豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白多克隆抗體的制備及鑒定

歐云文 代軍飛 馬炳 張杰 鄧輝祥 李瀟 張欣明

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730046；2. 開江縣動物疫病預(yù)防控制中心，達(dá)州 636250）

豬 圓 環(huán) 病 毒 2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）屬于無囊膜的、單股、環(huán)狀、負(fù)鏈 DNA病毒，是已知最小的動物病毒之一，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、皮炎和腎病綜合征（PNDS）的主要病原［1］。豬感染PCV2后，機(jī)體發(fā)生免疫抑制，進(jìn)而出現(xiàn)免疫缺陷，淋巴細(xì)胞缺失，以及淋巴組織中巨噬細(xì)胞浸潤等與PMWS相關(guān)的病理特征，主要在呼吸、泌尿、腸道、淋巴、心血管、神經(jīng)、生殖和被膜系統(tǒng)上表現(xiàn)出臨床癥狀［2-3］。PCV主要分為3個(gè)基因型，即PCV1、PCV2和PCV3。有研究表明，PCV1與PCV2基因序列的同源性小于80%，但是PCV1毒株間基因序列的同源性大于99%，PCV2毒株間基因序列的同源性大于96%。2016年，美國學(xué)者Phan等［4］首次從豬心臟等樣品中分離出 PCV3，通過宏基因組測序發(fā)現(xiàn)其為一種先前未知的新型豬圓環(huán)病毒（即豬圓環(huán)病毒3型，PCV3）。PCV2作為豬圓環(huán)病毒家族中非常重要的成員，也是豬群中最常見的豬圓環(huán)病毒基因型，于1991年在加拿大首次被發(fā)現(xiàn)［1］。在臨床病例中，PCV2常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬偽狂犬病毒（PRV）等繁殖障礙性病原混合感染，出現(xiàn)母豬流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎等臨床癥狀，嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)健康發(fā)展［5］。

PCV2為二十面體對稱病毒，基因組大小約為1 760 bp，包括11個(gè)開放性閱讀框（ORFs），其中ORF1和ORF2為兩個(gè)主要的 ORF［6］，ORF1作為PCV2最大的ORF，主要編碼病毒復(fù)制蛋白，即Rep蛋白，不同毒株間ORF1基因編碼蛋白序列的同源性大于86%［7］。ORF3被ORF1所包含，但轉(zhuǎn)錄方向與ORF1相反，其編碼一種誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白［8］。Cap蛋白由ORF2基因編碼，分子量大小約27. 8 kD，由233-234個(gè)氨基酸構(gòu)成，PCV1與PCV2的Cap蛋白同源性較低，而PCV1或PCV2分離毒株間Cap蛋白同源性則較高。Cap蛋白N端富含堿性氨基酸，序列高度保守，前41個(gè)氨基酸是Cap蛋白的核定位信號肽序列，其中第12-18位和第34-41位氨基酸對于Cap蛋白的核定位起著決定性作用。第69-83位和第117-131位氨基酸作為Cap蛋白的兩個(gè)主要特異性抗原表位，其中第117-131位（B-133）表位可作為PCV2感染的血清學(xué)標(biāo)記，用于檢測PCV2抗體效價(jià)。Cap蛋白作為PCV2主要的結(jié)構(gòu)蛋白和免疫相關(guān)蛋白，在PCV2的感染和機(jī)體免疫過程中起著重要作用［9-10］。鑒于此，Cap蛋白常作為PCV2的靶蛋白應(yīng)用于疫苗和診斷方法的研究［11-13］。有學(xué)者采用原核表達(dá)PCV2重組Cap蛋白，并以純化后重組Cap蛋白為免疫原五次免疫產(chǎn)蛋雞，制備抗Cap蛋白的多克隆抗體IgY，研制PCV2 Cap蛋白檢測試劑盒［14］。本研究以豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白編碼基因?yàn)閰⒖夹蛄校訮CV2毒株（CAU0673）基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行Cap蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，Ni-NTA樹脂親和層析純化和復(fù)性；復(fù)性后的重組Cap蛋白與弗氏佐劑混勻乳化，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射4次，免疫新西蘭大耳白兔，制備兔抗Cap蛋白多克隆抗體，為PCV2抗體檢測方法的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pET30a（+）載體購于Novagen公司；Ni-NTA樹脂購于QIAGEN公司；PCV2毒株（CAU0673）、PCV2陽性豬血清購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；Trans109和BL21（DE3）感受態(tài)由家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室抗體工程課題組保存；DNA Marker、蛋白Marker、BamH I和XhoI限制性酶購于寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒和PCR清潔試劑盒購于AxyPrep公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖甘（IPTG）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記兔抗豬IgG、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG購于SIGMA公司；蛋白胨、酵母提取物購于OXOID公司；卡那霉素購于Hyclone公司；豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗分別購于上海海利生物技術(shù)股份有限公司、普萊柯生物工程股份有限公司；普通級新西蘭大白兔購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 pET30a-PCV2-Cap重組載體的構(gòu)建與鑒定以Cap蛋白編碼基因?yàn)閰⒖夹蛄校℅enBank：DQ-235696），進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。上游引物P1：5'-CGCGG ATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTC-3'，劃下橫線處為BamH I限制性酶切位點(diǎn)；下游引物P2：5'-CCGCTCGAGTCTTAGGGTTAAGTGGGGGGTCT TT-3'，劃下橫線處為XhoI限制性酶切位點(diǎn)，引物由Invitrogen（上海）公司合成。以PCV2毒株（CAU0673）基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增，獲取目的基因片段。采用BamH I和XhoI雙酶切pET30a（+）載體和DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4酶16℃連接18 h，將成功構(gòu)建的pET30a-PCV2-Cap重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于卡那霉素抗性的LA平板，37℃培養(yǎng)12 h。挑取單菌落200 r/min搖菌培養(yǎng)，離心收菌，提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR鑒定和BamH I、XhoI雙酶切鑒定，并送GENEWIZ（金唯智）公司測序。

1.2.2 重組Cap蛋白表達(dá)、純化、復(fù)性及鑒定 優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，將鑒定完畢的重組表達(dá)菌接種于LB培養(yǎng)液，在終濃度為1 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，12 000 r/min離心收菌，PBS液懸浮洗滌，300 W超聲破碎，8 000 r/min離心分離裂解液和沉淀，SDS-PAGE電泳分析。采用不同pH值的親和層析液對重組Cap蛋白進(jìn)行Ni-NTA親和層析純化，層析液包括：洗滌緩沖液（pH8.0）、2 mol/L尿素和B緩沖液（pH8.0），將溶解后樣品與Ni- NTA樹脂柱26℃結(jié)合40 min，采用C緩沖液（pH6.3）、D緩沖液（pH5.9）、E緩沖液（pH4.5）洗脫、收集樣品，再采用不同濃度梯度的尿素（即8 mol/L、4 mol/L、2 mol/L、1 mol/L）和PBS液透析復(fù)性純化后的重組Cap蛋白，最后進(jìn)行SDS-PAGE分析。將純化的復(fù)性重組Cap蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，先后進(jìn)行5%脫脂奶粉室溫封閉，PCV2陽性豬血清（稀釋比例為1∶100）室溫?fù)u床孵育，PBST緩沖液洗滌，HRP標(biāo)記兔抗豬IgG（稀釋比例為1∶5 000）室溫?fù)u床孵育，PBST緩沖液洗滌，HRP-DAB底物顯色，暗室中曝光等操作步驟，對重組Cap蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。

1.2.3 多克隆抗體的制備 選取12只健康、大小相近的雄性新西蘭大耳白兔，分為4組，每組3只，分別為PCV2（LG毒株）滅活疫苗組（海利）、PCV2（SH毒株）滅活疫苗組（普萊柯）、PCV2重組Cap蛋白抗原組和陰性對照組（PBS液）。免疫原經(jīng)背部多點(diǎn)皮下注射，按基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫兩個(gè)階段進(jìn)行，海利組、中牧組基礎(chǔ)免疫劑量為0.5豬劑量/只，加強(qiáng)免疫劑量為1頭份/只，總共免疫4次，每次間隔時(shí)間為14 d。重組Cap蛋白組基礎(chǔ)免疫時(shí)，采用重組Cap蛋白與完全弗氏佐劑等體積混勻乳化，免疫劑量為200 μg /只；加強(qiáng)免疫時(shí)，采用重組Cap蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻乳化，免疫劑量為400 μg /只，總共免疫4次，每次間隔時(shí)間為14 d；陰性對照組按照同樣方法進(jìn)行皮下注射（表1）。每次免疫前，耳緣靜脈采血1-2 mL，最后一次加強(qiáng)免疫后7 d，頸動脈放血，3 000 r/min離心分離血清，-20℃保存。

表1 動物分組及免疫程序

1.2.4 多克隆抗體的鑒定

1.2.4.1 反應(yīng)原性鑒定 PCV2全病毒蛋白、重組Cap蛋白和pET30a空載體經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，以制備的Cap蛋白多克隆抗血清（稀釋比例為1∶1 000）作為一抗，以辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（稀釋比例為1∶5 000）作為二抗，進(jìn)行Western blot反應(yīng)，鑒定多克隆抗體的反應(yīng)原性，其他反應(yīng)條件同1.2.2。

1.2.4.2 抗體效價(jià)測定 采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的間接ELISA方法對免疫兔血清抗體效價(jià)進(jìn)行檢測，將重組Cap蛋白以100 mL/孔包被于96孔的聚苯乙烯ELISA板，按照1/200、1/400、1/800、1/1 600、1/3 200、1/6 400、1/1 2 800、1/2 5 600倍比梯度稀釋待檢免疫兔血清，待檢樣品為每試驗(yàn)組免疫后0 d、14 d、28 d、42 d、56 d的兔血清。操作步驟如下：加待檢樣品100 μL/孔，未免疫兔血清為陰性對照，37℃孵育 0.5 h，洗滌液洗板3次；加辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（稀釋比例為1∶7 000）100 μL/孔，37℃孵育 0.5 h，洗滌液洗板3次；加 TMB顯色液100 μL/孔，室溫避光孵育20 min，終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取OD450值，若待檢樣OD450值≥2.1倍陰性對照樣OD450值，則判為是PCV2抗體陽性。

1.2.4.3 間接免疫熒光檢測 將PCV2毒株（CAU0673）接種于單層培養(yǎng)的PK-15細(xì)胞，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，采用4%多聚甲醛4℃固定接毒后的PK-15細(xì)胞30 min，PBS液洗滌3次，5 min/次，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h；分別將四種免疫原制備的多克隆抗血清和非免疫兔血清作為一抗，3%BSA為稀釋液，稀釋比例為1∶100，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，5 min/次；以FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，PBST為稀釋液，稀釋比為1：300，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，5 min/次，最后加PBS覆蓋封片，于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 pET30a-PCV2-Cap重組載體的構(gòu)建結(jié)果

以PCV2毒株（CAU0673）的基因?yàn)槟０?，P1、P2為引物，擴(kuò)增獲得1條大小約702 bp的目的片段，而陰性對照組無目的片段（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符合。構(gòu)建的pET30a-PCV2-Cap重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I、XhoI酶切鑒定，在702 bp和5 422 bp處出現(xiàn)目的基因片段的pET30a（+）載體片段（圖2）。

圖1 PCV2-Cap片段PCR擴(kuò)增

2.2 重組Cap蛋白表達(dá)、純化、復(fù)性及鑒定結(jié)果

重組表達(dá)菌BL21（DE3）在最適宜條件下誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，在34 kD處出現(xiàn)目的條帶，與理論值相一致，同時(shí)發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以包涵體形式存在（圖3）。復(fù)性后重組Cap蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，進(jìn)行Western blot鑒定，試驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，在34 kD處出現(xiàn)特異性的顯色條帶，而pET30a空載體處無特異性條帶。這表明重組Cap蛋白與PCV2陽性豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)，擁有良好的反應(yīng)原性。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

圖3 重組Cap蛋白SDS-PAGE分析

圖4 重組Cap蛋白Western blot分析

2.3 多克隆抗體鑒定結(jié)果

2.3.1 反應(yīng)原性鑒定結(jié)果 Western blot鑒定結(jié)果（圖5）顯示，重組Cap蛋白免疫制備的兔多克隆抗體與PCV2全病毒蛋白、重組Cap蛋白均發(fā)生特異性反應(yīng)，在34 kD處出現(xiàn)特異性目的條帶，而pET30a空載體處無特異性的目的條帶，陰性對照兔血清與PCV2全病毒蛋白、重組Cap蛋白均未發(fā)生特異性反應(yīng)，表明制備的多克隆抗體具有良好的反應(yīng)原性。

圖5 兔抗血清的Western blot分析

2.3.2 抗體效價(jià)檢測結(jié)果 經(jīng)間接ELISA檢測表明，采用重組Cap蛋白制備的多克隆抗體的抗體效價(jià)顯著高于兩種商品化的疫苗組，海利組抗體效價(jià)為1∶3 200，普萊柯組抗體效價(jià)為1∶1 600，而重組Cap蛋白組抗體效價(jià)為1∶12 800（圖6）。

圖6 兔血清的抗體效價(jià)

2.3.3 間接免疫熒光檢測結(jié)果 重組Cap蛋白制備的多克隆抗體與PCV2全病毒抗原發(fā)生特異反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察可見熒光（圖7-B）；而陰性對照組（PBS液作為免疫原）未出現(xiàn)熒光（圖7-A）。

圖7 多克隆抗體的間接免疫熒光檢測

3 討論

PCV2作為目前已知最小的動物病毒，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的重要病原。PCV2編碼的Cap蛋白通過干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）與核轉(zhuǎn)錄因子кB（NF-кB）抑制干擾素，Rep蛋白則通過NF-кB激活干擾素，兩者在調(diào)控方面表現(xiàn)出相反的功能，進(jìn)而影響宿主先天性免疫反應(yīng)［15］。Cap蛋白作為PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，常用于PCV2疫苗和診斷方法的研究。有學(xué)者［16］將缺少N端核定位信號的Cap蛋白基因分成7個(gè)連續(xù)重疊的DNA片段Cap（1-7），采用細(xì)菌展示載體系統(tǒng)（APEx）對Cap蛋白上的抗原表位進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)Cap6是Cap蛋白上的抗原優(yōu)勢區(qū)域，Cap6-2為抗原優(yōu)勢表位，為PCV2血清學(xué)診斷和抗原檢測奠定了基礎(chǔ)。目前，有學(xué)者采用桿狀病毒系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌等對Cap蛋白進(jìn)行表達(dá)研究［17-18］。

本研究通過PCR擴(kuò)增Cap蛋白編碼基因，成功構(gòu)建pET30a-PCV2-Cap重組載體，在BL（DE3）宿主菌中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到大小約為34 kD的重組Cap蛋白，并發(fā)現(xiàn)Cap蛋白以包涵體形式表達(dá)，該存在形式有效避免了重組Cap蛋白被蛋白酶所降解。充分利用載體自帶的His標(biāo)簽，通過Ni-NTA樹脂親和層析純化，得到高純度的目的重組蛋白。重組Cap蛋白與PCV2陽性豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明該重組Cap蛋白具有很好的反應(yīng)原性和特異性。復(fù)性后的重組Cap蛋白與弗氏佐劑混勻乳化，經(jīng)背部多點(diǎn)免疫新西蘭大耳白兔，制備兔抗Cap蛋白多克隆抗體，并同時(shí)采用兩種不同廠家的商品化疫苗進(jìn)行平行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cap蛋白免疫的兔抗血清特異性良好，與PCV2重組Cap蛋白和全病毒抗原均發(fā)生特異性反應(yīng)。重組Cap蛋白組與兩家商品化疫苗組相比，其抗體效價(jià)高，達(dá)到1∶12 800，顯著高于商品化疫苗組。

本研究采用大腸桿菌pET30a（+）表達(dá)載體原核表達(dá)完整的PCV2ORF2基因，得到富含抗原表位的重組Cap蛋白。pET30a（+）載體作為非常成熟的表達(dá)載體，其表達(dá)效率高、易于培養(yǎng)，擁有其他表達(dá)方式不具備的優(yōu)勢。多克隆抗體作為重要的免疫診斷材料，其與單克隆抗體相比有著獨(dú)特的優(yōu)勢，能識別多個(gè)抗原表位，即使少數(shù)幾個(gè)抗原表位被破壞或者抗原構(gòu)象改變，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也不會受到影響，并且制備方法較易、成本較低。兩種商品化疫苗均為滅活疫苗，海利組為PCV2 LG毒株的全病毒滅活疫苗，該毒株為PCV2中國分離株，與我國目前主要流行毒株處在同一亞型，并采用水質(zhì)“海金穩(wěn)”佐劑制備的滅活疫苗；普萊柯組為PCV2專利毒株SH毒株，該疫苗毒株是從臨床癥狀典型的豬群中分離出來的PCV2流行毒株，采用進(jìn)口的W/O/W雙相佐劑制備的滅活疫苗，這或許是兩種免疫原制備的多克隆抗體效價(jià)出現(xiàn)差異的原因。

4 結(jié)論

本研究成功表達(dá)了PCV2 Cap蛋白，并成功制備了兔抗PCV2 Cap蛋白多克隆抗體，為建立PCV2抗體檢測方法和疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。