小麥散黑穗病病原菌PCR檢測(cè)方法的研究

朱桂清　遲文娟　曹遠(yuǎn)銀　陳秀梅

摘要：小麥散黑穗病由小麥散黑粉菌引起，是世界各麥區(qū)發(fā)生的典型種傳病害。近些年來(lái)，因缺少簡(jiǎn)便有效的種子檢測(cè)技術(shù)，從而影響其防治的種子處理決策，使該病呈現(xiàn)出加重趨勢(shì)。本研究以真菌rDNA非編碼區(qū)ITS1、5.8S和ITS2的通用引物，分別對(duì)小麥散黑穗病菌等10種相關(guān)病菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序、Genbank搜索，通過(guò)Accelrys Gene 25軟件比對(duì)，設(shè)計(jì)以小麥散黑穗病菌為靶標(biāo)的特異引物，對(duì)上述10種病菌進(jìn)行檢測(cè)，唯有靶標(biāo)病菌呈陽(yáng)性；經(jīng)1ng～1fg 7個(gè)靶標(biāo)病菌的DNA濃度靈敏度檢測(cè)，表明對(duì)其最低檢測(cè)限為1pgDNA。本方法檢測(cè)小麥散黑穗病快速、準(zhǔn)確、靈敏，為實(shí)現(xiàn)帶病種子檢測(cè)提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：小麥散黑穗??；PCR檢測(cè)；種傳病害；特異性引物

中圖分類號(hào)：S435.121.4+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0036-03

收稿日期：2013-05-01

基金項(xiàng)目：國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號(hào)：2013016）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2012BAD19B04）。

作者簡(jiǎn)介：朱桂清（1959—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：zhugq1959@126.com。

通訊作者：曹遠(yuǎn)銀，研究員，博士，主要從事植物免疫學(xué)與分子植物病理學(xué)研究。E-mail：caoyy66@yahoo.com.cn。小麥散黑穗病由小麥散黑粉菌[Ustilago tritici （Pers.） Rostr.]引起，各國(guó)小麥產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1]。在我國(guó)以華中和華東麥區(qū)發(fā)病最重，而東北麥區(qū)則重于西北麥區(qū)。該病為典型的種傳病害，帶菌種子（胚內(nèi)菌絲體）是唯一的傳播途徑。小麥單株一經(jīng)罹病，其產(chǎn)量損失就近100%，換句話說(shuō)，小麥發(fā)病株率可約等于產(chǎn)量損失率。從對(duì)整體生產(chǎn)危害情況來(lái)看，未見(jiàn)有毀滅性的報(bào)道，嚴(yán)重地塊可達(dá)10%以上，但一般中等發(fā)病率田塊僅為1%～5%。然而，近20年來(lái)，由于疏于藥劑拌種處理，病情呈上升趨勢(shì)。例如，被認(rèn)為較輕發(fā)生的西北天水等地區(qū)也變得較普遍，重病田塊發(fā)病率竟達(dá)15%～200%[2]。在國(guó)外的發(fā)生情況也呈類似上升，如加拿大西部小麥散黑穗病造成硬粒小麥和面包麥的產(chǎn)量損失更嚴(yán)重，已高達(dá)27%[3]。

該病的最有效防治手段是種子處理等化學(xué)方法，發(fā)病后的應(yīng)急防治意義不大。因此，關(guān)于種子處理的各種化學(xué)藥劑種類研發(fā)較多，但鮮有大規(guī)模應(yīng)用于拌種的報(bào)道。其原因應(yīng)與小麥散黑穗病的防治還未引起足夠重視、種子處理費(fèi)時(shí)費(fèi)工、增加成本及污染有關(guān)，特別是因缺乏簡(jiǎn)便快速可靠的技術(shù)檢測(cè)病種率而影響拌種的決策有關(guān)。為了改變這種現(xiàn)狀，研制其簡(jiǎn)便可靠的檢測(cè)方法是十分必要的。常規(guī)檢驗(yàn)方法非常耗時(shí)，完全依賴專業(yè)人員的癥狀觀察、篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、育苗觀察、血清學(xué)等鑒定以及廣博的分類知識(shí)，而且其準(zhǔn)確性與靈敏度難以滿足要求[4-5]?，F(xiàn)代分子生物學(xué)方法為種傳病害檢測(cè)提供了新的可靠途徑，基于DNA檢測(cè)的方法[如雜交探針、常規(guī)PCR、PCR-RFLP、巢式PCR、多重PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR、PCR-ELISA、in situ PCR、DNA 印跡、基因芯片以及RAPD（SCAR）、SSR、DNA條紋碼等]快速簡(jiǎn)便實(shí)用，還能滿足高通量和潛伏期檢測(cè)的要求[5-8]。國(guó)際上已制定了61種種傳病害不同的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[5-8]，好幾種常見(jiàn)黑穗（粉）病已建立了分子檢測(cè)方法，如常規(guī)PCR檢測(cè)玉米瘤黑粉病[9]、巢式PCR檢測(cè)茭白黑粉病和甘蔗黑粉病[10-11]、DNA印跡和PCR檢測(cè)與區(qū)分玉米絲黑穗病和瘤黑粉病[12]等種傳病害，但對(duì)小麥散黑穗病的分子檢測(cè)方面，尚未見(jiàn)對(duì)該病菌的種特異性強(qiáng)、靈敏度高的經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速分子檢測(cè)方法的報(bào)道。本文報(bào)道了利用普通PCR檢測(cè)小麥散黑穗病的新方法。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1主要儀器與設(shè)備移液槍（德國(guó)，eppendorf）；DYY-10型三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR基因擴(kuò)增儀（美國(guó)，Bio-Rad）；超純水制造系統(tǒng)（美國(guó)，MILLI-Q）；高速冷凍離心機(jī)（日本，日立公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)，科達(dá)公司）；紫外分光光度計(jì)U-3010（日立公司）。

1.1.2主要試劑主要化學(xué)與生物試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司與美國(guó)Sigma公司，擴(kuò)增引物與雜交探針均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3供試菌種供試菌株見(jiàn)表1。小麥條銹菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所銹病組提供，其他菌系均由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

表1供試菌株名稱和代號(hào)

病原菌1所致病害1菌系代號(hào)大麥散黑粉菌（Ustilago nuda）1小麥散黑穗病1XSH絲孢堆黑粉菌（Sporisorium reilianum）1玉米絲黑穗病1YSH小麥白粉菌（Blumeria graminis f.sp. tritici）1小麥白粉病1XBF葫蘆科白粉菌（Erysiphe cucurbitacearum）1黃瓜白粉病1HBF條銹病菌（Puccinia striiformis f.sp. tritici）1小麥條銹病1XTX稈銹病菌（P. graminis f.sp. tritici）1小麥稈銹病1XGX細(xì)柄銹病（P. triticina）1小麥葉銹病1XYX禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）1小麥赤霉病1XCM小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）1小麥紋枯病1XWK立枯絲核菌（Rh. solani）1玉米紋枯病1YWK

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌種收集方法（1）小麥散黑穗病菌和玉米絲黑穗病菌的收集。用解剖針從樣品或菌癭中挑取單個(gè)冬孢子置于2%瓊脂平板上，于20 ℃、12 h光照條件下培養(yǎng)15～20 d，顯微鏡下觀察有無(wú)孢子萌發(fā)，將萌發(fā)孢子轉(zhuǎn)移至PDA平板上，20 ℃培養(yǎng)15 d，收集菌絲，4 ℃保存?zhèn)溆?。?）小麥白粉病菌的收集。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，將保存的白粉病菌單菌落用抖落法接種到高感品種小麥穗上，培養(yǎng)7～14 d，待菌落長(zhǎng)出，分生孢子大量繁殖時(shí)，在超凈工作臺(tái)上搖動(dòng)花盆將其抖落到載玻片上，再用細(xì)毛筆將其刷進(jìn)1.5 mL離心管中（可多次收集，每支管中達(dá)到30～50 mg孢子），將收集了孢子的離心管置于裝有變色硅膠的干燥器中干燥3～5 d，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?（3）小麥稈銹病菌、小麥葉銹病菌的收集。將感病品種McNair701播種于花盆內(nèi)，待幼苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)剪取第1張葉，平展于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)（葉背面朝上），培養(yǎng)皿中墊有浸過(guò)保鮮液的濾紙。用牙簽沾上孢子，輕輕地向葉面涂抹，使葉面均勻地沾有1層孢子。接種后，用5×10-4Tween 20溶液進(jìn)行噴霧，18 ℃ 黑暗條件下保濕6～18 h。18 ℃、8 000 lx光照 14 h/d，培養(yǎng)15 d左右，收集孢子，干燥，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?）其他參考菌株的收集。將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d的各菌株接入馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)（25 ℃，100 r/min） 4～7 d，用無(wú)菌紗布過(guò)濾，再用無(wú)菌水沖洗2次，用濾紙吸干多余水分，將菌絲體放入65 ℃恒溫箱中干燥2～4 h，取出碾碎，裝入 1.5 mL 離心管中，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹13]。

1.2.2基因組DNA的提取小麥散黑穗菌、玉米絲黑穗菌、小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、玉米紋枯菌等分離純化后接種至PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌絲體經(jīng)真空抽濾，采用Pascual等改良后的CTAB法[14]提取病菌DNA。小麥白粉菌、黃瓜白粉菌、小麥條銹菌、葉銹菌和稈銹菌的小種或菌株在溫室用各自的高感品種繁殖，分別收取孢子，采用Enjalbert等玻璃珠破碎病菌細(xì)胞壁的CTAB法[15]提取DNA，其中幾個(gè)特別環(huán)節(jié)分述如下：（1）小麥白粉菌DNA的提取。隔離條件下收集白粉菌至2 mL離心管中，將菌體重量按5 mL ∶1 g比例加入裂解緩沖液，加入3/10總體積的石英砂，蓋緊，渦旋振蕩5～ 8 min，65 ℃ 水浴10 min，加入600 μL 7.5 mol/L NH4Ac，冰浴 8 min；然后反復(fù)抽提，收集沉淀，加入1×TE，于-20 ℃保存。（2）黃瓜白粉病菌提取。參照王娜等的方法[16]，用手指輕彈染病的葉片，使病菌孢子及菌絲落在滴加緩沖液的載玻片上，在解剖鏡下用針將孢子和菌絲壓碎后轉(zhuǎn)移至離心管，加入 10 μL Tween20，60 ℃水浴3 h后，12 000 r/min離心 5 min，取上清液，-20 ℃保存，待用。（3）小麥條銹病菌、小麥稈銹病菌、小麥葉銹病菌DNA的提取。稱取小麥條銹菌、葉銹菌和稈銹菌孢子裝于2 mL離心管中，加入玻璃珠及預(yù)熱的0.8%CTAB提取緩沖液混勻，在渦旋儀上以最大速度振蕩 3 min 后，于 65 ℃ 條件下水浴 1.5 h，然后反復(fù)抽提，收集沉淀，加入1×TE，于-20 ℃保存。（4）其他菌株DAN的提取。用液氮將病原菌快速研磨后轉(zhuǎn)入事先裝有500 μL提取緩沖液A的2 mL離心管中，混勻后加入50 μL 10%SDS，混勻，置于水浴鍋 37 ℃ 1 h；再加入 75 mL 5 mol/L NaCl及65 μL 10%CTAB，再次混勻，置于 65 ℃ 水浴鍋20 min；然后反復(fù)抽提，收集沉淀，加入1×TE，于-20 ℃保存。

1.2.3?；砸锏脑O(shè)計(jì)選用擴(kuò)增ITS1、5.8S、ITS2核糖體基因的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），專一擴(kuò)增 rDNA 中的ITS1、5.8S、ITS2區(qū)域[17]。對(duì)得到的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行測(cè)序，用測(cè)序結(jié)果登錄Genebank，與相關(guān)菌的ITS序列進(jìn)行比對(duì)，選取小麥散黑穗病菌的特異DNA序列做特異的PCR引物（圖1）。

1.2.4PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系（20 μL）：10×PCR buffer 2.0 μL；25 mmol/L MgCl2 1.5 μL；10 mmol/L dNTP 0.4 μL；引物（15 μmol/L） 各0.8 μL；Taq DNA聚合酶（5 U） 0.2 μL；DNA模板（1ng/ μL） 1.0 μL；ddH2O 14.1 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.5PCR產(chǎn)物電泳與染色觀察PCR擴(kuò)增完畢后，用 1×TBE 配制1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，每孔加樣5 μL，100 bp Ladder Marker為對(duì)照，電泳液為1×TBE。凝膠在 0.5 μg/mL 溴乙錠溶液染色20 min，凝膠成像分析系統(tǒng)照相。

1.2.6小麥散黑穗病菌PCR引物特異性檢測(cè)用設(shè)計(jì)合成的特異性引物對(duì)所有供試菌株及小麥葉片的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)設(shè)計(jì)引物的特異性。

1.2.7小麥散黑穗病菌PCR引物靈敏性檢測(cè)將提取的小麥散黑穗病菌的DNA稀釋成1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg共7個(gè)不同濃度，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果測(cè)定引物的靈敏度。

2結(jié)果與分析

2.1小麥病害病原菌PCR引物設(shè)計(jì)結(jié)果

將小麥散黑穗病菌的ITS區(qū)域測(cè)序結(jié)果與Genebank中登錄的相關(guān)菌的ITS序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)小麥散黑穗病菌的特異性引物，比對(duì)結(jié)果及特異性引物如圖1所示，即設(shè)計(jì)出小麥散黑穗病菌的PCR的特異擴(kuò)增引物對(duì)XSHF（5′-AGGAGAAAATCCTCGCGTCT-3′）/XSHR（5′-CAGAAGCACTCCAAACAGCA-3′）。F和R引物的序列長(zhǎng)度均為20個(gè)堿基，很理想。

2.2小麥散黑穗病菌特異性檢測(cè)

以設(shè)計(jì)的小麥散黑穗病菌特異性引物XSHF/R對(duì)所有供試菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有小麥散黑穗病菌能擴(kuò)增出533 bp左右的條帶，其他供試非靶標(biāo)參考菌株未擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物對(duì)小麥散黑穗病菌具有特異性，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3小麥散黑穗病菌檢測(cè)靈敏度測(cè)定

用引物XSHF/R對(duì)稀釋成1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg共7個(gè)不同濃度的小麥散黑穗病菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果可以檢測(cè)到最低含量為1 pg的DNA（圖2）。

3結(jié)論與討論

小麥散黑穗病是小麥常見(jiàn)的典型種傳病害，帶菌種子的病菌來(lái)源于生長(zhǎng)季小麥揚(yáng)花時(shí)，其他病穗上的冬孢子經(jīng)風(fēng)雨傳給健康的花柱頭，孢子萌發(fā)侵入子房，再以休眠菌絲潛伏在胚內(nèi)。種子萌發(fā)時(shí)，病菌被激活生長(zhǎng)且始終位于植株頂端和穗原基，直到抽穗，顯露最易識(shí)別的癥狀：薄膜包裹的冬孢子團(tuán)（病穗）[18-19]。帶菌種子或植株與無(wú)菌種子或植株外觀均無(wú)可診斷的差異，因此，是否需要進(jìn)行化學(xué)藥劑拌種等防治處理的決策需要以帶菌率檢測(cè)作為科學(xué)依據(jù)?？焖?、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的可靠保證。本研究利用真菌通用引物[18]，對(duì)小麥散黑穗病菌的ITS區(qū)域序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序、Genbank搜索，用其他9個(gè)相近病菌作參照，通過(guò)軟件分析比對(duì)，設(shè)計(jì)了長(zhǎng)度為20個(gè)堿基的該病菌的特異性引物XSHF（5′-AGGAGAAA ATCCTCGCGTCT-3′）/ XSHR（5′-CAGAAGCACTCCAAACAGCA-3′），能在Ustilago屬內(nèi)種的水平特異性上檢測(cè)小麥散黑穗病菌，對(duì)小麥散黑穗病菌的檢測(cè)限為1 pg。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，為實(shí)現(xiàn)該病種子帶菌率檢測(cè)提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。