馬鈴薯黑痣病菌拮抗菌的篩選鑒定及生防因子分析

宋本超 趙冬梅 楊志輝 張岱 趙志 朱杰華

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，保定 071001）

目前我國馬鈴薯的種植面積和總產(chǎn)量位居世界首位［1］，隨著種植面積的不斷增加，馬鈴薯連作現(xiàn)象越來越普遍，導(dǎo)致土傳病害呈逐年加重趨勢［2-3］。馬鈴薯黑痣病是典型的土傳病害，由立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKühn）引起，主要為害馬鈴薯的根莖部和薯塊，對馬鈴薯產(chǎn)量和外觀品質(zhì)具有重要影響，已成為影響馬鈴薯生產(chǎn)的主要病害之一。目前，化學(xué)農(nóng)藥可以在一定程度上對黑痣病進(jìn)行預(yù)防，但是在實(shí)際生產(chǎn)中存在用藥量大，效果不佳等問題［4］。因此，馬鈴薯黑痣病的安全有效的防治是目前生產(chǎn)上急需解決的問題。

芽胞桿菌Bacillusspp.是植物和土壤環(huán)境微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢種群，其可以產(chǎn)生脂肽類［5］、抗菌蛋白［6］等多種抗菌物質(zhì)，并且能夠產(chǎn)生抗逆性很強(qiáng)的內(nèi)生芽胞，可作為防治多種病害的生防菌［7］，是未來土傳病害防治的重要研究方向。鑒定生防菌的種類和對生防芽胞桿菌的生防相關(guān)因子進(jìn)行多方面研究對生防菌的應(yīng)用有重要的指導(dǎo)作用，其中與芽胞桿菌抑菌作用相關(guān)的物質(zhì)主要是抗菌脂肽、抗生素和水解酶類等［8］。李全勝等［9］報(bào)道莫哈韋芽胞桿菌B. mojavensis能夠合成蛋白酶并含有srfAA、fenD、bacA脂肽類抗生素合成基因，具有良好的抑菌防病能力；王俊麗等［10］研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens等夠產(chǎn)生嗜鐵素、蛋白酶、纖維素酶和吲哚乙酸（IAA），發(fā)酵原液在離體情況下對番茄灰霉病的防效為100%；劉洋等［11］發(fā)現(xiàn)內(nèi)生芽胞桿菌1A可以通過分泌蛋白酶和纖維素酶降解真菌細(xì)胞壁，使菌絲扭曲、斷裂，分支增多并纏繞，菌絲顏色加深等，對孢子萌發(fā)抑制率達(dá)74.89%。但是生防芽胞桿菌的研究中與馬鈴薯黑痣病相關(guān)的報(bào)道較少，增加關(guān)于馬鈴薯黑痣病的生防芽胞桿菌的篩選和生防機(jī)理的研究是必要的。

為篩選對馬鈴薯黑痣病菌有抑制作用的生防菌，本研究從張北地區(qū)多年連作的馬鈴薯黑痣病田中采集土樣，從中篩選對馬鈴薯黑痣病菌有抑制作用的生防菌株，并對效果較好的生防菌株進(jìn)一步進(jìn)行鑒定并測定其抑菌譜和分泌的生防相關(guān)物質(zhì)，以期豐富馬鈴薯黑痣病生防資源，為馬鈴薯黑痣病的生物防治提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 采自河北省張北縣馬鈴薯黑痣病發(fā)生地塊的健康馬鈴薯植株根際土壤，取得土壤放入無菌袋中編號。

1.1.2 供試病原菌 立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）ZB4；干腐病菌（Fusarium sambucinum）B-6；早疫 病 菌（Alternaria solani）NHL17-207；瘡 痂 病菌（Streptomyces scabies）13；枯萎病菌（Fusarium oxysporum）腰站1-1；黑脛病菌（Erwinia carotovora）E8。供試病原菌均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院馬鈴薯晚疫病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

燕麥培養(yǎng)基：燕麥30 g/L，瓊脂20 g/L。

生理生化鑒定所需培養(yǎng)基：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［12］。

解磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，硫酸銨0.5 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，瓊脂20 g/L，MnSO40.03 g/L，硫酸亞鐵0.03 g/L，磷酸三鈣5.0 g/L，pH 7.0。

解鉀培養(yǎng)基：蔗糖5 g/L，葡萄糖5 g/L，硫酸銨 0.5 g/L，酵母膏 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，Na2HPO42 g/L，七水硫酸亞鐵0.03 g/L，MnSO40.03 g/L，鉀長石2 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.0。

酪蛋白培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，酵母膏4 g/L，酪蛋白 10.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

纖維素培養(yǎng)基：K2HPO41.0 g/L，硫酸銨2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，微晶纖維素 2 g/L，瓊脂20 g/L。

果膠培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏 5 g/L，NaCl 5 g/L，果膠 5 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7.0加飽和乙酸銅溶液染色15 min。

1.2 方法

1.2.1 拮抗細(xì)菌的分離與篩選 取10 g土樣加入裝有90 mL無菌水的滅菌錐形瓶中，充分震蕩、搖勻，80℃水浴20 min，取1 mL土壤懸浮液用無菌水梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，分別吸取200 μL梯度稀釋液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度重復(fù)3皿，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待平板長出單菌落后，挑取單菌落進(jìn)行純化、培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

初篩：以立枯絲核菌ZB4為指示菌，在PDA培養(yǎng)基中央接種直徑5 mm的ZB4菌餅，上下左右各2.5 cm處放置5 mm的濾紙片，點(diǎn)接5 μL分離得到的候選拮抗菌菌懸液，以接無菌水為對照，待對照長滿平板后，測量抑菌帶寬度，挑選抑菌效果較好的進(jìn)行復(fù)篩。

復(fù)篩：在PDA培養(yǎng)基中央接種直徑5 mm的濾紙片，點(diǎn)接5 μL分離得到的候選拮抗菌菌懸液，上下左右各2.5 cm處放置5 mm的ZB4菌餅，以接無菌水為對照，待對照長滿平板后，測量抑菌圈直徑。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 生理生化鑒定 菌落形態(tài)觀察：將Z17-2菌液稀釋涂布于LB平板上37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形狀、顏色、邊緣、表面、隆起形狀、透明度。

生理生化鑒定參照《伯杰氏系統(tǒng)分類手冊》［13］和《常見細(xì)菌系統(tǒng)分類手冊》［12］進(jìn)行。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 使用全式金細(xì)菌基因組提取試劑盒提取Z17-2基因組DNA。采用通用引物27F、1492R擴(kuò)增16S rDNA，采用簡并引物gyrB-F、gyrB-R［14］擴(kuò)增gyrB基因（引物序列見表1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測，并送上海生工生物工程有限公司測序。應(yīng)用BLAST軟件將所得序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中核酸序列進(jìn)行比對分析，下載同源性高的序列用MEGA6.06軟件鄰接法（Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表 1 本研究所用引物

1.2.3 抑菌譜測定 用接種環(huán)挑取一環(huán)保存的生防菌Z17-2菌液在LB平板上劃線活化，挑取一環(huán)單菌落到裝LB培養(yǎng)基（100/250 mL）的三角瓶中，37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h備用。

抑制病原真菌測定：采用抑菌圈法對Z17-1的抑菌能力進(jìn)行測定。在培養(yǎng)基平皿中央放置直徑6 mm的濾紙片，四周2.5 cm處放直徑6 mm的病原菌菌餅。取發(fā)酵液5 μL點(diǎn)在濾紙片中央，以無菌水為對照，適宜溫度培養(yǎng)至對照長滿全皿，十字交叉法測定抑菌圈大小。

抑制病原細(xì)菌測定：將病原細(xì)菌制成菌懸液進(jìn)行涂板，在培養(yǎng)皿中央放置一濾紙片，取發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液5 μL點(diǎn)在濾紙片中央，適宜溫度培養(yǎng)至對照長滿全皿，十字交叉法測定抑菌圈大小。

1.2.4 生防菌Z17-2生防因子分析

1.2.4.1 菌株Z17-2發(fā)酵液表面活性物質(zhì)的檢測 應(yīng)用改進(jìn)排油圈方法［15］檢測生防菌Z17-2發(fā)酵液是否有表面活性功能的脂肽類產(chǎn)物生成。

1.2.4.2 產(chǎn)脂肽基因的檢測 參考鄧建良［16］、王超男［17］的文獻(xiàn)合成sfp、ituA、fenB、bacD、mycB等5個(gè)目的基因的引物（引物序列見表1），生防菌Z17-2的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR 反應(yīng)體系為 ：2×Taq Master Mix 12.5 μL、10 μmol/L 引物各 1 μL、模板 DNA 1 μL、ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增sfp、ituA基因的PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性 1 min、43℃退火1 min、72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增fenB基因的PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性 1 min、50℃退火1 min、72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增bacD基因的PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性 1 min、54℃退火1 min、72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增mycB基因的PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性 1 min、53℃退火1 min、72℃延伸1.5min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4.3 脂肽粗提物抑菌活性測定 采用大孔樹脂法［18］進(jìn)行生防菌Z17-2發(fā)酵液中脂肽物質(zhì)的提取，以立枯絲核菌為指示菌，采用帶毒培養(yǎng)基法檢測脂肽類物質(zhì)的抑菌作用，具體方法為：將脂肽粗提物按照1%的體積分?jǐn)?shù)加入到融化的PDA培養(yǎng)基中，制成帶毒培養(yǎng)基，以空白PDA為對照，在培養(yǎng)皿中央接種直徑為6 mm的立枯絲核菌菌餅，25℃恒溫培養(yǎng)3 d后計(jì)算抑菌率，重復(fù)3次。抑菌率計(jì)算公式如下：

抑菌率（%）=［對照菌落直徑（mm）-處理菌落直徑（mm）］/對照菌落擴(kuò)展直徑（mm）×100%

1.2.4.4 體外產(chǎn)酶及解磷解鉀能力測定 將生防菌Z17-2分別點(diǎn)接到酪蛋白培養(yǎng)基、纖維素培養(yǎng)基、果膠培養(yǎng)基、磷培養(yǎng)基、鉀培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，觀察是否有透明圈產(chǎn)生，若有則證明具有相應(yīng)的分解酶產(chǎn)生。

1.2.4.5 產(chǎn)鐵載體能力測定 取菌株Z17-2發(fā)酵上清液0.5 mL加入0.5 mLCAS顯色液，室溫靜置2 h，以空白培養(yǎng)基做對照，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。若顏色變化為黃色，則證明生防菌Z17-2具有產(chǎn)鐵載體的能力。

2 結(jié)果

2.1 拮抗細(xì)菌分離篩選

從11份健康馬鈴薯植株根際土中共篩選得到對黑痣病菌有抑制作用的拮抗菌109株，經(jīng)初篩和

復(fù)篩得到抑菌效果穩(wěn)定的拮抗菌株共9株，命名為Z17-1-Z17-9，其中菌株Z17-2對馬鈴薯立枯絲核菌抑制效果穩(wěn)定，抑菌圈直徑大于29 mm。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)及生理生化特征 菌株Z17-2在LB平板上培養(yǎng)24 h時(shí)，形成近圓形具有乳白色菌膜的菌落，菌落表面有褶皺，四周有凸起中間略凹陷（圖1），革蘭氏染色為陽性。

圖1 Z17-2菌落形態(tài)和革蘭氏染色

菌株Z17-2生理生化測定結(jié)果（表2），接觸酶實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)陽性，甲基紅實(shí)驗(yàn)陰性，可以分解淀粉、使明膠液化，可以發(fā)酵糖、醇類產(chǎn)酸，能利用檸檬酸鹽，可以產(chǎn)生吲哚，不能產(chǎn)生H2S，在20℃-50℃均可生長，低于4℃不能生長，可以在含鹽10%的培養(yǎng)基上生長，生理生化特征符合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中對于芽胞桿菌屬的描述。

表2 菌株Z17-2的生理生化特征

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 經(jīng)NCBI Blast分析Z17-2拮抗菌的16S rDNA序列（Gen-bank登錄號為MK271286）與解淀粉芽胞桿菌KC417346相似度為100%，gyrB（Gen-bank登錄號為MK295695）序列與解淀粉芽胞桿菌KP292551的相似度為99%。利用鄰接法（Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，Z17-2的16S rDNA和gyrB序列均與解淀粉芽胞桿菌聚為一支（圖2）。結(jié)合生理生化特征，鑒定菌株Z17-2為解淀粉芽胞桿菌。

2.3 抑菌譜測定

菌株Z17-2對馬鈴薯上常見病原菌的抑菌結(jié)果（表3，圖3）表明，它不僅對立枯絲核菌有抑制作用，而且對枯萎病菌、干腐病菌、早疫病菌等真菌和瘡痂放線菌也具有抑菌作用，對黑脛病菌沒有抑制作用。

2.4 生防菌Z17-2生防因子分析

2.4.1 生防菌Z17-2脂肽類物質(zhì)分析 通過向油膜中央滴加Z17-2發(fā)酵液可以形成明顯的排油圈，而滴加LB培養(yǎng)基則不能形成排油圈，結(jié)果表明，發(fā)酵液具有表面活性劑的作用，說明Z17-2能夠產(chǎn)生具有表面活性的脂肽類物質(zhì)。對5個(gè)脂肽類合成基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果有4對引物分別擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，分別是基因sfp（675 bp）、fenB（1 400 bp）、bacD（540 bp）、mycB（2 024 bp）（ 圖4），對應(yīng)的脂肽類物質(zhì)分別是sufactins、fengycins、Bacillomycin D、mycosubtilin，未擴(kuò)增到ituA的目的條帶。應(yīng)用大孔樹脂法提取的脂肽類物質(zhì)對馬鈴薯黑痣病菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，其對馬鈴薯黑痣病菌有很好的抑菌效果，抑菌率達(dá)到70.38%。

圖2 菌株Z17-2系統(tǒng)發(fā)育樹

表 3 生防菌Z17-2抑菌效果

圖3 生防菌Z17-2抑菌譜

圖 4 生防菌Z17-2脂肽合成基因的PCR產(chǎn)物電泳

2.4.2 生防菌Z17-2體外產(chǎn)酶、解磷解鉀及產(chǎn)鐵載體能力 通過底物降解法測定生防菌Z17-2具有分泌蛋白酶、纖維素酶，不具有分泌果膠酶的能力，不具有解磷解鉀能力。通過CAS顯色法證明生防菌Z17-2具有產(chǎn)生鐵載體的能力。

3 討論

圖 5 生防菌Z17-2發(fā)酵液脂肽提取物對立枯絲核菌的抑制作用

菌株鑒定是了解與應(yīng)用生防菌株的基礎(chǔ)，目前常用的鑒定方法是生理生化特征鑒定和基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，崔月貞［19］結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA基因序列同源性分析將3株馬鈴薯晚疫病的拮抗菌262AY11、262AY6和264AY2鑒定為韋氏芽胞桿菌B. weihenstephanensis、解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciens和枯草芽胞桿菌B. subtilis。有研究表明16S rDNA序列在枯草芽胞桿菌近緣種相似度太高，除短小芽孢桿菌和索諾拉沙漠芽孢桿菌以外，其余8個(gè)種的16S rDNA基因序列相似性均在99.5%以上［20］。所以近幾年開發(fā)出了很多16S rDNA的替代靶基因，如gyrB、gyrA、rpoB、recA、rctB等［10，21］。Wang［22］研究發(fā)現(xiàn)gyrB基因在枯草群各種、亞種之間相似性在75%-95%之間，相比于16S rDNA基因能更準(zhǔn)確地將枯草芽胞桿菌近緣種區(qū)分開。

生物活性物質(zhì)在生防微生物表現(xiàn)生防作用方面有至關(guān)重要的作用［6］，Cawoy［23］發(fā)現(xiàn) sufactin 可以刺激植物的免疫反應(yīng)，提高植物抗病性；Soo-Jin［24］發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌KS03抑制Gloeosporium gloeosporioides的主要抑菌物質(zhì)是iturin A2；李丹等［25］研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌TR2和CE解磷解鉀能力可以促進(jìn)西瓜幼苗根和莖的生長。解淀粉芽胞桿菌是極具潛力的生防菌，能夠產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，其中脂肽類是其產(chǎn)生的一種重要的抑菌活性物質(zhì)，主要包括 sufactins、fengycins、iturin三個(gè)家族［5］。近年來，對脂肽合成基因有比較深入的研究，可以利用PCR擴(kuò)增的方法快速檢測生防菌中是否具有脂肽類合成的基因，如盧彩鴿等［26］通過PCR擴(kuò)增檢測到解淀粉芽胞桿菌MH71中含有fenB、mycB、ituA、sfp等脂肽類抗生素合成酶基因；王亞杰等［27］研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌fqhm-13含有脂肽抗生素合成基因ituC、ituD、fenD和srfAB，本研究篩選到的生防解淀粉芽胞桿菌Z17-2中檢測到了sfp、fenB、bacD、mycB等脂肽合成基因，這說明生防菌Z17-2可能通過多種抗生素的共同作用發(fā)揮其生防效果。

本研究采用便捷、高效的指示菌法篩選到一株高效生防菌Z17-2，結(jié)合形態(tài)及生理生化特征、16S rDNA和gyrB序列分析，將菌株Z17-2鑒定為解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciens，其對馬鈴薯黑痣病的抑菌圈直徑大于2.9 cm，抑菌效果優(yōu)于關(guān)小敏等［28］篩選的類芽胞桿菌G1和朱明明等［29］篩選的貝萊斯芽胞桿菌HN-Q-8，且對5種常見馬鈴薯病原菌具有抑制作用。通過關(guān)鍵基因擴(kuò)增和底物降解法測定產(chǎn)生防因子能力，結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌Z17-2能夠合成表面活性素、豐原素和伊枯草素，能夠分泌嗜鐵素、蛋白酶和纖維素酶表明解淀粉芽胞桿菌Z17-2通過多種作用方式表現(xiàn)其生防功能，是1株很有應(yīng)用潛力的生防菌株。本研究結(jié)果為該生防菌株的開發(fā)應(yīng)用提供了很好的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)共篩選出對立枯絲核菌有抑制效果的拮抗菌109株，其中菌株Z17-2對早疫病菌、枯萎病菌、干腐病菌、瘡痂病菌菌也有明顯抑制作用。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA和gyrB序列分析，將其鑒定為解淀粉芽胞桿菌，經(jīng)過測定發(fā)現(xiàn)其可以產(chǎn)生脂肽類、蛋白酶、纖維素酶、鐵載體等生防相關(guān)物質(zhì)。