咪唑類離子液體在榿葉棠棣總黃酮提取工藝中的應(yīng)用

潘思源 田英姿

摘要 [目的]以提取率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討咪唑類離子液體提取榿葉棠棣總黃酮的最佳工藝。[方法]通過對(duì)比不同種類、濃度的提取溶劑和不同提取方法初步確定提取工藝，并應(yīng)用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]選取0.7 mol/L的溴化1-丁基-3-甲基咪唑水溶液為提取溶劑，其提取效率高于其他離子液體及70%甲醇、70%乙醇等傳統(tǒng)有機(jī)溶劑；微波輔助法相比熱回流法和超聲輔助法具有顯著優(yōu)越性，提取得率高且可重復(fù)性好。在微波提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)中，液料比對(duì)榿葉棠棣總黃酮提取率的影響最為顯著，最佳工藝條件：提取溫度72 ℃、提取時(shí)間16.5 min、液料比24.5（mL∶g），在此條件下平均得率達(dá)12.75 mg/g。[結(jié)論]咪唑類離子液體在微波環(huán)境下能夠有效提高榿葉棠棣總黃酮提取率，優(yōu)化后的工藝參數(shù)可為其工業(yè)化生產(chǎn)和科學(xué)研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 榿葉棠棣；總黃酮；離子液體；提取工藝；響應(yīng)面

中圖分類號(hào) R282.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）09-0159-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.046

Abstract [Objective] The extraction rate was the main evaluation index， and the optimal extraction process for total flavonoids of Amelanchier alnifolia Nutt. was studied. [Method] The initial extraction process was determined by comparing different extraction methods and extraction solvents of different types and concentrations. The key factors were optimized by single factor tests and BoxBehnken tests. [Result] 0.7 mol/L 1butyl3methylimidazolium bromide was selected as the extraction solvent， and the extraction efficiency was higher than other ionic liquids， 70% methanol， 70% ethanol and other traditional organic solvents；compared with the thermal reflux method and the ultrasonicassisted method， the microwaveassisted method has significant superiority， such as high extraction yield and good repeatability. In the response surface test of microwaveassisted extraction process， materialliquid ratio had the most significant effect on the extraction rate of total flavonoids of Amelanchier alnifolia Nutt.， and the optimum conditions were as follows： extraction temperature 72 ℃， extraction time 16.5 min， liquidsolid ratio 24.5 mL/g， the average yield in repeated extraction of three times could reach 12.75 mg/g. [Conclusion] The imidazole ionic liquid under microwave condition can effectively improve the extraction rate of total flavonoids from Amelanchier alnifolia Nutt.. The optimized parameters in extraction process can provide corresponding theoretical basis for industrial production and scientific research.

Key words Amelanchier alnifolia Nutt.；Total flavonoids；Ionic liquid；Extraction process；Response surface method

榿葉唐棣（Amelanchier alnifolia Nutt.）是一種發(fā)展迅速、風(fēng)味獨(dú)特的薔薇科小漿果，原產(chǎn)自北美洲中西部，現(xiàn)已引種至我國(guó)新疆、甘肅、吉林等省份[1]。榿葉棠棣果實(shí)富含抗氧化劑、水果膳食纖維及鈣、磷、鎂、錳等人體所需礦物元素，近年來作為功能性食品被廣泛關(guān)注，需求量也日漸上漲[2]。研究表明，黃酮類化合物是榿葉棠棣成熟果實(shí)中抗氧化劑的主要成分，包括黃酮醇類、黃烷類（聚合度不同的原花青素）和花青素等，在人體血壓控制和消炎抗癌方面功效突出，藥用價(jià)值極其可觀[3-4]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)榿葉棠棣的研究?jī)H限于種植栽培[5]、釀造工藝[6-7]和果膠[8]、花青素[9]、花色苷[10]等活性成分方面，開發(fā)其總黃酮的提取工藝意義重大，提取產(chǎn)物可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及保健品領(lǐng)域。

研究表明，離子液體（Ionic liquids，IL）能替代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取植物資源中的黃酮類化合物，提取率高且綠色環(huán)保，其中咪唑類離子液體的萃取效果最為顯著。Dróz·dz·等[11]用3種咪唑類離子液體提取石楠花總黃酮，提取率遠(yuǎn)高于60%乙醇溶液和乙酸乙酯。Wang等[12]從15種結(jié)構(gòu)不同的離子液體中選擇提取效率最佳的溴化1-丁基-3-甲基咪唑（[Bmim]Br）用于超聲輔助法提取毛竹葉總黃酮。杜芳艷等[13]將[Bmim]Br離子液體和微波提取工藝相結(jié)合提取海紅果渣總黃酮，提取時(shí)間及溶劑消耗量大幅減少。

為此，筆者以咪唑類離子液體的水溶液（甲醇溶液、乙醇溶液和乙酸乙酯）為提取溶劑，采用不同方法提取榿葉棠棣總黃酮（total flavonoids of Amelanchier alnifolia Nutt.，TFAN），依據(jù)提取得率篩選出最合適的提取工藝，并設(shè)計(jì)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)TFAN的實(shí)際生產(chǎn)具有一定參考作用，同時(shí)為其功能性產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榿葉棠棣：水西溝2號(hào)，引種自加拿大，采自新疆烏魯木齊縣。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%），源葉生物公司；[Bmim]Br、溴化1-己基-3-甲基咪唑（[Hmim]Br）、溴化1-辛基-3-甲基咪唑（[Omim]Br），純度均≥97%，阿拉丁公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MCR-3常壓微波化學(xué)反應(yīng)器，貝侖儀器公司；ALPHA2-4 LSC實(shí)驗(yàn)室凍干機(jī)，德國(guó)Marin Christ公司；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)，島津公司；TGL20MC高速冷凍離心機(jī)，英泰儀器公司；LK-2000A中藥高速粉碎機(jī)，精勝儀器公司；超聲波清洗器、恒溫水浴鍋、分析天平、真空泵等實(shí)驗(yàn)室常用儀器。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理。篩選出大小均一的榿葉棠棣鮮果，清洗風(fēng)干后放入粉碎機(jī)中切開，充分粉碎。將粉碎后的原料完全轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中連續(xù)處理16 h，再次粉碎脫水原料，過60目篩，裝袋封口置于干燥、低溫環(huán)境下貯存。

1.3.2 榿葉棠棣總黃酮的提取及測(cè)定。

1.3.2.1

TFAN的提取步驟。用分析天平稱取榿葉棠棣粉末樣品1.000 g，置于150 mL圓底三口燒瓶中，按預(yù)先設(shè)定的液料比加入提取溶劑，分別采用熱回流、超聲輔助及微波輔助工藝提取TFAN。若提取溶劑為咪唑類離子液體的水溶液，則在提取結(jié)束后進(jìn)行冷凍離心及針式濾器壓濾處理；若提取溶劑為其他3種有機(jī)溶劑，則直接轉(zhuǎn)移至坩堝式濾器中充分抽濾。用對(duì)應(yīng)種類和濃度的提取溶劑將濾液定容至50 mL，作為TFAN待測(cè)液備用。

1.3.2.2

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。參照楊潤(rùn)亞等[14]的方法，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0.25 mg/mL，采用“NaNO2-Al（NO3）3-NaOH”顯色體系和紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（λ=510 nm處有最大吸收峰）。

1.3.2.3

TFAN提取率的測(cè)定。用移液槍移取TFAN 待測(cè)液2.0 mL，按照“1.3.2.2”中的方法依次加入顯色體系所用試劑并搖勻、靜置，顯色處理完成后在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，代入回歸方程求出相應(yīng)的總黃酮質(zhì)量m0（mg）。測(cè)定過程中以60%乙醇溶液為校準(zhǔn)液，經(jīng)全波長(zhǎng)掃描，咪唑類離子液體的水溶液及3種有機(jī)溶劑在此波長(zhǎng)下均無吸收峰，對(duì)待測(cè)液中黃酮類化合物質(zhì)量的測(cè)定無干擾。TFAN提取率計(jì)算公式：Y=（25×m0）/m1。式中，Y為TFAN提取率（mg/g），25為定容待測(cè)液體積與轉(zhuǎn)移待測(cè)液體積之比，m1為榿葉棠棣粉末樣品的質(zhì)量（g）。

1.3.3

提取溶劑種類及濃度的選擇。采用微波輔助法提取TFAN，不同提取溶劑的用量均為20 mL，設(shè)定反應(yīng)條件為提取功率400 W、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間20 min，依據(jù)TFAN提取率及過濾操作的難易程度篩選出最佳溶劑種類。溶劑分別為70%甲醇溶液、70%乙醇溶液、乙酸乙酯、[Bmim]Br溶液、[Hmim]Br溶液、[Omim]Br溶液（離子液體濃度均為0.6 mol/L）。用超純水將該溶劑配制成一定濃度梯度（0.4～1.2 mol/L）的溶液，在上述提取條件下分別提取TFAN，提取率最高的濃度用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.4 不同提取方法的比較。設(shè)定熱回流法、超聲輔助法及微波輔助法的工藝參數(shù)[15]，用“1.3.3”中所確定的提取溶劑分別提取TFAN，各方法重復(fù)3次，通過評(píng)價(jià)TFAN提取率、提取耗時(shí)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等參考指標(biāo)確定最佳提取方法。為了使提取過程穩(wěn)定、快速升溫，且不破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)和活性，試驗(yàn)所用超聲波及微波的功率均為400 W[16]。

1.3.5

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以上述最佳提取方法為研究對(duì)象，將提取溫度（40～90 ℃）、提取時(shí)間（5～30 min）、液料比[10∶1～35∶1（mL∶g）]作為單因素試驗(yàn)的3個(gè)因素，分別研究各因素對(duì)TFAN提取率的影響規(guī)律和優(yōu)勢(shì)水平。

1.3.6

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)“1.3.5”中的結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，TFAN提取率為響應(yīng)值（Z），具體因素及水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)化曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量M與吸光度A的回歸方程為A=1.1664M-0.0061（R2=0.998 7），在0.05～0.50 mg時(shí)可用于TFAN的定量測(cè)定（圖1）。

2.2 提取溶劑的確定

2.2.1 溶劑種類對(duì)榿葉棠棣總黃酮提取率的影響。由圖2可知，70%甲醇溶液的提取率為7.03 mg/g，雖比70%乙醇溶液和乙酸乙酯高，但不及3種濃度為0.6 mol/L的咪唑類離子液體溶液，一方面是因?yàn)殡x子液體對(duì)TFAN的溶解能力比傳統(tǒng)有機(jī)溶劑強(qiáng)，另一方面是因?yàn)殡x子液體可以溶解植物細(xì)胞壁中的纖維素，促使有效成分釋放至細(xì)胞外。此外，[Bmim]Br溶液的提取率達(dá)8.75 mg/g，高于[Hmim]Br溶液和[Omim]Br溶液，可能是因?yàn)檩^長(zhǎng)的陽(yáng)離子烷基鏈帶來了更大的空間位阻效應(yīng)和傳質(zhì)阻力，離子液體對(duì)細(xì)胞壁的破壞能力也有所減弱，在降低提取率的同時(shí)還增大了針式過濾操作所需的壓力，且鏈長(zhǎng)越長(zhǎng)過濾速度越慢[15]。因此，選擇TFAN提取率最高、便于過濾的[Bmim]Br溶液作為提取溶劑。

2.2.2 [Bmim]Br濃度對(duì)榿葉棠棣總黃酮提取率的影響。由圖3可知，當(dāng)[Bmim]Br溶液濃度從0.4 mol/L增大到0.7 mol/L時(shí)，溶劑中主要起溶解和傳質(zhì)作用的離子液體不斷增多，TFAN提取率隨之升高。繼續(xù)增大溶液濃度，TFAN提取率逐步下降，考慮到[Bmim]Br離子液體呈高度黏稠狀，濃度越大導(dǎo)致提取溶劑的黏度越大，較強(qiáng)的傳質(zhì)阻力會(huì)抑制TFAN溶出。另外，由相似相溶原理可知，[Bmim]Br溶液的極性越接近于榿葉棠棣總黃酮中主要物質(zhì)的極性范圍，則TFAN的溶解和溶出程度越大，表現(xiàn)出較高的提取效率，而提取溶劑的濃度是決定其極性大小的關(guān)鍵因素之一[17]。綜合以上因素，選取[Bmim]Br溶液的濃度為0.7 mol/L，此時(shí)TFAN提取率有最大值10.33 mg/g。

2.3 3種提取方法的比較

由表2可知，傳統(tǒng)熱回流法的TFAN提取率最低，且提取過程耗時(shí)長(zhǎng)、反應(yīng)所需溫度高、工藝較為繁瑣。另外，在相同工藝參數(shù)下，超聲輔助法的TFAN

提取率比微波輔助法低0.64 mg/g，且RSD值高1.3%，多次

提取的重復(fù)性差。造成這一結(jié)果的原因可能是離子液體與微波間的熱效應(yīng)比超聲波協(xié)同作用強(qiáng)，升溫和控溫過程也更為穩(wěn)定，為黃酮類化合物的溶出提供了有利條件，故微波輔助法較其他2種方法具有顯著優(yōu)越性。

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1

提取溫度對(duì)榿葉棠棣總黃酮提取率的影響。固定提取時(shí)間20 min、液料比20∶1（mL∶g），測(cè)定提取溫度40、50、60、70、80、90 ℃時(shí)的TFAN提取率，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)微波提取的設(shè)定溫度從40 ℃增大到70 ℃時(shí)，黃酮類化合物的運(yùn)動(dòng)速率不斷加快，在離子液體中的溶解性及擴(kuò)散程度提高，TFAN提取率隨之上升。但繼續(xù)升高溫度導(dǎo)致TFAN提取率有所降低，這是因?yàn)樵诟邷丨h(huán)境下結(jié)構(gòu)相對(duì)不穩(wěn)定的TFAN會(huì)被氧化，溫度越高氧化程度越大，同時(shí)有悖于提取過程“節(jié)能降耗”的發(fā)展方向。故選擇提取溫度60～80 ℃為該因素在響應(yīng)面試驗(yàn)中的水平。

2.4.2

提取時(shí)間對(duì)榿葉棠棣總黃酮提取率的影響。固定提取溫度60 ℃、液料比20∶1（mL∶g），測(cè)定提取時(shí)間5、10、15、20、25、30 min時(shí)的TFAN提取率。結(jié)果見圖5。由圖5可知，在15 min前TFAN提取率隨時(shí)間延長(zhǎng)迅速上升，主要與TFAN在不同時(shí)間點(diǎn)的溶出程度有關(guān)，達(dá)到完全溶出需要一定反應(yīng)時(shí)間。提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，TFAN提取率呈緩慢下降趨勢(shì)，這是因?yàn)槲⒉ǖ膹?qiáng)熱效應(yīng)會(huì)破壞部分TFAN的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，處理時(shí)間越長(zhǎng)，被分解的黃酮類化合物越多。故選擇提取時(shí)間10～20 min為該因素在響應(yīng)面試驗(yàn)中的水平。

2.4.3 液料比對(duì)榿葉棠棣總黃酮提取率的影響。固定提取溫度60 ℃、提取時(shí)間20 min，測(cè)定液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL∶g）時(shí)的TFAN提取率，結(jié)果見圖6。由圖6可知，TFAN提取率隨液料比的增加先上升后降低，當(dāng)液料比為25∶1（mL∶g）時(shí)提取率最大。溶劑的增加會(huì)使TFAN在離子液體中的溶解更加充分，傳質(zhì)速率及溶出速率加快；但溶劑過多會(huì)導(dǎo)致微波升溫過程減慢、雜質(zhì)溶出量增加，不僅使TFAN提取率大幅降低，還增加了生產(chǎn)成本和過濾操作的難度。故選擇液料比20∶1～30∶1（mL∶g）為該因素在響應(yīng)面試驗(yàn)中的水平。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見表3，運(yùn)用Design-Expert軟件進(jìn)行二次回歸擬合，建立自變量提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）和液料比（X3）與響應(yīng)值TFAN提取率（Z）的數(shù)學(xué)模型，所得回歸方程：

Z=12.62+0.20X1+0.31X2-0.39X3+0.038X1X2+0.059X1X3-0.021X2X3 -0.52-0.55-1.80

ANOVA分析結(jié)果見表4。由表4可知，模型整體具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，達(dá)極顯著水平（P<0.000 1）；失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05）表明模型穩(wěn)定，不易受外界因素影響；變異系數(shù)CV=

1.34%和決定系數(shù)R2Adj=0.981 5表明模型的擬合度與精確度較高，可替代具體試驗(yàn)分析此工藝中TFAN提取率的變化。X1、X2、X3及其二次項(xiàng)均為極顯著因素，對(duì)TFAN提取率均影響較大；3個(gè)交互項(xiàng)不顯著，說明因素間兩兩相互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響較弱。根據(jù)結(jié)果差異性（P）及方程一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值判斷，各因素對(duì)TFAN提取率的影響表現(xiàn)為液料比（X3）>提取時(shí)間（X2）>提取溫度（X1）。

由圖7可知，TFAN提取率的最高值均分布在各因素所選取的水平范圍內(nèi)，因此該模型可用來預(yù)測(cè)的極值點(diǎn)所在位置。沿液料比方向，3D曲面的陡峭程度最大，且等高線分布最為密集，故液料比對(duì)TFAN提取率的影響較其他2個(gè)因素更為顯著；對(duì)比各圖中等高線的形狀，提取溫度和液料比的等高線呈橢圓形且弧度最大，說明X1X3的交互作用強(qiáng)于X1X2和X2X3，但仍未達(dá)顯著水平[18]。

由回歸方程可得微波輔助法的理論最佳工藝條件：提取溫度72.02 ℃、提取時(shí)間16.46 min、液料比24.46（mL∶g），TFAN提取率為12.71 mg/g。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室儀器精度，將工藝修正為提取溫度72 ℃、提取時(shí)間16.5 min、液料比24.5（mL∶g），重復(fù)提取3次進(jìn)行驗(yàn)證，TFAN提取率為12.75 mg/g，RSD為0.72%，與理論值基本吻合。

3 結(jié)論

采用不同種類和濃度的溶劑提取榿葉棠棣總黃酮，咪唑類離子液體水溶液較傳統(tǒng)有機(jī)溶劑表現(xiàn)出更好的提取特性，尤其是濃度0.7 mol/L[Bmim]Br溶液。對(duì)比3種提取方法，微波輔助法的提取效率高于熱回流法及超聲輔助法，離子液體在微波環(huán)境下所產(chǎn)生的強(qiáng)熱效應(yīng)更有利于黃酮類化合物的溶出。

通過單因素和Box-Behnken試驗(yàn)研究微波輔助[Bmim]Br溶液提取榿葉棠棣總黃酮，所得最佳提取工藝為提取溫度72 ℃、提取時(shí)間16.5 min、液料比24.5（mL∶g），驗(yàn)證試驗(yàn)的平均提取得率為12.75 mg/g，與回歸方程的預(yù)測(cè)結(jié)果相符，模型可靠性高。在選取的3個(gè)獨(dú)立因素中，液料比對(duì)提取率的影響最為顯著（P=0.000 2），是該工藝中的關(guān)鍵性因素。

該研究針對(duì)榿葉棠棣總黃酮提供了一種高效、綠色的提取工藝，對(duì)其分離純化、成分分析、功能特性、開發(fā)應(yīng)用等研究具有一定借鑒意義，且咪唑類離子液體可通過反萃取法進(jìn)行回收，規(guī)避了自身價(jià)格高昂所帶來的生產(chǎn)成本。

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