大豆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究進(jìn)展綜述

劉佳偉+姚丹+趙東海+石放放

摘 要：大豆是世界上最重要的油料作物之一，同時(shí)也是人類食物和動(dòng)物飼料的主要來(lái)源。隨著第二代基因組高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，錄組組測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展給生物基因組學(xué)的研究帶來(lái)了深刻的影響。轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能和基因結(jié)構(gòu)揭示特定生物學(xué)過(guò)程以及疾病發(fā)生過(guò)程中的分子機(jī)理。該文主要簡(jiǎn)述了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序主要方法及其在大豆研究中的應(yīng)用，為今后該技術(shù)的研究與應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：大豆；轉(zhuǎn)錄組；高通量測(cè)序技術(shù)

中圖分類號(hào) S511.2+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）08-17-05

Research Status of Soybean Transcriptome Sequencing

Liu Jiawei1 et al.

（1College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Jilin 130118，China）

Abstract：Soybean is one of the world's most important oil crops，also is the main source of human food and animal feed.As the second generation of high-throughput genome sequencing technology widespread application，the rapid development of sequencing technology has brought the profound influence on biological genomics research.From the overall level of gene function and gene structure，transcriptome research revealed the specific molecular mechanism in the process of biological processes and disease.This article mainly introduced the transcriptome sequencing of main methods and its application in soybean research，providing a reference for future research and application of the technology.

Key words：Soybean；Transcriptome；High-throughput sequencing

轉(zhuǎn)錄組（Transcriptome）的概念最早是由Velculescu等于1995年提出，廣義上講轉(zhuǎn)錄組是指在某一生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，包括mRNA（編碼RNA）和tRNA、rRNA、snRNA等非編碼RNA；狹義上講是指所有mRNA的總和。與基因組具有靜態(tài)實(shí)體的特點(diǎn)不同，轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)具有動(dòng)態(tài)性，它既受外源因子的影響也受內(nèi)源因子的調(diào)控，可以準(zhǔn)確反映出生物個(gè)體特定細(xì)胞、組織和器官在某一特定生長(zhǎng)發(fā)育階段細(xì)胞中所有表達(dá)基因的水平；同時(shí)也可以用來(lái)比較不同組織或不同生理?xiàng)l件下基因表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)與特定生理功能相關(guān)的新基因，并預(yù)測(cè)未知基因。目前轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。RNA測(cè)序可以產(chǎn)生基因表達(dá)的大量信息，并避免DNA微矩陣分析方法的許多固有的缺陷，隨著擬南芥、水稻、棉花、馬鈴薯、玉米、大豆等植物的全基因組測(cè)序的完成，越來(lái)越多的研究者使用RNA測(cè)序技術(shù)研究不同環(huán)境條件下或不同生長(zhǎng)發(fā)育階段植物的基因表達(dá)模式，為理解基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及挖掘與特定性狀相關(guān)的候選基因提供大量重要的信息。本文對(duì)近年來(lái)大豆轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在大豆以及其他動(dòng)植物中的應(yīng)用提供可借鑒的依據(jù)。

1 高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)

使用很多不同的方法對(duì)所得到的基因進(jìn)行測(cè)序和基因的比對(duì)，最主要的目的是能夠得到細(xì)胞內(nèi)基因的時(shí)空表達(dá)模式。DNA的測(cè)序方法，例如降解方法是隨著 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)之后相繼出現(xiàn)的，當(dāng)時(shí)的DNA測(cè)序方法操作起來(lái)比較復(fù)雜，因而在科學(xué)領(lǐng)域并沒有形成規(guī)?；纳a(chǎn)和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。Sanger等成功的于1977年構(gòu)建起的測(cè)序方法是鏈終止法，也被稱之為雙脫氧測(cè)序法或Sanger測(cè)序，隨著該測(cè)序方法的出現(xiàn)，DNA的測(cè)序成功的邁向了規(guī)模化與實(shí)用化的道路。但該測(cè)序方法也存在著測(cè)序通量較低，測(cè)序的過(guò)程比較復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間和精力的缺點(diǎn)。隨著羅氏公司的焦磷酸測(cè)序技術(shù)，Illumina公司的Solexa測(cè)序技術(shù)，以及AB公司的SOLiD測(cè)序技術(shù)的相繼問(wèn)世，這些新一代測(cè)序技術(shù)又被稱作深度測(cè)序技術(shù)，主要特點(diǎn)是測(cè)序的通量高，測(cè)序時(shí)間和成本顯著下降。有了這幾個(gè)測(cè)序平臺(tái)，對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究是非常有利的，從而更快的推動(dòng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)在生物學(xué)及基因組學(xué)的前進(jìn)步伐。

1.1 第二代測(cè)序技術(shù) 高通量測(cè)序技術(shù)也被稱作為第二代測(cè)序技術(shù)，該測(cè)序技術(shù)的成功問(wèn)世相對(duì)于傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)來(lái)講是一次歷史性轉(zhuǎn)變，因?yàn)榈诙鷾y(cè)序技術(shù)最為主要的功能是可以在一次測(cè)序過(guò)程中完成對(duì)幾十萬(wàn)甚至幾百萬(wàn)個(gè)DNA分子的測(cè)定。第二代測(cè)序技術(shù)的平臺(tái)分別是羅氏公司、Illumina公司和AB公司所搭建的，這3種測(cè)序技術(shù)各有千秋，如何選擇測(cè)序平臺(tái)還應(yīng)該依據(jù)科研機(jī)構(gòu)和科研工作者的需要來(lái)取舍。

1.1.1 羅氏公司454測(cè)序技術(shù)：焦磷酸測(cè)序 羅氏公司的焦磷酸測(cè)序技術(shù)過(guò)程相對(duì)比較繁瑣，而且比較浪費(fèi)時(shí)間（Hall，2007）。這是因?yàn)樵谑褂迷摐y(cè)序技術(shù)測(cè)序的時(shí)候，需要借助將測(cè)序的DNA片段克隆到細(xì)菌宿主細(xì)胞，還需要進(jìn)行體內(nèi)擴(kuò)增的過(guò)程才能完成測(cè)序，這也是該測(cè)序方法的不足之處。作為目前使用比較廣泛的測(cè)序技術(shù)之一（Margulies等，2005），焦磷酸測(cè)序技術(shù)是率先投放至市場(chǎng)的新一代測(cè)序技術(shù)，其最為主要的功能特點(diǎn)是利用類似于PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，這種擴(kuò)增的效率非常高，被稱之為乳滴PCR（Tawfik等，1998）。乳滴PCR是把含有接頭的數(shù)以千計(jì)的DNA片段，使這些DNA片段分別結(jié)合到同一個(gè)磁珠上，單個(gè)油水混合小滴包裹磁珠之后，單獨(dú)的擴(kuò)增環(huán)境就發(fā)生在這個(gè)小滴里面，在這種較封閉的環(huán)境之下進(jìn)行測(cè)序的有利之處在于排除受到其他因素以及污染性序列的影響。每一個(gè)等待進(jìn)行測(cè)序的DNA片段能夠跟磁珠表面的寡聚核苷酸順利的雜交上，孵育的油水小滴混合物之中具有PCR反應(yīng)體系，這是因?yàn)榇胖榈谋砻娌紳M了數(shù)以百萬(wàn)和文庫(kù)構(gòu)建時(shí)所加入的接頭互補(bǔ)的寡核苷酸序列。為了確保待測(cè)樣品在磁珠上經(jīng)過(guò)孵育PCR，達(dá)到測(cè)序反應(yīng)必不可少的檢測(cè)信號(hào)值，每一個(gè)磁珠表面上將會(huì)得到大于100萬(wàn)倍的原始DNA片段的拷貝數(shù)。此過(guò)程之后還要經(jīng)過(guò)將孵育的磁珠放到454PTP板的表面，放在里面的稱之為測(cè)序過(guò)程的類似磁珠的東西，它能夠被激活并通過(guò)檢測(cè)信號(hào)便可以確定待測(cè)的DNA序列。焦磷酸測(cè)序?qū)嵸|(zhì)上是一種經(jīng)過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中所釋放的焦磷酸的量，即同時(shí)產(chǎn)生了一種溫度較高的圖譜來(lái)得以實(shí)現(xiàn)的。測(cè)序效率的大幅度提高（Margulies等，2005），是因?yàn)樵?54PTP板上能夠同一時(shí)間完成數(shù)以萬(wàn)計(jì)焦磷酸反應(yīng)。而且羅氏454 GSFLX測(cè)序儀可以在4h的測(cè)序運(yùn)行中針對(duì)80～120Mb的序列進(jìn)行測(cè)序，最為主要的是一次測(cè)序讀長(zhǎng)能夠增加至200～300bp。羅氏公司的焦磷酸測(cè)序技術(shù)平臺(tái)的最大亮點(diǎn)是讀取序列較長(zhǎng)，但是由于一些因素導(dǎo)致測(cè)序的準(zhǔn)確率很低，而且測(cè)序的成本也相對(duì)較高。即便這樣，例如需要從頭拼接或者宏基因組學(xué)的應(yīng)用來(lái)講，羅氏公司的焦磷酸測(cè)序技術(shù)還可以稱之為最好的選擇。

1.1.2 Illumina公司的Solexa測(cè)序技術(shù) Illumina公司的Solexa測(cè)序技術(shù)的基本原理是邊合成邊測(cè)序的形式（Sequencing By Synthesis，簡(jiǎn)稱SBS）[14]。Solexa測(cè)序技術(shù)的主要測(cè)序過(guò)程所使用的DNA模板是單鏈的，在形成互補(bǔ)鏈過(guò)程中，不同的堿基的確定是通過(guò)攜帶熒光標(biāo)記的dNTP發(fā)出不同顏色的熒光來(lái)完成的。同時(shí)能夠確定單次反應(yīng)只能加入一個(gè)堿基，也可以在這個(gè)堿基成功讀取完畢之后，會(huì)把保護(hù)基團(tuán)去掉，這樣一來(lái)能夠使下一個(gè)反應(yīng)可正常繼續(xù)進(jìn)行的必要條件是新加入dNTP的末端能夠?qū)⒖赡娴谋Ｗo(hù)基團(tuán)封閉起來(lái)。Solexa測(cè)序技術(shù)在準(zhǔn)備進(jìn)行測(cè)序時(shí)要對(duì)等待測(cè)序的測(cè)片段進(jìn)行橋式擴(kuò)增（Bridge Amplification），這樣做的主要目的是加強(qiáng)熒光的強(qiáng)度，使其更容易被成像系統(tǒng)所采集。該測(cè)序技術(shù)的主要特點(diǎn)是進(jìn)行一次循環(huán)，大約需要4d的時(shí)間，可以測(cè)序40～50Mb的堿基序列，平均的序列讀取長(zhǎng)度是32-40bp。該測(cè)序技術(shù)在與焦磷酸測(cè)序技術(shù)相對(duì)比的情況下不難發(fā)現(xiàn)，Solexa測(cè)序技術(shù)在對(duì)同聚物的測(cè)序方面比焦磷酸測(cè)序技術(shù)更有優(yōu)勢(shì)。該測(cè)序技術(shù)的不足之處在于進(jìn)行測(cè)序的過(guò)程當(dāng)中要使待測(cè)的片段被切成很短的片段之后才能進(jìn)行測(cè)序，這樣一來(lái)就比較麻煩，在測(cè)序結(jié)束之后要借助生物信息學(xué)手段重新進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。該測(cè)序技術(shù)平臺(tái)是目前應(yīng)用最廣泛的新一代測(cè)序平臺(tái)，其顯著的優(yōu)點(diǎn)在于測(cè)序的通量很高，測(cè)序的準(zhǔn)確性也非常高，同時(shí)還具有高靈敏度和低成本等諸多優(yōu)勢(shì)。

1.1.3 AB公司的SOLiD測(cè)序技術(shù) AB公司的SOLiD（supported oligo ligation detection）測(cè)序技術(shù)手段是通過(guò)系統(tǒng)在文庫(kù)的構(gòu)建和PCR 擴(kuò)增的情況下與GSFLX系統(tǒng)是十分相似的，DNA片段是通過(guò)微珠接頭進(jìn)行抓取的，同時(shí)進(jìn)行乳液PCR的過(guò)程。該測(cè)序技術(shù)相對(duì)焦磷酸測(cè)序技術(shù)和Solexa測(cè)序技術(shù)的主要特點(diǎn)在于傳統(tǒng)的聚合酶延伸反應(yīng)被連接反應(yīng)取而代之，連接反應(yīng)的底物通常是以混合物狀態(tài)存在的堿基單鏈熒光探針。每種顏色的熒光對(duì)應(yīng)4種堿基組成主要原因是該探針的5端標(biāo)記有熒光而3端1～2位的堿基對(duì)和5端熒光信號(hào)的顏色是相對(duì)應(yīng)的關(guān)系，因?yàn)?個(gè)堿基一共有16種組合情況，恰恰只有4種顏色的熒光，而堿基序列主要是經(jīng)過(guò)下面的測(cè)序循環(huán)過(guò)程來(lái)確定的，SOLiD的測(cè)序反應(yīng)一共要經(jīng)過(guò)5輪，很多個(gè)連接反應(yīng)一塊構(gòu)成了每一輪測(cè)序反應(yīng)。下面便是連接反應(yīng)的首次反應(yīng)，此次連接反應(yīng)被包括在第一輪反應(yīng)當(dāng)中，這次連接反應(yīng)需要加入探針1條，該條探針3端1～2位編碼區(qū)顏色信息是通過(guò)測(cè)序儀記錄下所反映出來(lái)的，緊接著應(yīng)該去除6～8位堿基和5末端的熒光基團(tuán)，這一過(guò)程其實(shí)一共連接了5個(gè)堿基，與此同時(shí)取得1～2位的顏色信息。與上面的過(guò)程一樣，連接反應(yīng)的第二次反應(yīng)一共得到模板上第6～7位堿基序列的顏色信息，連接反應(yīng)的第3次反應(yīng)得到第11～12位的顏色信息，以此類推，多個(gè)循環(huán)過(guò)后要做的是重置引物，引物重置完以后緊接著進(jìn)行第2輪的測(cè)序。第2輪測(cè)序的引物與第1輪測(cè)序的引物有所不同，不同之處在于該輪測(cè)序所需要的引物比前一輪前移一位，因此在這1輪測(cè)序所得到的與前一輪也有所不同，這一輪得到的0～1位，5～6位和10～11位等顏色信息，直到第5輪測(cè)序反應(yīng)完成之后，方能獲得到所有位置顏色的信息，根據(jù)這些位置顏色信息的綜合分析得到對(duì)應(yīng)堿基序列。AB公司的SOLiD測(cè)序平臺(tái)最主要的特點(diǎn)是擁有特別高的讀取序列的精準(zhǔn)性與巨大的數(shù)據(jù)輸出量。在測(cè)序價(jià)格方面，如果在相同數(shù)據(jù)量的條件下進(jìn)行測(cè)序，那么該測(cè)序技術(shù)所需要的測(cè)序費(fèi)用要略低于Solexa測(cè)序技術(shù)。與Solexa相同之處在于，因?yàn)樾蛄凶x取長(zhǎng)度很短，測(cè)序完成后的數(shù)據(jù)信息同樣要借助生物信息學(xué)知識(shí)加以分析。

1.2 第三代測(cè)序技術(shù) 隨著測(cè)序技術(shù)的逐漸發(fā)展和第二代測(cè)序技術(shù)的影響下，為了能夠得到測(cè)序通量更高，測(cè)序的成本更加低廉和基因序列讀取長(zhǎng)度更長(zhǎng)的測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)，第三代測(cè)序技術(shù)即基因單分子測(cè)序正迅猛發(fā)展起來(lái)。第三代測(cè)序技術(shù)的主要代表的是Pacific Biosciences公司的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司納米孔單分子測(cè)序技術(shù)。單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)的主要技術(shù)特點(diǎn)是使用熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)序，納米孔單分子測(cè)序技術(shù)則是利用不同堿基所能夠產(chǎn)生的電信號(hào)進(jìn)行測(cè)序[15-17]?；騿捂湹耐ㄟ^(guò)空間被納米孔所限制，每次只能通過(guò)一個(gè)核苷酸分子，此過(guò)程能被逐一識(shí)別是在DNA序列通過(guò)納米孔時(shí)。第三代測(cè)序技術(shù)相對(duì)于第二代測(cè)序技術(shù)，主要優(yōu)勢(shì)在于操作起來(lái)很方便，讀取速度非?？?，而且測(cè)序的成本低廉。

2 大豆轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展

大豆是目前全世界種植面積相對(duì)比較大的作物之一，大豆作為重要的食品、飼料和工業(yè)原料，在人類的生產(chǎn)和生活中發(fā)揮著重要的作用。因此，研究大豆在特定條件下的基因表達(dá)模式，對(duì)于開發(fā)和利用大豆種質(zhì)資源十分必要。

2.1 大豆結(jié)瘤發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組分析 大豆結(jié)瘤具有與某些微生物進(jìn)行固氮共生相互作用的獨(dú)特能力，大豆的根組織是分化根瘤的特定器官，為根瘤提供碳源和適當(dāng)?shù)募?xì)胞環(huán)境，可以確保根瘤能夠固定大氣中的氮源，大豆的根與根瘤的共生關(guān)系是大豆植株生長(zhǎng)的關(guān)鍵。Colebatch、Moreau等[8]研究表明，參與大豆結(jié)瘤的形成和固氮過(guò)程的基因，除了已知的大豆結(jié)瘤素基因外，還有許多新發(fā)現(xiàn)的基因參與大豆根的結(jié)瘤。此外，一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因和轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是調(diào)節(jié)基因控制感染、結(jié)節(jié)與器官功能。Benedito等[9]確定了3 400多個(gè)差異表達(dá)基因都與大豆根瘤發(fā)育的過(guò)程有關(guān)聯(lián)，對(duì)這些基因功能的分析決定了在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中4個(gè)不同階段結(jié)節(jié)的分化、根細(xì)胞獨(dú)立分化、根瘤分化和固氮。這項(xiàng)研究包括細(xì)胞分裂素的合成和茉莉酸途徑結(jié)節(jié)發(fā)育。有趣的是，許多豆科植物特異性基因被發(fā)現(xiàn)要優(yōu)先表達(dá)在根瘤上，這充分證明這些基因被賦予到進(jìn)化過(guò)程中所執(zhí)行的是特殊功能。總的來(lái)說(shuō)，這些研究提供了參與大豆結(jié)瘤發(fā)育和相關(guān)聯(lián)的候選基因。然而，還有許多基因有待發(fā)現(xiàn)，目前我們?nèi)匀粵]有完全獲知大豆結(jié)瘤過(guò)程的完整的分子機(jī)制。

2.2 大豆種子發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組分析 大豆種子發(fā)育是一個(gè)相對(duì)比較復(fù)雜的過(guò)程，大豆種子在發(fā)育過(guò)程中需要協(xié)調(diào)表達(dá)和幾種基因協(xié)調(diào)調(diào)控。作為重要的農(nóng)藝性狀，大豆種子發(fā)育一直是研究豆科植物的重點(diǎn)。Severin等[10]表明，近期許多進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組研究重點(diǎn)都集中在對(duì)大豆種子發(fā)育過(guò)程的分析與研究上。Gallardo等[11]的研究揭示了大豆種子的組織可能與大豆種子填充過(guò)程中調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成色氨酸的合成酶的過(guò)程相獨(dú)立，這個(gè)重要農(nóng)藝性狀被發(fā)現(xiàn)，可以利用制定方法用于改變大豆種子的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。另外，轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)分布的對(duì)比分析表明基因的一個(gè)顯著特點(diǎn)，大豆種子在發(fā)育過(guò)程中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。Severin等[10]對(duì)大豆種子發(fā)育的7個(gè)階段進(jìn)行分析并確定了2 000個(gè)基因在種子中優(yōu)先表達(dá)，其中很多基因參與大豆種子填充過(guò)程，有的基因與纖維素合酶的活性有關(guān)，營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存活性和脲酶活性的基因被發(fā)現(xiàn)與大豆種子發(fā)育有關(guān)。Verdier等[12]制定一個(gè)詳細(xì)的時(shí)間序列（授粉后10～20d，DAP），已經(jīng)作為基因表達(dá)圖譜的一部分，是對(duì)轉(zhuǎn)錄的大豆種子成熟的研究，總基因的30%，其中包括190個(gè)豆科特異性基因，624轉(zhuǎn)錄因子和293轉(zhuǎn)運(yùn)基因被鑒定為種子發(fā)育期間差異表達(dá)，其中種子貯藏蛋白基因、豌豆球蛋白基因、大豆球蛋白基因在種子中是高度表達(dá)的基因。這項(xiàng)研究確定了幾個(gè)基因簇具有鮮明的表達(dá)模式與在種子發(fā)育的不同階段的生理過(guò)程是密切相關(guān)的。例如，參與配體-受體相互作用和細(xì)胞周期的基因在（10 DAP）在胚胎發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)了偏高；同樣地，涉及在淀粉和蔗糖代謝的基因在大豆種子灌漿期（16 DAP）的比例過(guò)高，并參與蛋白質(zhì)折疊和降解基因富集在種子干燥和成熟階段（20DAP）?？傮w而言，從轉(zhuǎn)錄組研究的角度來(lái)講，這些發(fā)現(xiàn)是令人興奮的，而且在這一重要農(nóng)藝性狀的工作中確定了種子發(fā)育過(guò)程中候選基因的作用。

2.3 大豆花發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組分析 在高等植物中，從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到開花期的轉(zhuǎn)變表明了植物的生殖發(fā)育。Jack等[13]指出，大豆花發(fā)育的分子基礎(chǔ)已被廣泛應(yīng)用到研究擬南芥和水稻等模型植物上。Keurentjes等[14]在以分子遺傳學(xué)分析全基因組轉(zhuǎn)錄組的研究中確定了大豆花發(fā)育的幾個(gè)關(guān)鍵階段，并提出了大豆花的發(fā)展模式。而且基因調(diào)控開花時(shí)間已經(jīng)成功建立，并成功通過(guò)了在擬南芥基因組范圍內(nèi)的基因表達(dá)分析，這表明大多數(shù)參與大豆花發(fā)育的已知基因是保守的。Dong等[15]在分子水平上研究表明，某些與大豆花有關(guān)的基因，如UNIFOLIATA和STAMINA PISTILLOIDA，已經(jīng)在豆科植物中獲得了附加功能。因此，當(dāng)務(wù)之急是將研究豆科類作為重要的發(fā)展項(xiàng)目以及尋找重點(diǎn)監(jiān)管，建立形態(tài)學(xué)的分子基礎(chǔ)。Singh等[16]研究了潛在的大豆花轉(zhuǎn)變，并通過(guò)微陣列分析拍攝頂端分生組織的分子過(guò)程。本次研究總共331個(gè)轉(zhuǎn)錄物與顯著差異表達(dá)鑒定花香和牽連糖，生長(zhǎng)素和脫落酸在這一過(guò)程中非生物脅迫和大豆花信號(hào)通路重疊的證據(jù)也被突出顯示。在最近的RNA序列轉(zhuǎn)錄組基于3種營(yíng)養(yǎng)組織和大豆花發(fā)展的8個(gè)階段進(jìn)行了分析，轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)的鷹嘴豆全球視野已經(jīng)呈現(xiàn)。Kater等[17]研究確定了在大豆花發(fā)育的不同階段優(yōu)先表達(dá)的基因，許多這些基因的發(fā)現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行編碼，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)大量的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子在大豆花發(fā)育階段上調(diào)，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子是已知的大豆花器官發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。

3 問(wèn)題與展望

3.1 問(wèn)題 雖然新一代高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅猛，越來(lái)越多的應(yīng)用于動(dòng)植物及微生物中，但是此項(xiàng)技術(shù)同時(shí)也存在以下幾個(gè)問(wèn)題：（1）序列長(zhǎng)度一直都是制約新一代測(cè)序技術(shù)廣泛應(yīng)用的主要因素。根據(jù)現(xiàn)行的測(cè)序原理，通量的增加注定以犧牲序列片段為代價(jià)，而序列長(zhǎng)度對(duì)于基因組或轉(zhuǎn)錄組的后續(xù)拼接非常重要。在測(cè)序質(zhì)量方面，錯(cuò)誤率偏高也是困擾科研工作者的主要問(wèn)題，因此很多人還是選擇了準(zhǔn)確性更高的傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序。如何改善測(cè)序長(zhǎng)度，并最大限度的降低測(cè)序錯(cuò)誤率是目前各大技術(shù)都應(yīng)著手解決的問(wèn)題。（2）第二代測(cè)序技術(shù)采用體外擴(kuò)增的辦法，樣品必須經(jīng)過(guò)打斷、加接頭、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增等多重步驟，步驟的增加勢(shì)必引入各種誤差，同時(shí)測(cè)序費(fèi)用也相應(yīng)提高，在實(shí)際操作中還有很多問(wèn)題也尚待解決。如在RNA-seq研究中，先打斷后反轉(zhuǎn)可以得到更全面的轉(zhuǎn)錄本信息，但是這種方法的前提是RNA的純度和濃度都必須很高，這必然增加了取材的難度。（3）新一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)取得令人矚目的成就，但是面對(duì)海量的測(cè)序數(shù)據(jù)后期處理仍然存在2個(gè)主要問(wèn)題：第一，如何充分挖掘隱藏在原始數(shù)據(jù)中的生物學(xué)意義，解釋各種生物學(xué)現(xiàn)象；第二，如何高效地對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類、存檔等，成為了研究人員必須面臨的一個(gè)難題。在實(shí)際的操作中，一些序列的拼接聚冗等處理還是有一定的問(wèn)題。

3.2 展望 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的日漸成熟，測(cè)序成本的進(jìn)一步降低和對(duì)海量數(shù)據(jù)處理能力的不斷提高，高通量將成為一項(xiàng)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)手段，一些生物學(xué)問(wèn)題將會(huì)得到有效地解決，為生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)革命性的變革。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展極大推動(dòng)了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，使研究者能發(fā)現(xiàn)更多新轉(zhuǎn)錄本，挖掘更多分子標(biāo)記，更清晰的繪制轉(zhuǎn)錄圖譜以及更準(zhǔn)確的確定代謝途徑通道。隨著第三代測(cè)序技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，將來(lái)測(cè)序成本會(huì)大大降低，測(cè)序的通量和準(zhǔn)確性也會(huì)不斷提高，從而進(jìn)一步推動(dòng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在農(nóng)業(yè)科學(xué)等基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。隨著組學(xué)時(shí)代的到來(lái)，以高通量測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，綜合各種組學(xué)研究成為必然的發(fā)展趨勢(shì)，后基因組時(shí)代的大豆轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究將會(huì)更加深入。

參考文獻(xiàn)

[1]Margulies M，Egholm M，Altman WE.Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors[J].Nature，2005，437（7057）：376-380.

[2]Tawfik D.S.，Griffiths A. D.. Man-made cell-like compartments for molecular evolution [J].Nat.Biotechnol，1998，16：652-656.

[3]Bennett S..Solexa Ltd[J].Pharmacogenomics，2004，5：433-438.

[4]Rajeev K.Varshney，Spurthi N.Nayak，Gregory D.May，et al.sequencing technologies and their implications for crop genetics and breeding[J].Trends Biotechnol，2009，27（9）：522-530.

[5]Service RF.Gene sequencing：The race for the $1000 genome[J].Science，2006，311（5767）：1544-1546.

[6]HarrisTD，Buzby PR，Babcock H，et al.Single-moleculeDNA sequencing of a viral genome[J].Science，2008，320（5872）：106-109.

[7]林海建，張志明，沈亞歐，等.基因芯片研究植物逆境基因表達(dá)新進(jìn)展[J].遺傳，2009，12（5）：34-45.

[8]Colebatch，G.，S. Kloska，B. Trevaskis，et al.Novel aspects of symbiotic nitrogen fixation uncovered by transcript profiling with cDNA arrays[J]. Mol. Plant Microbe Interact.，2002，15：411-420.

[9]Benedito，V.A.，I. Torres-Jerez，J.D. Murray，et al.A gene expression atlas of the model legume Medicago truncatula[J]. Plant J.，2008，55：504-513.

[10]Severin，A.J.，J.L. Woody，Y.T. Bolon，et al.RNA-Seq Atlas of Glycine max：a guide to the soybean transcriptome[J].BMC Plant Biol.，2010，10：160.

[11]Gallardo，K.，C. Firnhaber，H. Zuber，et al.A combined proteome and transcriptome analysis of developing Medicago The Plant Genome：Posted 12 June 2013； doi：10.3835/plantgenome2013.04.0011 truncatula seeds：evidence for metabolic specialization of maternal and filial tissues[J]. Mol. Cell Proteomics，2007，6：2165-2179.

[12]Verdier，J.，F(xiàn). Dessaint，C. Schneider，et al.A combined histology and transcriptome analysis unravels novel questions on Medicago truncatula seed coat[J]. J. Exp. Bot，2013，64：459-470.

[13]Jack，T. Molecular and genetic mechanisms of floral control[J].Plant Cell，2004，16Suppl：S1-S17.

[14]Keurentjes，J.J.，J. Fu et al.Regulatory network construction in Arabidopsis by using genome-wide gene expression quantitative trait loci[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2007，104：1708-1713.

[15]Dong，Z.C.，Z. Zhao，C.W. Liu，et al. Floral patterning in Lotus japonicas[J].Plant Physiol.，2005，137：1272-1282.

[16]Singh，V.K.，R. Garg，M. Jain.A global view of transcriptome dynamics during flower development in chickpea by deep sequencing. Plant Biotechnol.J.doi：10.1111/pbi.12059. Stacey，G.，M. Libault，L. Brechenmacher，J. Wan，and G.D. May. 2006. Genetics and functional genomics of legume nodulation. Curr. Opin[J]. Plant Biol，2013，9：110-121.

[17]Kater，M.M.，L. Dreni，L. Colombo. Functional conservation of MADS-box factors controlling floral organ identity in rice and Arabidopsis[J]. J. Exp. Bot，2006，57：3433-3444.

（責(zé)編：張宏民）