UPLC-Q/TOF-MS法同時(shí)測(cè)定竹節(jié)參及其總皂苷中13個(gè)指標(biāo)成分

龍 健，周昌園，田 力,3，涂 星,3，胡雪黎,3，時(shí)嘉琪，劉 丹，聶 娟,3，劉可云，楊 寶,3*

1.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部(湖北 恩施 445000) 2.湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院(湖北 恩施 445000) 3.湖北民族大學(xué) 武陵山中藥材檢驗(yàn)檢測(cè)中心(湖北 恩施 445000)

竹節(jié)參為五加科人參屬植物竹節(jié)參PanaxjaponicusC.A.Mey.的干燥根莖，收載于《土家族藥物志》和2020版《中國(guó)藥典》，是恩施地區(qū)的道地藥材，藥用功能類似三七和人參，甘、微苦，性溫，歸肝、脾、肺經(jīng)，具有散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳、補(bǔ)虛強(qiáng)壯的功效，常用于病后虛弱，勞嗽咯血，跌撲損傷等[1-2]?，F(xiàn)代植物化學(xué)和藥理學(xué)研究表明[3-7]竹節(jié)參富含三萜皂苷類和糖類成分，另含少量的氨基酸類和揮發(fā)油類成分，其中總皂苷部位具有較好的降血脂、降血糖、抗脂肪肝、減肥活性。

中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性和多樣性是其發(fā)揮藥效的基礎(chǔ)，同時(shí)也是其質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制的難點(diǎn)，建立含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)盡可能較為全面地反映其內(nèi)在質(zhì)量。2020版《中國(guó)藥典》竹節(jié)參含量測(cè)定項(xiàng)下是以竹節(jié)參皂苷V和竹節(jié)參皂苷Ⅳa作為質(zhì)控成分，這只是對(duì)其質(zhì)量控制的最基本要求，尚不能較為全面地反映其化學(xué)成分的復(fù)雜性和多樣性[2]。針對(duì)竹節(jié)參化學(xué)成分特點(diǎn)，且總皂苷是其主要活性部位，建立多皂苷類成分同時(shí)測(cè)定的方法更具有整體性和實(shí)用性。目前竹節(jié)參指標(biāo)成分含量測(cè)定的方法主要有液相色譜法[2，8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]。相比于上述方法，超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC-Q/TOF-MS)的分辨率和靈敏度更高，在定量分析的同時(shí)還能夠根據(jù)精確分子量確證。考慮到竹節(jié)參皂苷類成分的結(jié)構(gòu)相似度較高，普通液相色譜分離較為困難，UPLC-Q/TOF-MS更加適合其定量分析。

本實(shí)驗(yàn)首先報(bào)道了一種快速制備竹節(jié)參總皂苷部位的方法，其總皂苷的含量高達(dá)84.1%。在此基礎(chǔ)上建立了測(cè)定竹節(jié)參及其總皂苷部位中人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd含量的UPLC-Q/TOF-MS方法，以期更加快速和全面地對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量分析和控制。

1 儀器與材料

1.1儀器Acquity UPLC超高效液相色譜儀、Xevo G2-XS Q/TOF型質(zhì)譜儀、UNIFI數(shù)據(jù)處理軟件、Acquity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，美國(guó)Waters公司；梅特勒ME204分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TD5A-WS型離心機(jī)，湖南相儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司。

1.2材料對(duì)照品20S-人參皂苷Rbl(批號(hào)MUST-20060101)、20S-人參皂苷Rd(批號(hào)MUST-20072210)均購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司。對(duì)照品20S-人參皂苷Rb2(批號(hào)wkq21062404)、20S-人參皂苷Rb3(批號(hào)wkq21062405)、竹節(jié)參皂苷IV(批號(hào)wkq21052810)、20R-人參皂苷Rh1(批號(hào)wkq21090609)、20S-人參皂苷Rg2(批號(hào)111779-200801)均購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司。對(duì)照品竹節(jié)參皂苷V(批號(hào)111903-202106)、20S-人參皂苷Re(批號(hào)110754-202129)、20S-人參皂苷Rf(批號(hào)111719-201806)、20S-人參皂苷Rg1(批號(hào)110703-202034)、竹節(jié)參皂苷IVa(批號(hào)111861-201102)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。對(duì)照品擬人參皂苷RT1(批號(hào)J24GB155864)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。質(zhì)譜級(jí)乙腈、甲醇購(gòu)自德國(guó)Merck公司；色譜級(jí)甲酸購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。9批次(S1～S9)竹節(jié)參藥材采集于湖北省宣恩縣，經(jīng)湖北民族大學(xué)涂星講師鑒定為五加科植物竹節(jié)參PanaxjaponicusC.A.Mey.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1竹節(jié)參乙醇提取物及總皂苷的制備竹節(jié)參干燥藥材2.8 kg(同含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)S3批次)，粉碎成粗粉后用乙醇(37 L)滲濾提取，提取液濃縮干燥后即得605 g乙醇提取物(TQ)。取417 g乙醇提取物經(jīng)大孔樹(shù)脂分離，依次用蒸餾水(25 L)、20%乙醇-水(25 L)、80%乙醇-水(30 L)和95%乙醇-水(25 L)洗脫，回收80%乙醇-水部分洗脫液即得222 g竹節(jié)參總皂苷(TS)，測(cè)得竹節(jié)參乙醇提取物和總皂苷部位中總皂苷的含量分別為49.2%和84.1%。

2.2供試品溶液的制備取9批次竹節(jié)參藥材及“2.1”項(xiàng)下竹節(jié)參乙醇提取物和總皂苷部位粉末約0.2 g，加60%甲醇25 mL，密塞，稱量，室溫下超聲處理40 min，冷卻至室溫，再稱量，用60%甲醇補(bǔ)足差量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)。取0.5 mL竹節(jié)參藥材濾液，用60%甲醇分別稀釋40倍和1 000倍作為供試品溶液；取0.5 mL竹節(jié)參乙醇提取物濾液，用60%甲醇分別稀釋80倍和2 000倍作為供試品溶液；取0.5 mL竹節(jié)參總皂苷部位濾液，用60%甲醇分別稀釋125倍和4 000倍作為供試品溶液。

2.3對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd對(duì)照品適量，用色譜甲醇配置成質(zhì)量濃度為1.29、1.25、0.69、1.06、0.95、1.21、1.01、0.78、1.03、1.03、1.05、0.95、1.05 mg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度依次為1 000、1 000、1 000、1 000、1 000、1 000、2 500、1 000、1 000、1 000、1 250、2 500、500 ng/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.4色譜質(zhì)譜條件

2.4.1 色譜條件 Waters UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)。乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)梯度洗脫，0～3.0 min，15%～25%A；3.0～5.0 min，25%～29%A；5.0～11.0 min，29%～35%A;11.0～15.0 min，35%～75%A。流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量1.5 μL，柱溫40℃。

2.4.2 質(zhì)譜條件 Waters Xevo G2 Q-Tof質(zhì)譜儀，ESI負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，毛細(xì)管電壓-2.5 kV，錐孔電壓-40 V，脫溶劑氣溫度550℃，脫溶劑氣流量900 L/h，掃描范圍m/z 400～1 200，用亮氨酸腦啡肽實(shí)時(shí)校正質(zhì)量軸，采用一級(jí)質(zhì)譜定量，具體定量參數(shù)見(jiàn)表1。13個(gè)成分在混合對(duì)照品和樣品中的定量離子色譜圖見(jiàn)圖1，結(jié)果表明樣品測(cè)定無(wú)明顯干擾，該方法專屬性良好。

表1 13個(gè)成分的質(zhì)譜參數(shù)

2.5方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用色譜甲醇稀釋為系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，按上述色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以峰面積(Y)對(duì)待測(cè)物濃度(X)做線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并以S/N=10計(jì)算定量下限(LOQ)，見(jiàn)表2。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，按上述色譜質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd峰面積的RSD分別為1.07%、1.52%、0.99%、1.12%、0.91%、1.71%、0.99%、1.08%、1.68%、1.45%、1.20%、1.39%、1.65%，表明儀器的精密度良好。

注：1：人參皂苷Re；2：人參皂苷Rd；3：人參皂苷Rg1；4：人參皂苷Rf；5：人參皂苷Rg2；6：人參皂苷Rh1；7：人參皂苷Rb1；8：竹節(jié)參皂苷V；9：人參皂苷Rb2；10：人參皂苷Rb3；11：擬人參皂苷RT1；12：竹節(jié)參皂苷IV；13：竹節(jié)參皂苷IVa；A：對(duì)照品；B：樣品。圖1 化合物1-13的提取離子流圖(負(fù)離子模式)

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液(S3)，按上述色譜質(zhì)譜條件分別在0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣，記錄峰面積。人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd峰面積的RSD分別為1.32%、1.92%、1.37%、1.11%、1.37%、1.75%、0.98%、1.81%、1.75%、1.68%、1.39%、1.73%、1.77%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品(S3)6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示樣品中人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd的平均含量分別為5.54、4.19、0.90、0.19、0.04、2.01、88.12、0.04、1.42、0.12、52.77、8.60、0.53 mg/g。RSD分別為1.68%、1.71%、1.02%、1.76%、1.14%、1.98%、0.75%、1.55%、1.46%、0.49%、1.51%、1.78%、0.77%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批次竹節(jié)參樣品(S3)6份，0.1 g，精密加入13個(gè)成分的對(duì)照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd的平均加樣回收率分別為98.96%、98.45%、99.33%、97.57%、100.86%、100.45%、99.83%、99.22%、97.50%、100.29%、99.24%、100.05%、97.27%，RSD分別為2.68%、1.95%、2.15%、1.86%、2.25%、1.88%、2.79%、2.46%、2.01%、2.99%、0.91%、1.08%、1.21%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.6 樣品含量測(cè)定 稱取9批竹節(jié)參藥材、1批次竹節(jié)參乙醇提取物、1批次竹節(jié)參總皂苷，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，通過(guò)回歸方程計(jì)算含量，見(jiàn)表3。9批竹節(jié)參藥材中13個(gè)成分含量的熱圖見(jiàn)圖2。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3,mg/g)

圖2 9批次竹節(jié)參藥材中13種成分含量熱圖

3 討論

3.1指標(biāo)成分的選擇三萜皂苷類是竹節(jié)參中的主要成分，具有較好的降血脂、降血糖、抗脂肪肝活性。目前從竹節(jié)參中已分離鑒定了110多個(gè)三萜皂苷類成分，多數(shù)是以齊墩果酸、人參二醇、人參三醇為基本母核，連接一至數(shù)個(gè)配糖基形成的苷類[3]。課題組采用UPLC-Q/TOF-MSe技術(shù)結(jié)合UNIFI分析平臺(tái)對(duì)竹節(jié)參的化學(xué)成分進(jìn)行了全面分析，結(jié)果表明人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd在各批次樣本中的含量較高，且無(wú)明顯干擾。藥理學(xué)研究表明[4，10-11]竹節(jié)參皂苷Ⅴ、擬人參皂苷RT1、竹節(jié)參皂苷Ⅳ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re等均具有較好的生物活性。因此，本研究選擇以上13種成分作為竹節(jié)參藥材多成分含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

3.2色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化本研究考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)樣品中各色譜峰形及分離度的影響，特別是針對(duì)竹節(jié)參中多對(duì)同時(shí)存在的R和S構(gòu)型人參皂苷類成分，結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，可在較短時(shí)間內(nèi)分離各化合物。13個(gè)指標(biāo)成分在ESI源負(fù)離子檢測(cè)模式下的響應(yīng)明顯高于正離子模式，主要形成[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰和[M+HCOO]-加合離子峰，在上述色譜和質(zhì)譜條件下[M+HCOO]-加合離子峰的響應(yīng)更高且信號(hào)較為穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了[M+HCOO]-加合離子峰作為定量離子。

3.3指標(biāo)成分的含量分析如表3和圖2所示，13種成分在9批次竹節(jié)參藥材中的含量范圍依次為0.70～7.71、0.77～10.77、0.07～1.23、0.06～1.08、0.01～2.97、0.75～5.04、43.99～95.06、0.02～0.08、0.49～27.86、0.05～0.22、18.74～61.40、2.40～30.83、0.03～1.74 mg/g，除竹節(jié)參皂苷V(人參皂苷Ro)、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa外，其余10種成分的含量相對(duì)較低。不同批次間13個(gè)指標(biāo)成分含量差異較大，可能與種質(zhì)資源、種植環(huán)境、種植方式和生長(zhǎng)年限有關(guān)。2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定竹節(jié)參中含竹節(jié)參皂苷V和竹節(jié)參皂苷Ⅳa分別不得低于15.0 mg/g，本研究中僅S5批次兩種指標(biāo)成分的含量符合規(guī)定，合格率僅為11.1%。其余8批次僅竹節(jié)參皂苷V的含量符合標(biāo)準(zhǔn)(遠(yuǎn)高于15.0 mg/g)，竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量均未達(dá)標(biāo)，這與其他單位檢測(cè)宣恩產(chǎn)竹節(jié)參的結(jié)論基本一致。

竹節(jié)參主要生長(zhǎng)于高海拔地區(qū)，目前野生資源儲(chǔ)量不多[3,12]。為了滿足藥用需求，研究人員對(duì)竹節(jié)參野生品種進(jìn)行低海拔山區(qū)馴養(yǎng)或轉(zhuǎn)家養(yǎng)，生長(zhǎng)環(huán)境的改變以及種質(zhì)資源的優(yōu)劣不可避免地會(huì)影響竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量。宣恩地區(qū)為提高竹節(jié)參的品質(zhì)，應(yīng)該優(yōu)化其種質(zhì)、種植環(huán)境、田間管理以及采收時(shí)間。另外，竹節(jié)參皂苷IV在9批次藥材中的含量較高，平均含量為42.22 mg/mg，且竹節(jié)參皂苷IV的藥理活性也較好[4,10]，因此在后期《中國(guó)藥典》竹節(jié)參含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)，應(yīng)考慮納入竹節(jié)參皂苷IV作為質(zhì)控成分。

本研究還報(bào)道了一種快速制備竹節(jié)參總皂苷的方法，即采用乙醇滲濾提取，大孔樹(shù)脂一步法快速富集。結(jié)果竹節(jié)參總皂苷中竹節(jié)參皂苷V、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa的含量依次為363.14、238.25、51.56 mg/g，13種指標(biāo)性成分的總含量為773.95mg/g(占比84.36%)，富集效果非常明顯，可以用于后續(xù)的藥效學(xué)研究。

綜上所述，本研究報(bào)道了一種快速制備竹節(jié)參總皂苷部位的方法，總皂苷部位中總皂苷的含量高達(dá)84.1%，富集效果明顯。本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-Q/TOF-MS建立了一種同時(shí)測(cè)定竹節(jié)參藥材和總皂苷部位中13種指標(biāo)成分含量的方法，該方法簡(jiǎn)單快速，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，可用于竹節(jié)參藥材和總皂苷的質(zhì)量評(píng)價(jià)，以及為《中國(guó)藥典》竹節(jié)參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)地提升提供參考依據(jù)。