.1? 卡松對黑曲霉的抑菌效果

由表1卡松對黑曲霉的抑菌時效中的數(shù)據(jù)來看，卡松對黑曲霉的抑菌效果較好，僅0.02 g/L的卡松濃度就可以出現(xiàn)直徑為12.2 mm的抑菌圈，而且隨著卡松的濃度逐漸增大，抑菌圈也逐漸明顯.當卡松的濃度達到0.15 g/L時，黑曲霉的培養(yǎng)基上出現(xiàn)直徑達到28.5 mm的抑菌圈，盡管卡松的濃度很低，僅為千分之幾，但是在黑曲霉的培養(yǎng)基上還是可以出現(xiàn)明顯的抑菌圈;卡松對黑曲霉的抑菌時效也隨濃度的增大而增長，當卡松的濃度達到0.15 g/L時，抑菌時效可以長達6 d.

2.2.2? 卡松對青霉的抑菌效果

由表2可以看出，卡松對青霉的抑菌效果較好.在卡松濃度為0.01 g/L時就出現(xiàn)抑菌圈，雖然此時的抑菌圈不是特別明顯，但抑菌圈是隨著卡松的濃度逐漸增大而增大，抑菌時效也是隨著卡松濃度的增大而增長.當卡松濃度達到0.15 g/L時，抑菌圈直徑為27.5 mm，抑菌時效可達10 d以上.

2.2.3? 卡松對根霉的抑菌效果

由表3可以看出，卡松對根霉的抑制效果非常好.在根霉的培養(yǎng)基上，僅0.01 g/L的卡松濃度就可以出現(xiàn)很明顯的抑菌圈，并且抑菌圈隨著卡松的濃度逐漸增大，當卡松的濃度達到0.06 g/L以上時，整個培養(yǎng)基上沒有根霉長出;卡松對根霉的抑菌時效也隨著卡松的濃度增大而增長，當卡松的濃度達到0.05 g/L時，抑菌時效可以達到21 d以上.

2.2.4? 卡松對黃曲霉的抑菌效果

從表4的數(shù)據(jù)來看，卡松對黃曲霉的抑菌效果較好，0.06 g/L的卡松對黃曲霉的抑制效果隨著卡松的濃度增大而增強;卡松對黃曲霉的抑菌時效很長，可以達到19 d以上，并且卡松的濃度越大，抑菌時效越長.

表4? 卡松對黃曲霉的抑菌效果

Tab.4? Antibacterial effect of kathon on aspergillus flavus

注：“+”表示無明顯抑菌圈

2.2.5? 卡松對毛霉的抑菌效果

從表5中可以看出，卡松對毛霉的抑制效果不太理想.當卡松的濃度達到0.06 g/L時才出現(xiàn)較為明顯的抑菌圈，雖然毛霉的抑菌圈也是隨著卡松的濃度逐漸增大，但卡松對毛霉的抑制時效非常短，即使卡松的濃度達到0.15 g/L，抑菌圈也會在24 h內(nèi)就長滿了毛霉.這應(yīng)該跟毛霉的生長特性有關(guān)，毛霉菌絲體生長迅速，孢子釋放較快，生長旺盛.

表5? 卡松對毛霉的抑菌效果

Tab.5? Antibacterial effect of kathon on mucor

注：“+”表示無明顯抑菌圈

2.2.6? 卡松對地霉的抑制效果

由表6中的數(shù)據(jù)可以看出，卡松對地霉的抑制效果很好.卡松濃度為0.01 g/L時，抑菌圈直徑達到? 12.3 mm，卡松濃度增加，抑菌圈的直徑也隨之增大，當卡松濃度達到0.15 g/L時，培養(yǎng)基上沒有地霉長出;卡松對地霉的抑菌時效也隨著卡松的濃度變化而變化，濃度越大，抑菌時效越長，當卡松濃度達到0.12 g/L時，抑菌時效可長達36 d以上.

表6? 卡松對地霉的抑菌效果

Tab.6? Antibacterial effect of kathon on geotrichum

[濃度/（g·L-1）????????????????????????? 抑菌圈/mm???????????????????????????? ?0 h?8 h ?24 h?5 d?10 d?20 d?25 d?36 d?0.01?12.3±0.6?10.0±0.6?? 9.2±0.4?? 6.0±0.6?? +?? +?? +?? +?0.02?14.5±0.3?10.5±0.4?? 9.8±0.4?? 6.6±0.3?? +?? +?? +?? +?0.03?14.8±0.5?12.1±1.2?11.8±1.0?? 9.4±0.8?? 8.8±1.0?? 7.5±0.2?? 7.4±0.2?? 7.4±1.2?0.04?15.8±0.9?13.4±0.9?12.4±1.2?10.6±1.0?? 9.7±0.8?? 8.6±0.3?? 8.6±1.0?? 8.5±0.3?0.05?18.7±1.0?16.8±0.8?15.9±0.7?12.1±0.7?11.3±0.6?? 9.6±0.3?? 9.6±1.2?? 9.6±0.8?0.06?20.0±0.3?18.3±0.5?16.9±0.5?13.6±0.7?12.8±0.5?11.4±0.3?11.3±0.5?11.2±0.7?0.08?21.5±0.8?19.6±0.3?17.8±0.2?14.5±0.3?14.0±0.9?13.6±0.2?13.0±0.8?12.0±0.2?0.10?22.0±0.2?20.2±0.6?19.0±0.8?16.5±0.9?15.7±0.4?14.0±0.3?13.5±0.4?13.2±0.6?0.12?32.0±0.3?29.3±0.2?28.0±0.5?25.3±0.6?24.8±0.9?23.5±1.0?23.0±0.7?22.6±0.4?0.15?-?-?-?-?-?-?-?-?]

注：“+”表示無明顯抑菌圈，“-”表示整個平板不長菌

3??? 結(jié)論與展望

本次從白蓮洞遺址土壤表面經(jīng)過多次分離純化得到6種主要的霉菌，通過觀察其在PDA培養(yǎng)基上的外觀形態(tài)和在顯微鏡下的結(jié)構(gòu)特點得出結(jié)論，其屬分別是地霉屬、根霉屬、青霉屬、毛霉屬、曲霉屬.用卡松對分離出來的6種霉菌進行抑菌實驗，發(fā)現(xiàn)效果較為理想，除了對毛霉的抑菌時效較短外，對其他5種菌的抑菌時效都比較長.今后，在此次實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，將繼續(xù)對洞中霉菌進行后續(xù)研究，采用其他藥品或者多種藥品復(fù)配進行抑菌，針對毛霉的生長特性，尋找對其抑制效果好的藥品再進行研究.還要對白蓮洞遺址中主要霉菌的病害分布區(qū)域、分布面積進行全面統(tǒng)計，對照其生物特性和生存條件，結(jié)合該區(qū)域的微環(huán)境變化，提出有針對性的預(yù)防控制措施，最小干預(yù)的情況下避免大面積霉菌病害的產(chǎn)生，最大程度地保留白蓮洞遺址的原始環(huán)境信息. 此外，由于納米材料具有特殊的尺寸效應(yīng)和優(yōu)秀的捕獲能力[15-16]，在下一步的研究工作中，考慮將對霉菌具有抑制作用的藥品融合到納米材料的制備中，研制新型的納米防霉材料，以求對遺址達到長效抑菌的作用，使古遺址得到更長期的保護.

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Inhibitory effect of Kathon on mold from earthen archaeological site of Bailiandong in Liuzhou City

HUANG Guoxia1，3，4， YE Liang2， LAN Xiaofeng1， CHEN Huaying1， LI Jiaming1， LIU Chengxiang1

（1.School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China; 2. Liuzhou Bailiandong Site Science Museum， Liuzhou 545005， China;3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources of Guangxi Higher Education Institutes （Guangxi University of Science and

Technology）， Liuzhou 545006， China; 4. Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources （Guangxi University of Science and Technology）， Liuzhou 545006， China）

Abstract： In this paper， the types of molds from the surface of Bailiandong site and the inhibitory effect of kathon on the isolated molds were studied. The collected soils were prepared into soil suspension. The molds contained in suspension were cultured on potato dextrose agar medium by spread plate? method， and then purified for several times. Finally， six kinds of major molds were isolated. They were geotrichum， rhizopus， penicillum， mucor， aspergillus（aspergillus flavus and aspergillus niger），??????? respectively. The inhibitory effect of different concentrations of kathon solution on mold was studied by filter paper method. The result indicated that the antibacterial effect on aspergillus， geotrichum，????????? rhizopus， penicillum is good and preserves for a long time， but that on mucor is worse.

Key words： Bailiandong Site; earthen archaeological site; mold; separation; identification