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    山羊分子生物學研究進展駱美蓉

    2014-07-18 21:05:24江明鋒張鵬王永
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2014年1期
    關鍵詞:轉(zhuǎn)錄組分子標記山羊

    江明鋒 張鵬 王永

    摘要:綜述了近年來國內(nèi)外關于山羊分子生物學方面的研究進展,介紹了山羊起源分化和遺傳多樣性的分子標記研究、山羊相關經(jīng)濟性狀的主要功能基因以及山羊在基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組方面的研究進展,討論了山羊研究存在的問題和發(fā)展趨勢。

    關鍵詞:山羊;分子標記;功能基因;基因組;轉(zhuǎn)錄組;蛋白質(zhì)組

    中圖分類號: S827.2文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2014)01-0046-04

    收稿日期:2013-04-22

    資助項目:國家科技支撐計劃(編號:2012BAD13B06);教育部科學技術研究重點項目(編號:210265);四川省科技創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)鏈示范工程重大項目(編號:2011NZ0003);西南民族大學研究生創(chuàng)新型科研項目(編號:CX2011SP44)。

    作者簡介:駱美蓉(1987—),女,河南信陽人,碩士研究生,主要從事羊遺傳育種方面的研究。E-mail:xygzlmr@126.com。

    通信作者:王永,博士,教授,博士生導師,研究方向為動物遺傳育種。E-mail:wangyong010101@swun.cn。山羊是世界上最早馴養(yǎng)的家畜之一,其品種多樣,適應性強,分布廣泛,經(jīng)濟效益大。據(jù)聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計,目前世界上共有1 000多個山羊品種,近8.3億只山羊。近年來,發(fā)展中國家養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展迅速。我國已成為世界上山羊飼養(yǎng)量、出欄量、羊肉產(chǎn)量最多的國家。同時山羊產(chǎn)業(yè)成為我國大部分地區(qū)畜牧業(yè)的重要支柱。但是國內(nèi)外關于山羊的研究尤其是功能基因的研究大多是通過牛和綿羊相關研究成果來進行的。山羊在分子生物學上的研究遠落后于豬、牛、綿羊等家畜。隨著山羊全基因組測序的完成和全基因組圖譜的公布,山羊的科學研究隨之進入到一個全新時代。

    1山羊分子標記及遺傳多樣性分析

    分子標記是以DNA多態(tài)性為基礎的遺傳標記,是DNA水平上遺傳變異的直接反映,目前已發(fā)展到第3代分子標記。在山羊產(chǎn)業(yè)中應用廣泛的分子標記技術包括限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)標記、簡單重復序列(simple sequence repeat,SSR)等。

    山羊分子標記研究主要應用于山羊的起源分化和遺傳多樣性分析。雖然科研人員早在1962年就開始研究家山羊的起源和遺傳多樣性,但至今家山羊的起源和遺傳多樣性仍具有不確定性[1]。近10年來,家山羊起源分化和遺傳多樣性的研究主要是通過線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)進行的。mtDNA基因組序列一般無間隔、結(jié)構簡單、突變率高、嚴格的母系遺傳,而這是其成為首要研究對象的主要原因??蒲腥藛T通過對mtDNA的研究發(fā)現(xiàn)山羊有7個支系起源(A至G),其中B支系只存在于亞洲東南部。因此Lin等對東南亞12個國家共計1 661只山羊mtDNA進行RFLP分析,以期進一步探究亞洲山羊的起源[1]。結(jié)果表明,亞洲家山羊可分為4個支系:A和B支系山羊占主導地位,C和D支系山羊頻率低且只存在于中國、巴基斯坦和印度。近期,A支系山羊向東南亞地區(qū)滲透,但B支系山羊在東南亞仍具有優(yōu)勢,且有向東南方向增加的趨勢。王杰等也根據(jù)前人的研究對我國7個山羊品種的mtDNA D-loop區(qū)進行了RFLP標記,發(fā)現(xiàn)我國山羊有4個支系起源(A至D)且具有很高的遺傳多樣性[2]。王志剛等對我國39個地方山羊品種進行SSR標記,其關于我國山羊遺傳多樣性的分析與王杰一致[3]??偟膩碚f,我國山羊具有較高水平的遺傳多樣性,其中北方地區(qū)山羊遺傳多樣性最為豐富。遺傳變異主要存在于品種內(nèi),品種間遺傳分化處于中等水平,選育潛力大。在遺傳資源保護方面,應防止盲目雜交并選取具有代表性的山羊品種進行保護。

    2山羊主要功能基因研究

    山羊在分子生物學方面研究最多的是山羊疾病及其抗病基因,其次是山羊經(jīng)濟性狀相關基因的研究。據(jù)此,將山羊功能基因劃分為毛、肉、乳、繁殖、免疫5個性狀進行闡述。表1列舉了山羊這5個性狀的主要相關基因。表1山羊候選基因及其與性狀間的關系

    候選基因1性狀1候選基因與性狀的相關性1 文獻生長激素基因1體重1AACD基因型抑制體重增加1[4]肌肉生長抑制素1肉產(chǎn)量1AB基因型和ABCD基因型促進體重增加1[5]促性腺激素釋放激素1繁殖性狀1CC和CT基因型能增加產(chǎn)羔數(shù)1[7]酪蛋白相關基因1產(chǎn)乳量及風味1豐富的SNP可增加產(chǎn)乳量,乳糖、脂肪、蛋白的含量1[8]POU1F11產(chǎn)乳量、質(zhì)量及絨產(chǎn)量1豐富的SNP可提高產(chǎn)乳量,提高乳質(zhì)量;其TT基因型增加絨產(chǎn)量1[9,11]泌乳素基因1絨長度1其X76049:g.576位點為C時增加絨長1[10]褪黑激素受體基因1絨產(chǎn)量1其基因型為AA時增加絨產(chǎn)量1[12]主要組織相容性復合體1免疫性狀1對動物抗病、抗逆性和免疫調(diào)節(jié)有重要作用1[13]

    2.1影響山羊產(chǎn)肉性狀的功能基因

    波爾山羊作為優(yōu)秀的肉用山羊品種被引進我國,以期提高我國本地山羊的產(chǎn)肉性能。為找到增加山羊產(chǎn)肉量的主效基因以更好地進行山羊繁殖育種工作,Hua等對波爾山羊的生長激素基因進行了研究[4],Zhang等對其肌肉生長抑制素基因進行了變異分析[5],結(jié)果發(fā)現(xiàn),生長激素基因的AACD基因型對體重的增加有抑制作用而其他基因型對體重、體長的影響不明顯;肌肉生長抑制素基因的AB基因型和合并基因型ABCD能夠顯著促進山羊體重的增加。

    2.2影響山羊繁殖性狀的功能基因

    對山羊繁殖性狀功能基因的研究主要集中在綿羊多胎的分子標記基因上,如骨形態(tài)發(fā)生蛋白及其受體基因和生長分化因子9等。而Ahlawat等研究發(fā)現(xiàn)印度本地山羊中并未發(fā)現(xiàn)這些基因存在與多胎性狀相關的突變,這與我國科研人員在研究本地山羊多胎相關基因時情況相似[6]。據(jù)此可看出依靠綿羊繁殖性狀的基因?qū)ι窖蚍敝诚嚓P功能基因的研究具有一定的局限性。嚴泉梅等對促性腺激素釋放激素(GnRH)基因遺傳變異的研究突破這一局限,發(fā)現(xiàn)在人類中與性早熟相關的GnRH的CC基因型和CT基因型能使西農(nóng)薩能奶山羊和布爾山羊的產(chǎn)羔數(shù)顯著增加[7]。

    2.3影響泌乳性狀的功能基因

    近期科研人員在尋找人類代乳品時發(fā)現(xiàn)山羊奶最為適合。這一結(jié)論促使羊奶相關特性和功能基因得到進一步的研究。Dagnachew等進行了酪蛋白相關基因單核苷酸多態(tài)性與山羊泌乳量相關性的研究,結(jié)果顯示CSN1S1和CSN3的單核苷酸多態(tài)性對山羊乳產(chǎn)量、風味及質(zhì)量有顯著的加性效益且起主導作用[8]。Daga等通過POU1F1基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn),其第2外顯子17位點的變異可使乳產(chǎn)量增加;58位點的變異通過增加乳中蛋白質(zhì)和脂肪的含量來提高羊奶質(zhì)量[9]??偟膩碚f,改善山羊奶風味是目前奶山羊育種面臨的最迫切也是最重要的問題,而這也是將來開展相關研究的方向。

    2.4影響產(chǎn)絨或產(chǎn)毛性狀的功能基因

    除去研究人員普遍認同的角蛋白基因和角蛋白輔助蛋白基因外,Lan等將對乳產(chǎn)量有顯著影響的泌乳素(PRL)基因和對PRL有正調(diào)節(jié)作用的POU1F1基因多態(tài)性與山羊絨性狀進行相關性分析[10-11],結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRL基因有一特殊變異與絨長度相關,且其等位基因為C時山羊絨更長;POU1F1的TT基因型與山羊絨產(chǎn)量正相關。Lan等發(fā)現(xiàn)能提高乳產(chǎn)量的功能基因也與絨產(chǎn)量相關,從而為白絨山羊產(chǎn)絨量的提高提供了輔助選擇的分子標記。繁殖性狀相關功能基因與絨產(chǎn)量關系的探討也是十分重要的。劉斌等選擇褪黑激素受體(melatonin receptor,MTNR)基因來進行研究,結(jié)果在MTR1b基因外顯子2中檢測到AA、AB、BB 3種基因型[12]。通過與山羊絨相關性分析發(fā)現(xiàn):AA基因型對絨產(chǎn)量有顯著影響;與年齡的互作效應對山羊絨厚度有顯著影響,對絨細度存在邊際顯著影響。

    2.5山羊免疫相關功能基因

    主要組織相容性復合體(MHC)在動物免疫應答反應中起著重要作用。更為重要的是MHC可識別并清除外在抗原且有多個高度多態(tài)的基因位點都與免疫相關。以前關于山羊MHC的研究多集中在Class II區(qū)DR和DQ亞區(qū)基因的多態(tài)性上,而最近公布的山羊全基因組圖譜對山羊MHC進行了整體研究。研究發(fā)現(xiàn),山羊MHC位于23號染色體,由2個大小分別為2.25 Mb和360 kb的區(qū)域組成。與綿羊MHC相比,山羊MHC含有160個基因,比綿羊MHC少了16個。Dong等通過基因注釋對綿羊、山羊和人MHC上的保守基因進行分析,發(fā)現(xiàn)有些保守基因有倒置情況,但總體來說它們的保守基因表現(xiàn)出高度共線性[13]。它們比較分析的具體情況見圖1。

    3山羊基因組學研究進展

    3.1山羊遺傳連鎖圖譜構建

    遺傳圖譜能夠顯示遺傳標記在連鎖群上的相對位置,也能幫助非模式生物運用比較基因組學進行相關研究。遺傳圖譜的構建是發(fā)現(xiàn)近緣物種間適應表型差異遺傳機制的第一步。因此,Vaiman等早在1996年時就用12個半同胞家系山羊(薩能奶山羊和阿爾卑斯山羊參與雜交)構建得到山羊低分辨率連鎖圖譜[14]。該連鎖圖譜全長為2 300 cM,由219個微衛(wèi)星標記組成,標記物種來源于牛(占總標記數(shù)的74.9%)、綿羊(占總標記數(shù)的20.5%)和山羊(占總標記數(shù)的 4.6%)。其中204個微衛(wèi)星標記整合進了連鎖群,其余的用熒光原位雜交(FISH)法得以物理定位。該山羊連鎖圖譜雖然分辨率低,卻是目前構建最完整的山羊遺傳連鎖圖譜,占山羊基因組的80%。此外,徐磊等、王敏等對絨山羊的11號

    染色體和X染色體用SSR技術構建了連鎖圖譜,其中徐磊等構建的X染色體遺傳連鎖圖譜與英國羅斯林研究所公布的SM 47綿羊連鎖圖標記順序一致[15-16]。他們與Vaiman等所構建的遺傳圖譜的比較見圖2。

    3.2山羊基因組測序

    3.2.1山羊線粒體基因組Parma等在2003年首次完成了長度為16 640 bp的山羊線粒體基因組的全部測序工作[17]。其中包括了rRNA(12S和16S)、22個tRNA和13個蛋白編碼區(qū)的基因序列。通過比較山羊、牛和綿羊的蛋白編碼區(qū)基因,發(fā)現(xiàn)山羊與牛之間的差異為1.2%~12.2%(均值為73%);山羊與綿羊之間的差異范圍是0~15.6%(均值為47%)。只從差異均值來看,山羊與綿羊的親緣關系更近。Hassanin等[18]對山羊線粒體基因組進行了重測序,通過與Parma等公布的序列比較發(fā)現(xiàn)其測序結(jié)果存在很多錯誤:Parma等所測基因組序列僅占總長度的44.5%;1 201 nt 和 2 384 nt 片段測序錯誤率極高。此外,Hassanin還發(fā)現(xiàn)了核線粒體假基因(Numt)的存在,并通過克隆最終得到2個Numt序列。通過對髯羊(Ammotragus)、山羊(Capra)、塔爾羊(Hemitragus)和巖羊(Pseudois)假基因系統(tǒng)發(fā)育學方面的分析,推測出它們擁有共同的祖先。

    3.2.2山羊全基因組雖然我國山羊分布范圍及經(jīng)濟效益明顯大于綿羊,但與綿羊相比山羊基因組的研究嚴重滯后。近期中國科學院昆明動物研究所聯(lián)合國內(nèi)外大學展開了山羊基因組的研究,并于2012年12月公布了全球首個山羊全基因組圖譜,同時建立了山羊基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。研究中,Dong等采用第2代測序技術(NGS)對1只雌性云南黑山羊2.66 Gb的基因組進行了測序[13]。測序所得短序列通過基因組酶切圖譜(whole-genome mapping)技術和傳統(tǒng)的組裝方法進行拼接得到超長scaffold,然后利用與牛的保守共線性(conserved synteny)將scaffold定位到染色體上。將所測基因組從蛋白編碼基因、非蛋白編碼基因、轉(zhuǎn)座子和基因家族4個方面進行基因注釋,共得到22 175個蛋白編碼基因,其中 17 927 個基因也在轉(zhuǎn)錄組測序中檢測到。對注釋基因的分析主要從基因家族進化和正選擇基因2個方面進行。

    從基因家族進化方面分析注釋基因發(fā)現(xiàn)山羊與牛有 17 129 對直系同源基因,與人類有16 771對直系同源基因。在所構建的系統(tǒng)樹圖中可以看出山羊和牛在2 300萬年前有共同祖先。但在將與基因組和基因進化相關的轉(zhuǎn)座子進行比較時發(fā)現(xiàn),?;蚪M中SINE-BovA型的轉(zhuǎn)座子多,而山羊基因組中則是SINE-tRNA轉(zhuǎn)座子數(shù)量大。在將山羊基因組中各種類型的轉(zhuǎn)座子分化程度進行分析時發(fā)現(xiàn)較近時期分化的轉(zhuǎn)座子很少。在正選擇基因方面主要研究了和免疫相關的主要組織相容性復合體(MHC)。MHC的詳細信息對山羊的免疫和接種具有重要價值。

    4山羊轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學研究進展

    基于山羊的重要經(jīng)濟價值,山羊轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學研究集中在山羊絨。Dong等通過對絨山羊初級毛囊和次級毛囊轉(zhuǎn)錄組的比較分析得到山羊絨的功能基因[13]。研究表明,2個角蛋白基因和10個角蛋白輔助蛋白基因在羊絨纖維結(jié)構中起著重要作用;纖維母細胞生長因子21基因、酪蛋白激酶Iε基因與山羊絨性狀相關;天冬氨酰合成酶、磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶、α-1蛋白、橋粒芯蛋白等與毛囊發(fā)育和毛囊形態(tài)發(fā)生有關。其中角蛋白輔助蛋白可分為高硫角蛋白輔助蛋白、超高硫角蛋白輔助蛋白和高甘氨酸酪氨酸蛋白三大類[13]。他們在3類角蛋白輔助蛋白的進一步研究中發(fā)現(xiàn)超高硫角蛋白輔助蛋白對羊絨的形成起著十分重要的作用。松杰等通過構建絨山羊皮膚蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜,對絨山羊皮膚的蛋白質(zhì)分布和表達情況有了全面了解,為絨山羊皮膚蛋白質(zhì)組成和差異蛋白質(zhì)的研究奠定了基礎[19]。

    5小結(jié)與展望

    雖然山羊分子生物學方面的研究在逐年增加并取得了不少的成績,但仍不能滿足山羊市場快速增加所產(chǎn)生的需求。最近山羊全基因組序列的公布和轉(zhuǎn)錄組方面的研究拓展了山羊功能基因的研究方法,為山羊生長發(fā)育、生理機理、抗病機理分子機制的研究奠定了基礎,為構建山羊基因芯片、分析預測基因功能拓展了研究空間。但不可否認的是山羊基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的研究起步較晚,還有很多相關信息需要進一步地分析鑒定。現(xiàn)如今山羊功能基因的研究被局限在了功能基因單核苷酸多態(tài)性與生產(chǎn)性能相關性的研究上,而其研究方法多是根據(jù)牛和綿羊的相關研究成果進行的。更不利的是,功能基因多態(tài)性的研究因山羊品種、所處環(huán)境等存在差異。就目前的研究而言,山羊主效功能基因仍未被發(fā)現(xiàn)。因此,還必須對大量未知的和已知的基因和蛋白進行更為詳盡的分析和鑒定,從而為山羊主要經(jīng)濟性狀的遺傳改良提供理論依據(jù)和技術支撐,為山羊的良種繁育、遺傳多樣性的保護奠定基礎。

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