酶解條滸苔蛋白制備抗肺癌活性多肽

段訓(xùn)威 肖桂清 王禮興 吳文林 戴聰杰 董樂(lè)

（1. 泉州師范學(xué)院，泉州 362000；2. 福建省銀豐干細(xì)胞工程有限公司，泉州 362000；3. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，泉州 362000；4. 福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泉州 362000）

美國(guó)NCI篩選出了幾萬(wàn)個(gè)天然抗腫瘤化合物，約5%來(lái)源于海洋生物，其中來(lái)自海洋植物的3.5%具有抗腫瘤活性［1］。我國(guó)漫長(zhǎng)的海岸線橫跨熱帶、亞熱帶和溫帶，復(fù)雜的海域地理環(huán)境造就了我國(guó)海洋生物的多樣性，為我國(guó)天然藥物開發(fā)與研究提供極豐富的自然資源。其中滸苔生長(zhǎng)迅速，生物量較大，是重要的海洋植物資源。在分類學(xué)上，滸苔屬（Enteromorpha）屬于綠藻門（Chlorophyta），石莼目（Ulvales），石莼科（Ulvaceae），主要有條滸苔、扁滸苔、滸苔、腸滸苔及緣管滸苔5種［2］。2008年綠潮藻類曾在我國(guó)黃海中、南部海域爆發(fā)成災(zāi)，其實(shí)滸苔是具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的藻類資源，其干物質(zhì)中粗蛋白含量約10%-35%，其中條滸苔、腸滸苔（福建海域）粗蛋白含量約34%；滸苔中必需氨基酸與非必需氨基酸的比值（EAA/NEAA）為0.62，且氨基酸種類齊全，其必需氨基酸（EAA）占氨基酸總量（TAA）約40%，氨基酸評(píng)分約80，顯著高于紫菜（54）和海帶（47）［2］，是優(yōu)質(zhì)的海洋植物蛋白質(zhì)來(lái)源之一。目前，關(guān)于滸苔等多數(shù)海藻的研究與開發(fā)主要集中在碳水化合物，而對(duì)其蛋白質(zhì)及深加工的研究鮮有報(bào)道［3-4］。

天然植物蛋白質(zhì)除提供能量和氨基酸外，一些來(lái)自蛋白質(zhì)原有序列中的小肽還具有多種生理功能，其不易被消化系統(tǒng)酶系降解，具備口服給藥發(fā)揮生理功能的條件［5］。此外，其相比于小分子化學(xué)藥物，對(duì)目標(biāo)腫瘤具備高親和力、高特異性、低毒性［6-7］；與抗體藥物相比，免疫原性低、組織滲透性強(qiáng)；還具備良好的溶解性與保濕性，高濃度下黏度低、熱穩(wěn)定等物理特性，為規(guī)?；a(chǎn)提供較好的物理特性基礎(chǔ)［8-9］。酶解蛋白制備活性小肽是當(dāng)前較為普遍的技術(shù)，酶解具有專一性強(qiáng)、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)［10］；研究認(rèn)為，目前酶法制備獲得小肽的關(guān)鍵在于蛋白質(zhì)的來(lái)源、酶的選擇及酶解工藝的優(yōu)化與控制［11］。目前已從天然蛋白質(zhì)原有序列中釋放出了如免疫調(diào)節(jié)肽［12］、降血脂肽［13］、降血壓肽［14］、促鈣吸收肽［15］、抗腫瘤肽［16］、抗菌肽［17］等功能性肽，其中滸苔在食用、醫(yī)藥和生物醫(yī)學(xué)等方面也表現(xiàn)出具有巨大市場(chǎng)潛力和較高的研究?jī)r(jià)值。

基于此，本研究以條滸苔（福建海域）為原材料，采用特異性蛋白酶酶解制備功能小肽，分離獲得不同分子量區(qū)間小肽混合液，以血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和肺癌細(xì)胞（NCI-H446、NCI-H460、A549）為研究對(duì)象，體外初步評(píng)價(jià)酶法制備的條滸苔多肽抗肺癌生物活性。為后續(xù)小分子天然活性肽的商業(yè)開發(fā)、純化與抗腫瘤機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，亦為探索條滸苔資源高值化利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

滸苔（干品）由福建福清海興保健食品有限公司提供（福建海域，條滸苔）；木瓜蛋白酶（酶活力：2.0×105U/g）購(gòu)自南寧龐博生物工程；恒溫振蕩水浴鍋（常州國(guó)華電器）；冷凍干燥機(jī)（東京理化）；超濾裝置（海濱儀器）；倒置熒光顯微鏡（Nikon TE2000）；流式細(xì)胞儀（BD FACS Calibur）；9602G酶標(biāo)儀（Perlong）；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、Transwell（Corning）；Hoechst33342、PI染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；順鉑、MTT、ECM、VEGF均購(gòu)自Sigma；高糖DMEM、RPMI-1640、M199、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco；RNase A購(gòu)自上海生工；血管上皮細(xì)胞（HUVEC）、肺癌NCI-H460、NCI-H446、A549細(xì)胞均來(lái)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 滸苔蛋白提取、酶解及超濾分離 滸苔60℃烘干粉碎至180目［18］，采用堿提酸沉法提取滸苔蛋白，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的酶解條件：25∶1（W/V）比例加入蒸餾水充分溶脹3 h，調(diào)整酶解條件（pH 7.25）后室溫放置穩(wěn)定1 h，加入1 250 U/g木瓜蛋白酶，45.7℃低速振蕩酶解120 min，90℃滅活15 min，4 000 rpm離心10 min收集上清液，經(jīng)微孔濾膜（10 μm）微濾去雜質(zhì)后，依次通過(guò)截留分子量為2 kD、6 kD、12 kD的超濾膜分級(jí)超濾，獲得多肽各組分凍干備用，根據(jù)量效關(guān)系預(yù)實(shí)驗(yàn)，本研究以實(shí)驗(yàn)終濃度為0.5 mg/mL的各分子量滸苔多肽處理48 h進(jìn)行分析研究。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于96孔板（1×105cells/200 μL·孔），待貼壁后，以0.5 mg/mL終濃度的多肽組分II（2 kD＜M＜6 kD）處理細(xì)胞（下面細(xì)胞處理方法與此相同），設(shè)置PBS處理的空白組，設(shè)置1 μg/mL順鉑（DDP）處理的陽(yáng)性組［19］；48 h后MTT法檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖率（Relative grow rate，RGR），每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.3 細(xì)胞氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 將HUVEC細(xì)胞接種于96孔板（1×105cells /200 μL·孔），待貼壁后，處理同1.2.2，同時(shí)設(shè)置PBS處理的對(duì)照組；37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，加入DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS）稀釋的H2O2至終濃度500 μmol/L，以加入同樣體積的無(wú)菌去離子水作為陰性對(duì)照計(jì)算相對(duì)存活率（Relative survival rate，RSR）。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.4 體外小管形成實(shí)驗(yàn) 在4℃條件下過(guò)夜融化ECM，用無(wú)血清DMEM按2：1稀釋后，加入96孔板（60 μL/孔），置于37℃培養(yǎng)箱待ECM凝固，每孔加入100 μL 的 HUVEC 細(xì)胞懸液（2.5×105cells/mL），細(xì)胞處理同1.2.2，同時(shí)設(shè)置PBS處理的對(duì)照組；置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。倒置顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野觀察小管形成情況。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將肺癌細(xì)胞接種于96孔板（1×105cells/200 μL·孔），待貼壁后，細(xì)胞處理同1.2.2，同時(shí)設(shè)置PBS處理的對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后采用Hoechst33342染色法分析腫瘤細(xì)胞凋亡情況，在熒光顯微鏡下觀察藍(lán)色熒光，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 在Transwell下室加入500 μL的 M199培 養(yǎng)基（ 含 10 ng/mL VEGF、10% FBS），上室加入100 μL的M199（不含F(xiàn)BS），37℃培養(yǎng)箱內(nèi)平衡1 h；棄上室培養(yǎng)基，每孔加入100 μL肺癌細(xì)胞懸液（2.5×105cells/mL），細(xì)胞處理同“細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)”，同時(shí)設(shè)置PBS處理的對(duì)照組；置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，棉簽擦去上室細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察穿過(guò)膜附著在下室的細(xì)胞，隨機(jī)取5個(gè)視野拍照，并用Image J軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算遷移率。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.7 細(xì)胞周期測(cè)定實(shí)驗(yàn) 將肺癌細(xì)胞接種于6孔板（1×105cells/2 mL·孔），待貼壁后，處理同1.2.5，同時(shí)設(shè)置PBS處理的對(duì)照組；培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，用PBS重復(fù)清洗3次后，加入含100 U/mL RNase A的終濃度為5 μg/mL的PI，4℃避光孵育30 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期過(guò)程中各期的細(xì)胞相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件分析與處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以x-±s表示，組間比較單因素方差分析，P＜0.01表現(xiàn)為顯著差異，P＜0.05表現(xiàn)為差異，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滸苔多肽的超濾分離

木瓜蛋白酶在最優(yōu)條件下酶解條滸苔蛋白質(zhì)，經(jīng)超濾得到分子量范圍為：I（M＜2 kD）、II（2 kD＜M＜6 kD）、III（6 kD＜M＜12 kD），各分子量的產(chǎn)物作用濃度0.5 mg/mL，MTT分析抗腫瘤活性。結(jié)果（圖1）顯示，與I、III、PBS組相比較，滸苔多肽組分II對(duì)上述三種肺癌細(xì)胞的RGR最低（P＜0.01），組分II對(duì)A549和H446處理組與DDP處理組相比，RGR略低（P＜0.05），組分II對(duì)H460處理組與DDP處理組相比，RGR差異不大（P＞0.05）。因此，選取活性組分II（2 kD＜M＜6 kD）進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 超濾分離不同分子量酶解液對(duì)肺癌細(xì)胞抑制能力

2.2 滸苔多肽對(duì)HUVEC增殖的影響

MTT 檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，組分II（0.5 mg/mL）對(duì)HUVEC的相對(duì)增殖率為83.6%，與PBS組（98.1%）對(duì)比差異不大（P＜0.05）。2-6 kD的滸苔多肽對(duì)正常細(xì)胞HUVEC的抑制作用有限。

2.3 滸苔多肽對(duì)小管形成的影響

結(jié)果（圖3）顯示，PBS處理組的HUVEC細(xì)胞可自行排列，并伸出細(xì)絲連接周圍其他細(xì)胞形成較多節(jié)點(diǎn)，長(zhǎng)度較長(zhǎng)的管腔結(jié)構(gòu)；組分II（0.5 mg/mL）處理的HUVEC細(xì)胞呈散點(diǎn)狀分布，基本不能連接成環(huán)，亦不能形成小管。結(jié)果表明，2-6kD的滸苔多肽具有抑制小管的形成。

圖2 酶解II組分對(duì)HUVECs增殖的影響

n= 5，x-±s. i：PBS；ii：II group

2.4 滸苔多肽抗氧化作用

結(jié)果（圖4）所示，組分II（0.5 mg/mL）處理的HUVEC細(xì)胞相對(duì)存活率為82.1%，與PBS組（41.8%）相比均有極顯著差異（P＜0.01）。結(jié)果表明，2-6 kD的滸苔多肽具有抗氧化作用。

圖4 酶解II組分的抗氧化作用

2.5 滸苔多肽對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果（圖5）顯示，組分II（0.5 mg/mL）處理的A549、H446、H460肺癌細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為82.8%、61.9%和58.8%，與PBS組比較有顯著差異（P＜0.01）。II處理組中，H446和H460相對(duì)增值率顯著低于A549（P＜0.01）。結(jié)果表明2-6 kD的滸苔多肽能有效抑制上述3種肺癌細(xì)胞的增殖，且對(duì)H446、H460的抑制效果好于A549。

圖5 酶解II組分對(duì)肺癌增殖的影響

2.6 滸苔多肽對(duì)肺癌細(xì)胞遷移的影響

結(jié)晶紫染色觀察結(jié)果顯示（圖6-A），組分II（0.5 mg/mL）處理的三種肺癌細(xì)胞遷移數(shù)量顯著少于PBS組。統(tǒng)計(jì)分析表明（圖6-B），組分II處理的3種肺癌細(xì)胞遷移率與PBS組比較顯著差異（P＜0.01）；II處理組中，H446和H460的遷移率顯著低于A549遷移率（P＜0.01）。結(jié)果表明，2-6 kD的滸苔多肽能夠有效抑制上述3種肺癌細(xì)胞的遷移，且對(duì)H446、H460的遷移抑制強(qiáng)于A549。

2.7 滸苔多肽對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響

熒光顯微鏡觀察Hoechst33342染色的結(jié)果（圖7）所示，PBS處理組的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)弱藍(lán)色熒光；組分II處理的A549、H446、H460肺癌細(xì)胞組出現(xiàn)大量凋亡，細(xì)胞核呈現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)色熒光；組分II處理組中，H446和H460比A549凋亡更多。結(jié)果表明2-6 kD的滸苔多肽能有效誘導(dǎo)上述3種肺癌細(xì)胞的凋亡。

2.8 滸苔酶解多肽對(duì)肺癌細(xì)胞周期的影響

圖6 酶解II組分對(duì)肺癌細(xì)胞遷移的影響

圖7 酶解II組分對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀對(duì)滸苔多肽處理的A549、H446、H460細(xì)胞周期時(shí)相的時(shí)間動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果（圖8-A）顯示，所有圖中均存在一個(gè)較大的碎片峰（圖中藍(lán)色部分），可能由于滸苔多肽的作用，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞膜與胞內(nèi)物質(zhì)出現(xiàn)分離，在反復(fù)吹打回收細(xì)胞時(shí)導(dǎo)致部分細(xì)胞破裂。G2/M期細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖8-B）所示，組分II處理的A549、H446、H460肺癌細(xì)胞，G2/M期肺癌細(xì)胞所占比例分別為13.3%、20.3%和20.8%，顯著高于PBS組（P＜0.01），且 II處理組H446、H460的G2/M期所占比例與A549也有顯著差異（P＜0.01）。結(jié)果表明2-6 kD的滸苔多肽能阻滯肺癌細(xì)胞周期于G2/M期。

圖8 酶解II組分對(duì)肺癌細(xì)胞周期的影響

3 討論

目前，隨著制藥技術(shù)的更新?lián)Q代，人們對(duì)天然活性小肽的認(rèn)識(shí)不斷加深，相對(duì)于其他的給藥途徑，天然小肽類藥物的經(jīng)鼻、肺部或口服等給藥途徑表現(xiàn)出更具可行性及商業(yè)價(jià)值［19-20］。天然植物蛋白質(zhì)釋放的小肽是近幾年抗腫瘤新型藥物的研究熱點(diǎn)，其中滸苔屬的小分子肽藥用研發(fā)價(jià)值已逐漸被人發(fā)掘［21］，本研究為條滸苔蛋白質(zhì)資源高值化利用（功能食品、保健飲料、肽類藥物等商業(yè)開發(fā)）探索提供新的途徑。本文充分利用滸苔藻類資源豐富的優(yōu)勢(shì)，在前人的研究基礎(chǔ)上，通過(guò)大量酶解條滸苔蛋白以篩選更多的抗腫瘤活性多肽。研究結(jié)果表現(xiàn)為：（1）經(jīng)木瓜蛋白酶解的小于2 kD和6-12 kD條滸苔多肽對(duì)三種肺癌細(xì)胞未有明顯的抑制作用；其2-6 kD條滸苔多肽對(duì)小管形成有一定抑制作用，說(shuō)明其有抗血管生成能力，間接抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，但其對(duì)HUVEC的增殖抑制作用不強(qiáng)，說(shuō)明其對(duì)正常細(xì)胞的損害不大；（2）2-6 kD條滸苔多肽可抑制H2O2引起的氧化應(yīng)激，說(shuō)明其具有一定的抗氧化能力，該結(jié)果與氧化應(yīng)激是腫瘤一個(gè)重要的誘發(fā)因素和病理特征的研究結(jié)論是一致的［22-23］；（3）2-6 kD條滸苔多肽對(duì)三種肺癌抑制增殖、促進(jìn)凋亡、細(xì)胞周期阻滯等具有一定的作用效果，表明其有一定的抗肺癌能力；細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與目前發(fā)現(xiàn)的一些多肽抗腫瘤研究結(jié)果一致［24-25］，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究；（4）2-6 kD條滸苔多肽抑制H446、H460增殖與遷移、促進(jìn)凋亡、細(xì)胞周期阻滯等作用均表現(xiàn)強(qiáng)于對(duì)A549細(xì)胞的作用，推測(cè)可能對(duì)小細(xì)胞肺癌模型（H446、H460）和非小細(xì)胞肺癌模型（A549）的作用機(jī)制不同，仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

經(jīng)初步篩選及評(píng)價(jià)，本研究以木瓜蛋白酶最佳酶解條件：料液比1∶25、加酶量1250 U/g pro、溫度45.7℃、pH 7.2、震蕩酶解時(shí)間120 min，酶解條滸苔蛋白獲得的2-6 kD的多肽混合液，通過(guò)對(duì)三種肺癌細(xì)胞（A549、H446、H460）和HUVEC處理作用，表明該分子量范圍內(nèi)的多肽混合液中，存在能一定程度抑制小管形成及抗氧化作用，和抑制肺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、阻滯細(xì)胞周期等作用的小分子多肽，且其抑制H446、H460增殖與遷移、促進(jìn)凋亡、細(xì)胞周期阻滯等作用均表現(xiàn)強(qiáng)于對(duì)A549細(xì)胞的作用。本課題組下一步將進(jìn)一步縮小范圍，分離純化解析活性多肽組成，并開展機(jī)制和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。