LncRNA在哺乳動物毛囊發(fā)育調(diào)控中的研究進(jìn)展

常永芳 包鵬甲 褚敏 吳曉云 梁春年 閻萍，3

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2. 甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實驗室，蘭州 730050；3. 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

皮膚是哺乳動物機(jī)體最大的器官，具有抵御環(huán)境侵害（寒冷、強(qiáng)輻射和沙塵暴）、感覺、新陳代謝和體溫調(diào)節(jié)等多種功能。毛囊作為皮膚的一種可再生微小器官，在毛纖維的產(chǎn)生中起重要作用，其生長發(fā)育表現(xiàn)出周期性［1-3］。毛囊的這種周期性循環(huán)是由眾多刺激和抑制因子及信號通路之間嚴(yán)格控制的平衡和相互作用來調(diào)節(jié)的，是一個復(fù)雜的空間互作系統(tǒng)［4-6］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類存在于真核生物中長度大于200 nt、無長閱讀框，但具有帽子結(jié)構(gòu)和poly A尾巴的RNA分子［7-8］。在整個基因組中存在普遍的轉(zhuǎn)錄調(diào)控現(xiàn)象，涉及表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等生命活動，已成為遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。大量研究表明，lncRNA在皮膚毛囊發(fā)育過程中充當(dāng)重要角色，參與調(diào)控毛囊及毛發(fā)纖維生長相關(guān)基因的表達(dá)；且與毛囊發(fā)育和周期性變化密切相關(guān)，可通過與眾多生長因子和信號通路相互作用來發(fā)揮其生物學(xué)功能。本文綜述了近年來lncRNA在哺乳動物毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長發(fā)育和周期性變化過程中的調(diào)控作用，以及通過與其他調(diào)控因子和信號通路之間的互作對毛囊及毛發(fā)生長的影響，為經(jīng)濟(jì)動物毛品質(zhì)的提高和研究哺乳動物毛囊生長相關(guān)lncRNA的作用及調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 lncRNA的發(fā)現(xiàn)、分布及生物學(xué)功能

lncRNA是一類最早在鼠全長cDNA的高通量測序中發(fā)現(xiàn)的長度超過200 nt的RNA分子，自身不編碼蛋白［10-13］。最初由于lncRNA不編碼蛋白質(zhì)，被認(rèn)為不具備生物學(xué)功能，視其為“轉(zhuǎn)錄噪音”［14-15］。之后的研究表明，lncRNA參與X染色體沉默、染色體修飾和基因組修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過程，對其調(diào)控機(jī)制的研究越來越廣泛［16］。目前l(fā)ncRNA在全基因組水平上的研究已經(jīng)涉及動植物、真菌、原核生物，甚至病毒［17］?；诨蚪M中l(wèi)ncRNA的方向和位置，可分為不同的亞型：基因間（Intergenic）、內(nèi)含子（Intronic）、反義（Antisense）、重疊（Overlapping）、雙向（Processed）和加工（Transcript）［17-22］。lncRNA 是非編碼 RNA亞型中最大的一類，據(jù)統(tǒng)計，包含人類近30 000種不同的轉(zhuǎn)錄本，是非編碼轉(zhuǎn)錄本的主要組成部分，超過了編碼蛋白RNA；哺乳動物蛋白編碼基因占總RNA的1%，lncRNA占總RNA的比例可達(dá)4%-9%，主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，也有部分存在于細(xì)胞質(zhì)中［16-19，24］。lncRNA 不同于 miRNA，其作用機(jī)制復(fù)雜，可以通過多種不同的方式調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成［19］，這與其復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)和lncRNA所處的位置密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以通過特定的序列以堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因結(jié)合，從而直接或間接的調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯。lncRNA復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)是其生物學(xué)功能和生物過程調(diào)控的中心。目前發(fā)現(xiàn)的大部分lncRNA都具有保守的二級結(jié)構(gòu)及一定的剪切形式和亞細(xì)胞定位［16，25-26］。lncRNA存在于生命的每一個分支中，機(jī)體的復(fù)雜性與非編碼RNA表達(dá)序列的多樣性和相關(guān)性遠(yuǎn)比與蛋白編碼基因的相關(guān)性強(qiáng)得多［27］。其生物學(xué)功能涉及表觀遺傳、mRNA降解和轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、剪切調(diào)控、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和染色體重塑以及參與細(xì)胞分化和發(fā)育模式、疾病發(fā)生、細(xì)胞結(jié)構(gòu)維護(hù)等多種生物學(xué)過程［8，17，28-29］。此外，lncRNA 作為支架、誘餌、信號及引導(dǎo)分子從不同層面通過基因組靶向、順式或反式和反義干擾發(fā)揮作用［30-31］。在哺乳動物基因組中，lncRNA的重要性已引起了研究人員的高度關(guān)注，隨著研究深入，已鑒定的lncRNA數(shù)量快速增加，但仍有很多未知的lncRNA，尤其與毛囊發(fā)育相關(guān)lncRNA的鑒定甚少。

2 哺乳動物毛囊生長發(fā)育

2.1 毛囊發(fā)生及形態(tài)結(jié)構(gòu)

毛囊在哺乳動物整個生命過程中不斷更新，通過激素、神經(jīng)肽和免疫細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用來調(diào)節(jié)毛發(fā)的生長。這種復(fù)雜的相互作用誘導(dǎo)毛囊產(chǎn)生高度角質(zhì)化組織及不同類型的毛發(fā)。根據(jù)毛囊所處位置，其大小和長度也存在一定的差異，但其結(jié)構(gòu)基本相似。毛囊的形成發(fā)生于胚胎階段，主要依賴于真皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞間發(fā)生的一系列信號傳導(dǎo)，真皮產(chǎn)生的初始信號（“第一真皮信號”）誘導(dǎo)胚胎表皮增厚形成基板［32］，毛母質(zhì)細(xì)胞在基板下局部凝結(jié)（真皮凝結(jié)），形成“真皮凝聚物”，真皮凝聚物中產(chǎn)生的“第二真皮信號”和基板之間的信號交換使上皮細(xì)胞增殖分化并向下生長至真皮，最終包裹真皮凝聚物，形成毛乳頭細(xì)胞［33］，在毛乳頭細(xì)胞的刺激下上皮細(xì)胞進(jìn)一步增殖和分化導(dǎo)致內(nèi)根鞘和毛干的形成［34］。毛囊由三個同心閉合的圓柱體結(jié)構(gòu)構(gòu)成，最外層的為外根鞘，外根鞘可以將毛囊的整個結(jié)構(gòu)與真皮層隔開；位于中間的是內(nèi)根鞘，它是決定最內(nèi)層毛干外形及其向體表生長的關(guān)鍵部位，毛干位于該結(jié)構(gòu)的最內(nèi)層，根據(jù)毛囊類型可產(chǎn)生初級毛發(fā)和次級毛發(fā)。毛囊可分為初級毛囊和次生毛囊（次級毛囊），初級毛囊發(fā)生早，其毛球部位較大，毛囊整體結(jié)構(gòu)較粗較長，有汗腺和皮脂腺，毛干有髓質(zhì)，主要生產(chǎn)粗毛；次級毛囊發(fā)生較晚，毛球直徑相對較小，深度淺，主要圍繞初級毛囊分布，沒有汗腺和豎毛肌等完整的附屬結(jié)構(gòu)，毛干無髓質(zhì)，多產(chǎn)生絨毛［35］。不同物種或同一物種不同部位的毛囊發(fā)育及其毛囊密度也存在一定的差異，如美利奴羊個體毛囊密度可達(dá)107-108個，而人的只有500萬個［36］。

2.2 毛囊的周期性生長

毛囊的周期性生長發(fā)育是其最為重要的特征，這種周期性的模式形成是由上皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞之間的分子和細(xì)胞交流產(chǎn)生的結(jié)果［37］，變化主要集中在毛囊底部的毛乳頭形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變以及新毛干的產(chǎn)生和舊毛干的脫落。哺乳動物的毛囊生長周期一般經(jīng)歷三個階段，即生長期、退行期和休止期。

2.2.1 生長期 生長期是毛囊生長最活躍的階段［38］，也是牛、羊等大部分哺乳動物周期經(jīng)歷最長的一個階段，在此階段，毛囊凸出區(qū)域的干細(xì)胞迅速增殖，毛囊根部的毛乳頭不斷增大并開始向皮膚深處生長，此時毛母質(zhì)細(xì)胞由于受到毛乳頭的調(diào)控快速增殖分化出新的毛干和內(nèi)根鞘［39］。對于有色毛發(fā)來說生長期是黑色素生成階段。不同部位的毛囊產(chǎn)生的毛發(fā)長短不一，其長度與生長期的持續(xù)時間成正比。如人的頭皮毛囊生長期通常持續(xù)2-8年，產(chǎn)生長毛；而眉毛及睫毛等毛囊生長期只維持2-3個月，因此產(chǎn)生短毛［40］。

2.2.2 退行期 退行期是毛囊從生長期過渡到休止期的一個動態(tài)變化過程，此時隨著毛母質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少，毛干和內(nèi)根鞘分化速度減慢，毛球和外根鞘開始凋亡，毛乳頭細(xì)胞處于縮聚狀態(tài)，毛囊變小，開始從真皮乳頭脫落。

2.2.3 休止期 在休止期，細(xì)胞終止凋亡，此時的毛囊活動基本處于休眠狀態(tài)［36］。毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)及循環(huán)周期見圖1。

圖1 毛囊組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及循環(huán)周期（改自Zhang等［58］）

毛囊的生長周期因毛囊類型（初級和次級）、部位和動物種類的不同而不同。在人毛囊發(fā)育周期中各個部位生長期存在顯著差異，例如，頭發(fā)生長期可持續(xù)2-8年，而眉毛生長期只維持2-3個月［40］。美利奴細(xì)毛羊生長期可維持2年或更久，其毛囊發(fā)育長時間處于生長期，幾乎沒有毛囊循環(huán)周期。但其馴化品種，威爾特郡羊毛囊生長周期表現(xiàn)出季節(jié)性，有明顯的周期性［40］。絨山羊生長期持續(xù)不及6個月［41］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，絨山羊（遼寧絨山羊、河西絨山羊、內(nèi)蒙古阿爾巴斯絨山羊等）、細(xì)毛羊（敖漢細(xì)毛羊、甘肅高山細(xì)毛羊等）等品種初級毛囊周期性發(fā)育不明顯，沒有明顯的界限；而次級毛囊發(fā)育呈周期性，周期通常為一年［42-46］。小鼠、兔子、豚鼠的毛囊發(fā)育經(jīng)歷生長、退化，靜止階段，呈波浪式生長［47］，而人和羊毛囊循環(huán)則貫穿一生［35］。雪兔的毛囊不同于鼠、羊等物種，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，為多級復(fù)合毛囊，初級毛囊和次級毛囊發(fā)生和生長周期不同步，其毛色變化隨季節(jié)性改變，一年可經(jīng)歷兩次毛囊生長周期［48-52］。賈志海等［53］和 Mitchell等［54］研究認(rèn)為短光周期和褪黑激素處理可顯著提高山羊絨的產(chǎn)量，而山羊粗毛不依賴光照和褪黑激素的影響。表明山羊次級毛囊生長周期依賴于季節(jié)性，同時研究發(fā)現(xiàn)褪黑激素可延長毛囊生長期早期，使毛囊從休止期快速進(jìn)入生長初期，延長整個毛囊發(fā)育生長期［55-57］。

3 lncRNA在毛囊發(fā)育中的作用

3.1 皮膚毛囊生長發(fā)育相關(guān)lncRNA的鑒定

研究表明，真皮乳頭細(xì)胞中部分lncRNA參與了毛發(fā)相關(guān)基因調(diào)控［59］，在真皮乳頭的形成、毛囊的增殖和分化、真皮凝聚物和毛囊基板的形成中發(fā)揮重要作用，尤其是在次級毛囊的生長階段扮演重要角色［26，60-61］。郭楊等［62-63］在羊絨周期性生長特異性lncRNAs的篩選中發(fā)現(xiàn)，生長期和休止期有6 127個lncRNAs表達(dá)，其中54個表達(dá)存在顯著差異（上調(diào)32個，下調(diào)22個），對差異表達(dá)的lnc5479進(jìn)行靶向敲除發(fā)現(xiàn)與毛囊的生長期密切相關(guān)，并且參與角蛋白的形成。Nie等［64］研究lncRNAs和miRNA在綿羊胎兒皮膚初級毛囊誘導(dǎo)中的作用時，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的lncRNA中36個上調(diào)、26個下調(diào)，下調(diào)的lncRNA與角蛋白（KRT 14和KRT 15）、BMP信號（SOSTDC 1）、WNT信號（WNT 16和SFRP 1）和層粘連蛋白（LAMA 1）相互作用，主要影響表皮和羊毛基板的發(fā)育。Bai等［65］對絨山羊次級毛囊休止期和生長期之間轉(zhuǎn)錄模式的研究中發(fā)現(xiàn)了13個差異表達(dá)的lncRNAs，其中6個（lnc RNA-599618，-599556，-599554，-599547，-599531和-599509）在生長期上調(diào)，4個（lncRNA-599528，-599518，-599511和-599497）在休止期上調(diào)。Zhou等［37］運(yùn)用多組學(xué)的方法對生長期、退行期兩個時期的絨山羊皮膚組織進(jìn)行研究，構(gòu)建了6個lncRNA文庫和6個 miRNA 文庫，鑒定出1122個已知的和403個新的 lncRNA，其中173個在生長期和退行期表達(dá)存在差異，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) miR-873 和lncRNA-108635596 在毛囊的周期性生長過程中具有協(xié)同作用，退行期誘導(dǎo)因子（TGFβ1和BDNF）在lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中受到miR-873和lnc-108635596的調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)豐富了絨山羊和其他哺乳動物中 lncRNA 的內(nèi)容，更有助于理解lncRNA在毛囊生長和退化階段的分子調(diào)控機(jī)制，同時也為進(jìn)一步闡明 lncRNA在絨山羊次級毛囊和羊絨纖維生長發(fā)育中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。Yue等［29］通過測序分析lncRNA和編碼RNA在綿羊皮膚中的作用，發(fā)現(xiàn)只有WNT2和FGF20在Wnt、SHH、Notch、BMP信號途徑中存在顯著差異，同時在綿羊皮膚表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)了884個新的lncRNA。進(jìn)一步研究表明差異表達(dá)的lncRNA_XLOC002437和靶基因COL6A6之間可能通過正反饋調(diào)節(jié)和減少VIα6在皮膚中的沉積，來抑制皮膚纖維化并促進(jìn)基板的形成和沉積。推測這些差異表達(dá)的關(guān)鍵基因和lncRNA為調(diào)控毛囊發(fā)育起始階段潛在候選基因。Zheng等［66］通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析，從絨山羊次級毛囊中鑒定出lncRNA-000133，進(jìn)一步研究分析表明，lncRNA-000133影響真皮乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)特性，此外，lncRNA-000133在絨山羊次級毛囊生長期表達(dá)水平顯著高于休止期，說明lncRNA-000133可能參與次級毛囊的發(fā)生及羊絨纖維的形成和生長。

3.2 lncRNA調(diào)控動物毛囊發(fā)育

lncRNA 的作用方式多種多樣，但目前研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)毛囊發(fā)育的lncRNA 大部分集中在調(diào)控相關(guān)信號通路、相關(guān)基因的甲基化水平及調(diào)控褪黑激素介導(dǎo)毛囊發(fā)育等方面。在人類和小鼠上研究表明，Wnt信號通路在維持毛囊誘導(dǎo)能力和形成新發(fā)纖維方面起關(guān)鍵作用［67-68］。同時，Wnt信號通路的抑制將會導(dǎo)致毛囊結(jié)構(gòu)維持受損［68］。Wnt抑制因子-1（WIF-1）是Wnt的關(guān)鍵拮抗劑，也是真皮凝聚的標(biāo)志物［69-70］，可負(fù)調(diào)控毛囊的生長發(fā)育。Kim等［71］研究發(fā)現(xiàn)，WIF-1基因啟動子區(qū)甲基化影響WIF-1 mRNA和蛋白水平的下調(diào)，認(rèn)為這是激活Wnt /β-catenin途徑的重要機(jī)制。此外，HOTAIR通過在啟動子區(qū)域促進(jìn)組蛋白H3K27發(fā)生甲基化，然后激活Wnt /β-catenin信號直接降低WIF-1表達(dá)［72］。Lin等［73］通過 lncRNA 微陣列研究表明Wnt途徑中一些差異表達(dá)的lncRNA可能通過表觀遺傳修飾來調(diào)節(jié)WIF-1和BMP，從而抑制毛乳頭細(xì)胞中的Wnt信號傳導(dǎo)，降低毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)毛囊重建的能力。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-000133［66］、lncRNA-H19［74］、lncRNA-HOTAIR［75］在絨山羊毛囊發(fā)育生長期的表達(dá)水平顯著高于休止期，結(jié)合啟動子甲基化分析表明，休止期lncRNA-H19、lncRNAHOTAIR、lncRNA-000133這三個基因啟動子區(qū)的高度甲基化可能參與了絨山羊次級毛囊的表達(dá)抑制。Jin等［76］使用RNA-Seq分析褪黑激素處理的遼寧絨山羊成纖維細(xì)胞中l(wèi)ncRNA和mRNA差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)，褪黑激素可通過調(diào)節(jié)lncRNAMTC表達(dá)促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，當(dāng)lncRNAMTC過表達(dá)時，它刺激具有相同作用的NF-κB信號通路。因此，褪黑激素通過促進(jìn)lncRNAMTC表達(dá)來激活NF-κB信號通路，從而控制毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長。同樣，Ge等［77］對體外培養(yǎng)的絨山羊次級毛囊干細(xì)胞進(jìn)行褪黑激素處理并進(jìn)行l(wèi)ncRNA測序，發(fā)現(xiàn)褪黑素的介導(dǎo)可引起lncRNA TCONS_00255106轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，lncRNA TCONS_00206163轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，其各自的靶基因COL4A2和THBS2是參與褪黑素調(diào)節(jié)山羊毛囊發(fā)育的潛在調(diào)節(jié)因子，說明lncRNA TCONS_00255106、lncRNA TCONS_00206163通過褪黑激素介導(dǎo)調(diào)控其靶基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)山羊毛囊發(fā)育。此外，王俊永等［78］和劉善博［79］等對細(xì)毛羊次級毛囊誘導(dǎo)期的差異lncRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測和鑒定發(fā)現(xiàn)，lncRNA也可能通過NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）、利什曼病信號通路（Leishmaniasis）、NF-kappa B信號通路（NF-kappa B signaling pathway）參與調(diào)控細(xì)毛羊毛囊形態(tài)發(fā)生及發(fā)育周期。

4 總結(jié)與展望

被毛作為牛羊等哺乳動物重要的經(jīng)濟(jì)性狀，具有潛在的研究價值，而毛囊作為產(chǎn)生毛發(fā)的主要器官，是皮膚的重要附屬物，大多數(shù)牛羊品種一生中要經(jīng)歷生長期，退行期，休止期轉(zhuǎn)變。在這種周期性活動中，不同的影響因子之間組成一個龐大而又復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它們之間通過相互抑制或協(xié)同，參與毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化及周期性生長。近年來，lncRNA作為潛在和關(guān)鍵的生物調(diào)節(jié)層受到廣泛關(guān)注，參與毛囊的產(chǎn)生、形態(tài)變化以及周期性循環(huán)，目前對于lncRNA在毛囊發(fā)育及毛發(fā)生長相關(guān)的研究主要集中在相關(guān)lncRNA的篩選、鑒定等方面，但對其作用機(jī)制的研究仍不明確。隨著分子技術(shù)和基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，更加深入、準(zhǔn)確的揭示毛囊周期性生長的分子機(jī)制已經(jīng)志在必得，也為家畜育種工作和經(jīng)濟(jì)動物毛品質(zhì)的提高提供新的研究方向和思路。