不同產(chǎn)地竹節(jié)參中7種皂苷含量測(cè)定及化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)

張思敏 張 也 伍紅年，3 劉隆基 申佩瑤 嚴(yán)建業(yè) 楊 磊

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；3. 瀏陽(yáng)市人民醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410399；4. 中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

竹節(jié)參(PanaxjaponicusC.A.Mey.)為五加科人參屬植物，以干燥根莖入藥，也具有較高的食用價(jià)值。云南獨(dú)龍族將竹節(jié)參與鮮肉、雞蛋一同煎煮作為藥膳，用于病后補(bǔ)虛及改善虛勞咳嗽等癥狀[1]；在土家族居住區(qū)，人們用其泡酒服用[2]。竹節(jié)參主要化學(xué)成分為皂苷、多糖、氨基酸以及揮發(fā)油[3-4]等。研究表明，竹節(jié)參皂苷具有抗?jié)僛5]、抗腫瘤[6]、抗腦缺血損傷[7]、保護(hù)心臟[8]、保肝[9]、降血脂[10-11]及抗炎鎮(zhèn)痛[12-14]等功效。其保健功效也被挖掘，如降血脂、降血糖[3]的藥理作用可用于預(yù)防“三高”；抗氧化[15]的藥理作用可用于延緩衰老；竹節(jié)參皂苷Ⅳa對(duì)脂肪細(xì)胞分化有明顯的抑制作用可用于減肥，有望成為減肥產(chǎn)品的功能性食品原料[16]。但由于對(duì)竹節(jié)參過(guò)度挖掘，導(dǎo)致其野生資源銳減。又因人工栽培技術(shù)不成熟，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，限制了竹節(jié)參的應(yīng)用。為更好推進(jìn)竹節(jié)參在臨床和生活中廣泛使用，加強(qiáng)對(duì)其指標(biāo)性成分的質(zhì)量控制至關(guān)重要。

《中國(guó)藥典》2020版采用HPLC法測(cè)定其中的人參皂苷Ro(竹節(jié)參皂苷Ⅴ)和竹節(jié)參皂苷Ⅳ來(lái)控制質(zhì)量，而這兩個(gè)成分的定量不能較全面地控制竹節(jié)參藥材質(zhì)量。目前研究植物中功能性成分定量分析的方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、超高效液相色譜法(UPLC)等[17-19]。由于UPLC法具有靈敏度、分辨率以及柱效好，分離效率高，消耗溶劑少等特點(diǎn)[20]，而且未見采用UPLC法同時(shí)測(cè)定竹節(jié)參中的7種皂苷類成分的相關(guān)報(bào)道。

研究擬建立測(cè)定竹節(jié)參中7種皂苷類成分含量的UPLC法，并采用聚類分析、主成分分析與質(zhì)量波動(dòng)分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)手段進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為竹節(jié)參的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

9批竹節(jié)參樣品(詳細(xì)信息見表1)：經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)龔力民副教授鑒定為五加科人參屬植物竹節(jié)參PanaxjaponicasC.A.Mey的干燥根莖；

表1 樣品信息Table 1 Sample information

人參皂苷Rg1(批號(hào)wkq15121303)、人參皂苷Re(批號(hào)wkq16081605)、人參皂苷Rb1(批號(hào)wkq16060402)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司；

竹節(jié)參皂苷Ⅴ(批號(hào)HG027158198)、竹節(jié)參皂苷Ⅳ(批號(hào)HA305950198)、竹節(jié)參皂苷Ⅳa(批號(hào)HC027157198)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，寶雞市辰光生物科技有限公司；

假人參皂苷RT1(批號(hào)170726)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，成都普菲生物技術(shù)有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國(guó)默克股份有限公司；

試驗(yàn)用水均為超純水；

其他均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超高效液相色譜儀：Waters ACQUITY UPLC型，美國(guó)Waters公司；

超純水儀：Option R7 utra AN型，英國(guó)ELGA LabWaters公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

分析天平：ME204/02型，梅特勒—托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 參考文獻(xiàn)[21]。分別精密稱定人參皂苷Rg1、Re、Rb1、竹節(jié)參皂苷Ⅴ、Ⅳ、Ⅳa與假人參皂苷RT1各對(duì)照品適量，分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到含人參皂苷Rg1(100 μg/mL)、Re(68 μg/mL)、Rb1(102 μg/mL)、竹節(jié)參皂苷Ⅴ(1 500 μg/mL)、Ⅳ(700 μg/mL)、Ⅳa(800 μg/mL)，假人參皂苷RT1(440 μg/mL)的混合對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 將不同來(lái)源竹節(jié)參藥材制成粉末狀，精密稱取過(guò)40目篩的各批次粉末1.0 g，置于錐形瓶中，加70%的甲醇50 mL，稱重，加熱回流提取1 h，冷卻至室溫，再次稱重，并用70%的甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

1.2.3 色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱；流動(dòng)相為水(A)—乙腈(B)，梯度洗脫，0.0～3.5 min，79.0% A；3.5～6.0 min，79.0%～74.0% A；6.0～6.5 min，74.0%～66.3% A，6.5～13.0 min，66.3%～65.0% A，13.0～14.0 min，65.0%～79.0% A；流速0.4 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

1.2.4 方法學(xué)考察

(1)專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 μL，按1.2.3的條件進(jìn)行測(cè)定。

(2)線性關(guān)系考察：參照文獻(xiàn)[21]。

(3)精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[21]。

(4)加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量供試品(S6)0.5 g，加入適量各對(duì)照品，精密稱定。

1.2.5 含量測(cè)定 分別取不同產(chǎn)地的竹節(jié)參樣品，按1.2.2的方法制備樣品溶液，按1.2.3的條件進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算各皂苷成分的含量。

1.2.6 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

(1)聚類分析：以S1～S9樣品中7個(gè)成分含量為變量，采用組間聯(lián)接，并選擇“平方Euclidean 距離”法進(jìn)行聚類分析。

(2)主成分分析：對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)地竹節(jié)參7種皂苷類成分的含量標(biāo)準(zhǔn)化處理后，對(duì)處理結(jié)果進(jìn)行主成分(PCA)分析。

(3)質(zhì)量波動(dòng)分析：為探究竹節(jié)參樣品間的質(zhì)量，參照文獻(xiàn)[22—23]引入?yún)?shù)P值，對(duì)各產(chǎn)地竹節(jié)參藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，按式(1)計(jì)算質(zhì)量波動(dòng)值。

(1)

式中：

P——質(zhì)量波動(dòng)值；

Ci——給定化合物的含量，μg/mL；

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用SPSS 22.0數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行聚類分析和主成分分析；運(yùn)用Origin 2019進(jìn)行質(zhì)量波動(dòng)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性試驗(yàn) 由圖1可知，供試品溶液的色譜峰與混合對(duì)照品的呈現(xiàn)出相同保留時(shí)間，此外，在空白對(duì)照色譜圖中對(duì)應(yīng)位置處無(wú)色譜峰，表明該方法專屬性良好。

2.1.2 線性關(guān)系的考察 將混合對(duì)照品溶液配制為系列質(zhì)量濃度，按1.2.3的條件進(jìn)樣分析，對(duì)7種皂苷類成分進(jìn)行線性關(guān)系考察，結(jié)果見表2。由表2可知，竹節(jié)參各皂苷成分在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 7種指標(biāo)成分的回歸方程及線性范圍Table 2 Regression equation and linear range of seven index components

2.1.3 精密度試驗(yàn) 取S6樣品，按1.2.2的方法制備供試品溶液，按1.2.3的條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得竹節(jié)參各皂苷成分的色譜峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.20%，0.34%，1.34%，0.59%，0.49%，0.47%，1.20%，表明儀器的精密度結(jié)果良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S6樣品，按1.2.2的方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h按1.2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得竹節(jié)參中各皂苷成分色譜峰峰面積的RSD依次為1.57%，1.23%，2.67%，1.26%，2.05%，2.05%，1.88%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取S6樣品，按1.2.2的方法平行制備6份供試品溶液，按1.2.3的條件進(jìn)樣分析，測(cè)得竹節(jié)參中各皂苷成分色譜峰峰面積的RSD依次為0.23%，0.40%，2.85%，0.23%，0.31%，0.33%，0.27%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取S6樣品0.5 g，加入適量各對(duì)照品，精密稱定。按1.2.2的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。由表3可知，各皂苷平均回收率均在95%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%，表明該方法的回收率良好。

表3 7種指標(biāo)成分的加樣回收試驗(yàn)Table 3 Spike-and-recovery experience of seven index components (n=5) %

1.人參皂苷Rg1 2.人參皂苷Re 3.人參皂苷Rb1 4.竹節(jié)參皂苷Ⅴ 5.假人參皂苷RT1 6.竹節(jié)參皂苷Ⅳ 7.竹節(jié)參皂苷Ⅳa圖1 混合對(duì)照品溶液、竹節(jié)參樣品溶液及空白的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference solution,sample solution of Panax japonicus and blank

2.2 樣品含量測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，各批次竹節(jié)參中各皂苷成分含量結(jié)果見表4。為充分展示各批次竹節(jié)參中7種成分含量的分布特征，以測(cè)得的含量結(jié)果作雷達(dá)圖，見圖2。由于各批次各成分含量相差很大，作圖時(shí)，對(duì)各成分含量進(jìn)行修正，使各成分含量乘以修正系數(shù)，各系數(shù)定：竹節(jié)參皂苷Ⅴ為1，人參人參皂苷Rg1為15，人參皂苷Re為30，人參皂苷Rb1為15，人參皂苷RT1為10，竹節(jié)參皂苷Ⅳ為2，竹節(jié)參皂苷Ⅳa為3。由表4可知，竹節(jié)參皂苷V在各批次竹節(jié)參樣品中含量較高，其次是竹節(jié)參皂苷Ⅳ、Ⅳa；人參皂苷Rb1與假人參皂苷RT1在S6中含量較其他樣品高。由圖2可知，S6、S7與S8的整體輪廓圖相對(duì)較大，由于這3個(gè)批次中的假人參皂苷RT1含量相對(duì)較高，特別是S6的輪廓圖形與其他各批次的輪廓圖差異性較大，由于S6中的7個(gè)成分含量均較高；而其他批次的竹節(jié)參的整體輪廓圖相似，表明其他批次各成分含量更為均勻。

圖2 不同批次竹節(jié)參樣品7種皂苷含量的雷達(dá)圖Figure 2 Radar images of seven saponins in different batches of Panax japonicus samples

表4 不同批次竹節(jié)參樣品皂苷含量測(cè)定平均結(jié)果Table 4 Determination average results of different batches of Panax japonicus samples (n=3) mg/g

《中國(guó)藥典》2020版規(guī)定，竹節(jié)參皂苷Ⅴ(人參皂苷Ro)與竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量≥1.5%。由含量測(cè)定結(jié)果可知，試驗(yàn)9批不同產(chǎn)地竹節(jié)參樣品中，竹節(jié)參皂苷Ⅴ含量為42.91～97.16 mg/g，竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量為15.76～32.66 mg/g，均明顯高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，并且這兩個(gè)成分在9個(gè)批次樣品中的質(zhì)量波動(dòng)較小。但某些成分在不同產(chǎn)地間含量波動(dòng)較大，說(shuō)明產(chǎn)地是造成竹節(jié)參質(zhì)量差異的原因之一。

2.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.3.1 聚類分析 對(duì)各批次樣品的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行聚類分析見圖3。由圖3可知，當(dāng)距離介于15～20時(shí)主要聚為3類，其中，四川雅安(S7)、四川樂(lè)安(S8)以及湖北神農(nóng)架(S3)為Ⅰ類；湖北恩施(S1)、湖南石門(S4)、江西吉安(S5)、貴州貴陽(yáng)(S2)以及云南麗江(S9)為Ⅱ類；四川大涼山(S6)為Ⅲ類。

圖3 竹節(jié)參樣品聚類分析樹狀圖Figure 3 Cluster analysis tree of Panax japonicus samples

2.3.2 主成分分析 為進(jìn)一步探討竹節(jié)參不同產(chǎn)地間的差異，采用主成分分析進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見表5。由表5可得，前3個(gè)因子累計(jì)貢獻(xiàn)率為90.635。由圖4可知，前3個(gè)成分特征值下降較快，因此折線較為陡峭，其余成分特征值變化較為平緩。取特征值>1的成分作圖，結(jié)果見圖5。由圖5可知，9批樣品可分為3類，S6為Ⅰ類，S7、S8、S3為Ⅱ類，S1、S2、S4、S5、S9為Ⅲ類，與聚類分析結(jié)果一致。

圖4 不同產(chǎn)地竹節(jié)參主成分分析碎石圖Figure 4 Detritus diagram of principal component analysis of Panax japonicus from different habitats

圖5 不同產(chǎn)地竹節(jié)參主成分分析二維圖Figure 5 Two-dimensional principal component analysis of Panax japonicus in different regions

表5 主成分初始特征值和貢獻(xiàn)率Table 5 Initial eigenvalue and contribution rate of principal components

綜合聚類分析和主成分分析并觀察各成分含量可發(fā)現(xiàn)，四川大涼山樣品中人參皂苷Rg1與假人參皂苷RT1含量明顯高于其他批次，提示這可能是造成差異的原因之一。其次，竹節(jié)參大多生于高山灌叢陰濕地或巖石溝澗旁，地理位置與生長(zhǎng)環(huán)境也是導(dǎo)致竹節(jié)參藥材批次間分類的原因。

2.3.3 質(zhì)量波動(dòng)分析 當(dāng)參數(shù)P值越靠近1時(shí)，各批間樣品一致性越好。一般而言，當(dāng)P值在0.75～1.25范圍內(nèi)表明該成分的質(zhì)量波動(dòng)較小，P值過(guò)大或過(guò)小表明該成分質(zhì)量波動(dòng)較大，是竹節(jié)參樣品質(zhì)量波動(dòng)的重要體現(xiàn)。由圖6可知，人參皂苷Rg1、Rb1以及假人參皂苷RT1超出此范圍較多，特別是人參皂苷Rg1與假人參皂苷RT1波動(dòng)范圍較大。結(jié)合表2、聚類分析及主成分分析可知，人參皂苷Rg1、Rb1與假人參皂苷RT1均在樣品S6中含量較高，含量波動(dòng)較大，因此S6被單獨(dú)分為一類，與聚類分析及主成分分析結(jié)果相呼應(yīng)。人參皂苷Re及竹節(jié)參皂苷Ⅴ、Ⅳ的P值基本在0.75～1.25，表明這幾個(gè)成分對(duì)竹節(jié)參的質(zhì)量波動(dòng)影響不大。

圖6 竹節(jié)參樣品7個(gè)成分的Box-chart圖Figure 6 Box-chart plot of seven components of Panax japonicus sample

3 結(jié)論

建立了采用UPLC同時(shí)測(cè)定竹節(jié)參藥材中7種皂苷類成分含量的方法，該法柱效高，出峰快，耗能少；并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)中的聚類分析、主成分分析與質(zhì)量波動(dòng)分析對(duì)竹節(jié)參藥材質(zhì)量的優(yōu)劣進(jìn)行了評(píng)價(jià)。研究結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的竹節(jié)參藥材各皂苷類成分含量均有較大的差異。竹節(jié)參皂苷V、竹節(jié)參皂苷Ⅳ以及竹節(jié)參皂苷Ⅳa 3種皂苷在各批次竹節(jié)參藥材中含量較高，其中竹節(jié)參皂苷V>竹節(jié)參皂苷Ⅳ>竹節(jié)參皂苷Ⅳa；人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1與假人參皂苷RT1含量則較低，特別是竹節(jié)參皂苷V與竹節(jié)參皂苷Ⅳ均高于藥典標(biāo)準(zhǔn)。竹節(jié)參中含有豐富的化學(xué)成分，試驗(yàn)僅對(duì)竹節(jié)參藥材中7種皂苷成分含量測(cè)定進(jìn)行了研究，若要全面評(píng)價(jià)竹節(jié)參藥材質(zhì)量還可以對(duì)竹節(jié)參中更多的成分及活性進(jìn)行系統(tǒng)研究。