竹節(jié)參轉(zhuǎn)錄組使用密碼子偏好性分析

梁娥 齊敏杰 丁延慶

摘要：竹節(jié)參是我國(guó)珍稀瀕危中藥材，研究其基因密碼子使用模式，可為利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)人參皂苷異源生物合成及竹節(jié)參分子育種改良提供理論依據(jù)。以竹節(jié)參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為數(shù)據(jù)來源，篩選編碼蛋白基因序列（coding sequence，簡(jiǎn)稱CDS）堿基數(shù)不小于300 bp的 11 199 條完整開放閱讀框序列作為研究對(duì)象，利用Codon和SPSS軟件分別統(tǒng)計(jì)竹節(jié)參基因密碼子GC含量、密碼子第3位的（C+G）含量（GC3）和密碼子第1、第2位（G+C）含量的平均值（GC12）、同義密碼子的相對(duì)使用度（RSCU）、有效密碼子數(shù)（ENC）等密碼子偏好性指標(biāo)，通過中性繪圖（GC12 vs. GC3）、PR2繪圖和ENC-GC3s繪圖分析影響竹節(jié)參密碼子使用模式的因素。結(jié)果表明，竹節(jié)參基因的平均GC、GC12和GC3s含量分別為44.67%、46.97%和39.80%，其密碼子使用模式受到突變和選擇等多重因素的影響，確定了31個(gè)竹節(jié)參最優(yōu)密碼子，除了UUG外，其余最優(yōu)密碼子均以A或T結(jié)尾。竹節(jié)參密碼子使用模式與大腸桿菌和釀酒酵母相比差異較大，選取畢赤酵母作為竹節(jié)參基因的異源表達(dá)宿主更為合適。

關(guān)鍵詞：竹節(jié)參;轉(zhuǎn)錄組;密碼子使用模式;最優(yōu)密碼子

中圖分類號(hào)： Q755;S567.5+10.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0059-05

遺傳密碼子是生物體DNA與蛋白質(zhì)之間信息傳遞的基本單位，具有簡(jiǎn)并性，即同一氨基酸有多個(gè)對(duì)應(yīng)的密碼子，編碼同一種氨基酸的密碼子叫作同義密碼子，同義密碼子在同一物種不同基因間或不同物種內(nèi)的使用頻率大有不同，這種不均衡使用模式稱為密碼子使用偏好性，通常把使用頻率較高的一種或幾種同義密碼子稱為最優(yōu)密碼子[1-2]。研究顯示，不同物種之間基因密碼子偏好性是由突變壓力（如GC含量、基因堿基組成）和自然選擇作用（如翻譯起始信號(hào)、基因表達(dá)水平、蛋白結(jié)構(gòu)與長(zhǎng)度、tRNA豐度等）引起的，mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性、翻譯的速度和準(zhǔn)確度、蛋白質(zhì)折疊等因素也與密碼子的偏好性有關(guān)[3-4]。對(duì)物種密碼子偏好性開展研究，有助于理解物種進(jìn)化發(fā)展及密碼子使用偏好性的調(diào)控機(jī)制。密碼子偏好性在基因異源表達(dá)研究方面也顯示了重要作用，基因的表達(dá)量越大，其密碼子偏好性越強(qiáng)[5]，根據(jù)這一原理，替換基因低表達(dá)密碼子可以提高外源基因表達(dá)量，同時(shí)根據(jù)密碼子使用偏好性可以選擇更為合適的宿主表達(dá)系統(tǒng)。有報(bào)道表明，可通過優(yōu)化密碼子的方式來提高外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量[6-7]。周宗梁等通過優(yōu)化密碼子的方法提高了蘇云金芽孢桿菌基因cry1Ah在玉米和水稻中的表達(dá)量[8-9];楊金玲等通過優(yōu)化蝎毒鎮(zhèn)痛活性肽基因BmKAngM1，將其導(dǎo)入畢赤酵母后該基因表達(dá)量得到顯著提高[10];通過使用最優(yōu)密碼子，在草菇[11]、擬南芥[12]、川母貝[13]、菠蘿[14]等生物中均得到了很好的研究成果。

竹節(jié)參（Panax japonicus C. A. Mey）為多年生草本植物，屬于五加科（Paeoniaceae）人參屬，是我國(guó)珍稀瀕危的“七類中草藥”之一，具有抗炎、延緩衰老、降血糖等藥理作用，有著極高的藥用和保健價(jià)值。竹節(jié)參中富含活性物質(zhì)三萜皂苷，也是其特征性成分。目前在竹節(jié)參種質(zhì)資源[15-16]、毛狀根的培養(yǎng)[17]、基因工程代謝的調(diào)控[18]、生藥學(xué)鑒定[19]、精油成分分析[20]和三萜皂苷代謝追蹤[21]等幾個(gè)研究領(lǐng)域已經(jīng)開展了許多研究工作，但直接從竹節(jié)參中通過分離提取的方法獲得三萜皂苷對(duì)資源消耗極大，技術(shù)難度較高。若利用生物合成的方法則可以很好地解決這一困難，實(shí)現(xiàn)有效成分的生物合成，選擇適合關(guān)鍵酶基因高效表達(dá)的異源表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)重要步驟。本研究以竹節(jié)參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為材料，通過分析竹節(jié)參基因密碼子組成的各項(xiàng)指標(biāo)，研究竹節(jié)參表達(dá)基因密碼子使用偏好性及其影響因素，以期為竹節(jié)參相關(guān)基因表達(dá)系統(tǒng)的選擇及分子育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

竹節(jié)參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于文獻(xiàn)[22]，通過Perl語(yǔ)言程序?qū)χ窆?jié)參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾篩選，篩選出堿基數(shù)≥300 bp的蛋白質(zhì)編碼序列共11 199條，作為密碼子分析的數(shù)據(jù)來源。本研究中使用到的大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母（Pichia pastoris）的密碼子偏好性數(shù)據(jù)來自Codon Usage database（ http：//www. kazusa. or. jp /codon /）。

1.2 竹節(jié)參基因GC含量分析及中性繪圖

利用Codon W1.4.2（http：//codonw.sourceforge.net/）統(tǒng)計(jì)分析竹節(jié)參基因密碼子的堿基組成規(guī)律，測(cè)得鳥嘌呤和胞嘧啶總體含量G+C、密碼子第3位堿基組成（A3、G3、C3、T3）、密碼子第3位的C+G數(shù)（GC3）和密碼子第1、第2位的平均G+C含量（GC12）等數(shù)據(jù)。本研究以密碼子第1、第2個(gè)堿基的G+C平均含量為縱坐標(biāo)，以密碼子第3個(gè)堿基的G+C含量為橫坐標(biāo)，通過中性繪圖探究影響密碼子偏好性的因素。分析密碼子第1、第2位與第3位堿基組成的相關(guān)性，來分析自然選擇與壓力突變對(duì)基因密碼子使用模式的影響[23]。

1.3 竹節(jié)參基因有效密碼子數(shù)分析

參照Fuglsang的方法[24]，利用有效密碼子數(shù)來衡量竹節(jié)參基因單個(gè)密碼子使用的偏好程度。基因有效密碼子數(shù)（effective number codon，簡(jiǎn)稱ENC）是衡量基因密碼子偏好性的一個(gè)重要指標(biāo)，數(shù)值范圍為20（每個(gè)氨基酸只使用1個(gè)同義密碼子的極端偏好情況）到61（每個(gè)同義密碼子被平均使用的無偏好情況）。研究表明，當(dāng)ENC值≤35時(shí)，基因密碼子的使用偏好性越強(qiáng)[25]。同時(shí)以ENC值為縱坐標(biāo)，GC3s為橫坐標(biāo)進(jìn)行ENC繪圖，分析各基因密碼子的使用特征，研究竹節(jié)參密碼子偏好性和基因堿基組成之間的關(guān)系。

1.4 同義密碼子相對(duì)使用度及最優(yōu)密碼子分析

參照Sharp等的方法[26]，采用同義密碼子的相對(duì)使用度（RSCU）作為衡量竹節(jié)參密碼子使用偏好性的指標(biāo)。使用3個(gè)指標(biāo)表示：密碼子使用無偏好性（RSCU=1）;密碼子使用度較大（RSCU>1）;密碼子使用頻率較低（RSCU<1）。利用高表達(dá)優(yōu)越密碼子分析方法[27]，統(tǒng)計(jì)所有基因的ENC值、有序數(shù)據(jù)集的上下10%區(qū)間形成高RSCU集合和低RSCU集合，進(jìn)行最優(yōu)密碼子分析。根據(jù)2個(gè)子集的ΔRSCU值及卡方檢驗(yàn)確定最優(yōu)密碼子。

1.5 PR2繪圖分析

采用PR2繪圖進(jìn)行密碼子奇偶偏好分析[23]，分別統(tǒng)計(jì)竹節(jié)參基因中A3/（A3+T3）與G3/（G3+C3）數(shù)據(jù)，以此為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，通過平面圖顯示各基因堿基的組成。為使編碼密碼子第3位堿基對(duì)A/T或T/A和G/C或C/G的突變不均衡，PR2繪圖時(shí)只選擇亮氨酸（Leu，密碼子：CTA、CTC、CTG、CTT）、脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg，密碼子：CGA、CGC、CGG、CGT）、絲氨酸（Ser，密碼子：TCA、TCC、TCG、TCT）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr）和甘氨酸（Gly）等遺傳密碼子進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC含量分析以及中性繪圖

竹節(jié)參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共有11 199條完整的開放閱讀框序列，利用Codon W對(duì)完整的開放閱讀框序列進(jìn)行密碼子使用模式分析。結(jié)果（表1）表明，所有完整的開放閱讀框序列總長(zhǎng)度為 12 006 732 bp，N50=1 332 bp，平均GC含量為44.67%，GC含量范圍為30.3%～63.8%。竹節(jié)參基因組平均GC含量低于大腸桿菌基因組平均GC含量（52.35%），高于釀酒酵母基因組平均GC含量（39.77%）和畢赤酵母基因組平均GC含量（42.73%）。竹節(jié)參基因組密碼子第1、第2位堿基GC含量的變化范圍為31.7%～71.8%，平均GC含量為46.97%。密碼子的第3位上堿基GC含量的變化范圍為10.7%～83.9%，平均GC含量是39.80%。密碼子第3位堿基上A、T的使用頻率分別是33.09%、41.27%，略高于C、G的使用頻率（分別為23.61%、27.57%），說明竹節(jié)參基因密碼子對(duì)以A和T結(jié)尾的密碼子的使用偏好程度較大，而對(duì)以G和C結(jié)尾的密碼子的使用偏好程度較小。密碼子第3位堿基上的平均GC含量（39.80%）略低于畢赤酵母基因密碼子第3位堿基的平均GC含量（42.16%），偏高于釀酒酵母密碼子第3位堿基的平均GC含量（38.10%），大大低于大腸桿菌遺傳密碼子第3位堿基的GC平均含量（55.62%）。研究表明，竹節(jié)參對(duì)密碼子使用并無特殊堿基偏好，其密碼子使用模式與大腸桿菌和釀酒酵母差異較大，與畢赤酵母差異略小。如圖1所示，中性繪圖分析表明，竹節(jié)參密碼子GC12取值范圍為31.7%～71.8%，GC3的取值范圍為10.7%～83.9%，GC3s與GC12的相關(guān)系數(shù)為0.062，回歸系數(shù)為0.48，表明并無顯著相關(guān)性，說明竹節(jié)參基因密碼子使用模式主要受到自然選擇的影響。

2.2 竹節(jié)參基因有效密碼子數(shù)分析

研究顯示，竹節(jié)參ENC值一般在25.88～61.00，ENC平均值為53.04。通常將ENC值=35作為衡量密碼子偏好性強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)[22]。竹節(jié)參基因有13條ENC值小于35，表明竹節(jié)參基因整體水平密碼子偏好性較低，只有少數(shù)基因具有密碼子偏好性。由表2的ENC相關(guān)性分析可知，GC與GC12、GC3之間的相關(guān)性均達(dá)極顯著水平，GC12和GC3之間并沒有明顯的相關(guān)性，密碼子成分不相同，而ENC值與密碼子數(shù)的相關(guān)性也沒有達(dá)到顯著水平，說明密碼子數(shù)對(duì)ENC的影響很弱，排除了基因長(zhǎng)度過短對(duì)密碼子偏好性的影響。如圖2所示，ENC-GC3s繪圖分析結(jié)果表明大部分竹節(jié)參基因均分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線的周圍，而小部分基因則分布在距標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)的位置，說明竹節(jié)參表達(dá)基因密碼子使用模式不僅受到自然選擇的影響，同時(shí)也受到突變壓力作用的影響。

2.3 同義密碼子的相對(duì)使用度及最優(yōu)密碼子分析

如表3所示，竹節(jié)參共有28個(gè)密碼子的RSCU值大于1，說明這28個(gè)密碼子可能是竹節(jié)參偏好使用的。除去Trp和Met（只有1種密碼子編碼）外，編碼Phe、Ser、Leu、Tyr、Cys、His等氨基酸的密碼子及終止密碼子存在較大的偏好性，RSCU>1的密碼子主要以U和A結(jié)尾。如表4所示，對(duì)竹節(jié)參基因進(jìn)行高、低表達(dá)樣本庫(kù)比較，篩選出竹節(jié)參轉(zhuǎn)錄組樣本的最優(yōu)密碼子共31個(gè)，分別是UUU、UUA、UUG、CUU、CUA、AUU、AUA、GUU、GUA、UAU、CAU、CAA、AAU、AAA、GAU、GAA、UCU、UCA、CCU、CCA、ACU、ACA、GCU、GCA、UGU、CGU、AGU、AGA、AGG、GGU、GGA，它們分別編碼苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸和甘氨酸共18個(gè)氨基酸，其中Arg有4個(gè)最優(yōu)密碼子。在這31個(gè)最優(yōu)密碼子中，除了UUG是以G結(jié)尾外，其他密碼子均是以A或T結(jié)尾的，說明竹節(jié)參偏好使用以A/T結(jié)尾的密碼子。

2.4 PR2-plot分析

通過PR2-plot分析，表明了竹節(jié)參各基因密碼子中4個(gè)堿基組分嘌呤（A和G）與嘧啶（T和C）之間的關(guān)系，如圖3所示，4個(gè)堿基均不均衡使用，竹節(jié)參密碼子第3位堿基T的使用頻率大于堿基A，堿基G的使用頻率大于堿基C，表明竹節(jié)參基因密碼子使用模式受到突變壓力和自然選擇等多重因素的影響。

3 討論

每種生物的特有密碼子使用模式是物種為適應(yīng)自然環(huán)境而進(jìn)化形成的。作為生物基因組中堿基組成的一項(xiàng)重要指標(biāo)，GC含量的高低表明了生物突變方向性的頻數(shù)大小。研究表明，密碼子第3位上GC堿基的含量受到突變壓力的影響較小，因此GC3s含量通常被作為分析密碼子使用模式的一個(gè)主要參數(shù)。本研究分析竹節(jié)參基因GC含量分布情況，發(fā)現(xiàn)平均GC含量和GC12比較接近（均低于50%），表明所有竹節(jié)參基因中整體AU含量略高于GC，且密碼子主要以A和U結(jié)尾。相比于畢赤酵母，其密碼子使用模式與大腸桿菌和釀酒酵母的差異更大。多數(shù)研究者對(duì)高等植物如水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、大麥（Hordeum vulgare）、真菌與一些單細(xì)胞微生物如鐮狀瘧原蟲（Plasmodium falciparum）、支原體（Mycoplasmacapricolum）和植物線粒體微基因組中密碼子的使用模式進(jìn)行了研究，結(jié)果表明高等植物基因密碼子中GC含量相對(duì)較高且趨于以G/C結(jié)尾[25]，在低等生物中則AU含量明顯高于GC含量[26-31]。研究表明，物種密碼子使用模式在形成過程中往往受到很多因素的影響，如突變壓力和自然選擇等。本研究中中性繪圖分析結(jié)果表明，GC12與GC3s二者之間其實(shí)不存在明顯的相關(guān)性;ENC-plot分析表明，竹節(jié)參基因大部分均分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線周圍，而小部分基因則分布于距標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)的位置;PR2-plot 分析發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)密碼子A、C、T和G 4個(gè)堿基使用不均衡，結(jié)合中性繪圖、ENC-plot和 PR2-plot綜合分析表明，竹節(jié)參基因密碼子使用模式受到突變壓力和自然選擇等多重因素的影響。通過高偏性與低偏性基因庫(kù)RSCU值的比較，利用ΔRSCU大小等級(jí)劃分以確定最優(yōu)密碼子[32-35]，本研究中通過此方法篩選出竹節(jié)參基因偏好密碼子共31個(gè)，在31個(gè)密碼子中，除了UUG外，其余最優(yōu)密碼子均以A或T結(jié)尾，以此推測(cè)竹節(jié)參基因密碼子的偏好性與GC3s含量呈負(fù)相關(guān)。有研究者對(duì)長(zhǎng)春花[36]、小麥[23]等植物密碼子使用模式進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)密碼子大多是以A/T結(jié)尾的，且通常表現(xiàn)出對(duì)嘌呤堿基U的偏好強(qiáng)于嘌呤堿基A，與本研究結(jié)果相似。本研究以竹節(jié)參轉(zhuǎn)錄組為數(shù)據(jù)來源，研究其密碼子使用模式，確定竹節(jié)參表達(dá)基因的最優(yōu)密碼子，一方面可以利用密碼子優(yōu)化對(duì)外源基因進(jìn)行密碼子改造，提高外源基因在竹節(jié)參中的表達(dá)水平，同時(shí)也為竹節(jié)參相關(guān)基因的異源表達(dá)及分子育種等提供了理論依據(jù)。

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