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    米曲霉功能基因組研究策略和進(jìn)展

    2019-08-08 03:32:10吳琴琴孫敏陳雨付雅琴曾斌賀斌
    生物技術(shù)通報(bào) 2019年8期
    關(guān)鍵詞:基因組研究原生質(zhì)外源

    吳琴琴 孫敏 陳雨 付雅琴 曾斌 賀斌

    (江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南昌 330013)

    米曲霉(Aspergillus oryzae)是我國傳統(tǒng)釀造行業(yè)的優(yōu)良菌種,在醬油釀制、豆豉制作等方面都有著廣泛應(yīng)用[1]。同時(shí),米曲霉又是公認(rèn)的食品安全生產(chǎn)菌株,發(fā)酵及后處理技術(shù)成熟,因此它除了在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中被用于生產(chǎn)醬油、豆豉產(chǎn)品外,還常用于生產(chǎn)初級(jí)、次級(jí)代謝產(chǎn)物及酶類產(chǎn)品,同時(shí)也是基因表達(dá)和蛋白分泌研究的理想對(duì)象[2-3]。

    隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,基因組測(cè)序已經(jīng)變得越來越普遍,相對(duì)于植物和動(dòng)物,真菌基因組小,容易被測(cè)序和注釋,因此成為生物基因組研究的典型例子,為功能基因組、表達(dá)調(diào)控機(jī)理和物種進(jìn)化奠定了理論基礎(chǔ)。2005年,日本26家科研單位利用鳥槍法共同完成了世界首例米曲霉RIB40的基因組測(cè)序工作[4]。米曲霉基因組大小為37 Mb,共8條染色體,包含12 074個(gè)基因。相比構(gòu)巢曲霉和煙曲霉,米曲霉基因組分別比兩者大29%和34%,這些米曲霉特有的基因主要和水解酶分泌、氨基酸代謝和糖類轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。隨后,更多的米曲霉菌株被測(cè)序,截至目前,共有10株米曲霉完成測(cè)序,基因組大小從35.43 Mb到41.16 Mb,GC含量大致為47%-48%(表1)。雖然米曲霉的基因組已經(jīng)被破譯,但是對(duì)米曲霉的功能基因組研究進(jìn)展緩慢,米曲霉 RIB40基因組中預(yù)測(cè)的編碼蛋白基因是12 074個(gè),其中僅有205個(gè)基因功能經(jīng)過驗(yàn)證,占基因總數(shù)的1.7%[5]。究其原因,一是因?yàn)榭捎玫暮Y選標(biāo)記少,米曲霉對(duì)常見的抗生素具有較強(qiáng)的抗性,如氨芐霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)、頭孢霉素(Ca)等,同時(shí)某些合成抗生素的基因可能會(huì)向環(huán)境及其他微生物中轉(zhuǎn)移,而米曲霉又常用于食品生產(chǎn),因此美國FDA已禁止在食品中使用這類標(biāo)記;另外一個(gè)原因是轉(zhuǎn)化子的不穩(wěn)定性,因?yàn)槊浊乖诜敝尺^程中存在多核現(xiàn)象,很難篩選到純化的轉(zhuǎn)化子。

    表1 已完成基因組測(cè)序的米曲霉菌株

    1 米曲霉功能基因組研究方法

    1.1 篩選標(biāo)記

    有效的篩選標(biāo)記是功能基因組研究的基礎(chǔ),它可以降低假陽性率,減少篩選工作量。目前米曲霉轉(zhuǎn)化載體常用的篩選標(biāo)記有抗藥性標(biāo)記和營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因。

    1.1.1 抗藥性標(biāo)記 抗藥性篩選標(biāo)記不要求受體菌具有營養(yǎng)缺陷型,可以作為顯性篩選標(biāo)記,是真菌遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記??顾幮曰蜣D(zhuǎn)入受體菌后,可使受體菌在一定藥物濃度下生長(zhǎng),表現(xiàn)出藥物抗性。潮霉素B抗性基因,如hph,hygr等,是真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中應(yīng)用最為廣泛的抗藥性標(biāo)記。Fernandez等[13]將潮霉素B抗性基因hph作為篩選標(biāo)記,成功構(gòu)建了米曲霉的干擾載體,并抑制了米曲霉與孢子顏色相關(guān)基因wA的表達(dá);郭繼平等[14]將潮霉素B抗性基因(hygr)的置換型打靶載體pHC2,將其線性化后轉(zhuǎn)化米曲霉,成功得到了米曲霉的抗潮霉素菌株。除此以外,博來霉素抗性基因,如ZeoR,也被用作米曲霉遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記。尹燕辰等[15]使用pBC-hygro作為質(zhì)粒骨架,并進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化,成功獲得米曲霉的抗博來霉素菌株,并以此菌株為基礎(chǔ),表達(dá)米曲霉α-淀粉酶同源基因amyB,成功獲得酶活提高106.27%的轉(zhuǎn)化子。由于米曲霉對(duì)多種藥物具有抗性,因此目前報(bào)道的抗藥性篩選標(biāo)記較少,主要有bar、sull、bs、km等。使用抗藥性篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化體系大多都需要使用抗生素,價(jià)格昂貴,且某些合成抗生素的基因可能會(huì)向環(huán)境及其他微生物中轉(zhuǎn)移,而米曲霉又常用于食品生產(chǎn),因此美國FDA已禁止在食品中使用這類標(biāo)記。

    1.1.2 營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記 營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記可以通過轉(zhuǎn)入標(biāo)記基因,從而與受體細(xì)胞突變基因互補(bǔ),從而使受體細(xì)胞可以和野生型一樣的表型。pyrG是米曲霉轉(zhuǎn)化中用的最多的一種營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記,其原理是pyrG編碼的乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶可以將5-氟乳清酸(5-FOA)催化為5-氟乳清苷酸(5-FUMP),而5-FUMP具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,使得野生型菌株在含有5-FOA的平板上不能生長(zhǎng),而pyrG基因突變菌株失去了催化活性,從而可以在含有5-FOA的平板上生長(zhǎng)。Yasuda等[16]以工業(yè)上常用的米曲霉菌株KBN出發(fā),用pyrG作為篩選標(biāo)記,成功構(gòu)建了高效的基因敲除體系。Jun-Ichi等[17]以pyrG基因突變菌株為受體菌,建立了多基因缺失體系,同時(shí)敲除了2個(gè)蛋白酶表達(dá)相關(guān)的基因。Jaewoo等[18]利用該系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了一個(gè)載體敲除多個(gè)基因。我國醬油、豆豉等發(fā)酵過程中大多選用米曲霉3042作為發(fā)酵菌株,該菌株尚未構(gòu)建便于遺傳操作的轉(zhuǎn)化載體,本課題組前期基于RIB40的轉(zhuǎn)化載體,成功構(gòu)建了米曲霉3042菌株的pyrG突變的轉(zhuǎn)化載體,并成功進(jìn)行了轉(zhuǎn)化,為改良菌株性能和提高醬油品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)[19]。除此以外,米曲霉轉(zhuǎn)化常用的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記還有編碼硝酸鹽還原酶的niaD基因,編碼色氨酸生物合成酶的trp基因等。niaD編碼的硝酸鹽還原酶是真菌氮素代謝過程中的關(guān)鍵酶,可使轉(zhuǎn)化子獲得硝酸鹽代謝能力,但niaD功能缺失的突變株能耐受高濃度的氯酸鹽,而野生型則不能;trp基因是色氨酸合成的關(guān)鍵基因,而色氨酸是米曲霉生長(zhǎng)的必需氨基酸之一,trp功能缺失的突變株不能正常合成色氨酸,導(dǎo)致色氨酸營養(yǎng)缺陷,即在色氨酸缺陷培養(yǎng)基內(nèi)不能生長(zhǎng)。營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記獲得的轉(zhuǎn)化子篩選便捷,只需要用基礎(chǔ)培養(yǎng)基來篩選,無需添加抗生素等,同時(shí)可以用于不同真菌之間的轉(zhuǎn)化。但是缺點(diǎn)在于絲狀真菌大多具有多核現(xiàn)象,用這種方法分離純合子比較困難。

    1.2 轉(zhuǎn)化方法

    高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系是米曲霉功能基因組研究的前提,相對(duì)于其他微生物而言,如酵母和大腸桿菌,米曲霉存在著堅(jiān)韌的細(xì)胞壁,所以轉(zhuǎn)化效率低下。為提高遺傳轉(zhuǎn)化效率,現(xiàn)有多種轉(zhuǎn)化方法,主要包括原生質(zhì)體法-PEG/CaCl2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和電擊轉(zhuǎn)化法。

    1.2.1 原生質(zhì)體法-PEG/CaCl2PEG/CaCl2介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是使用較早較普遍的細(xì)胞融合方法。1978年,Hinnen等[20]首先利用聚乙二醇(PEG)作為介質(zhì)成功完成了酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,此后PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法逐漸應(yīng)用于粗糙鏈孢菌(Neurospora crassa)和構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)等,使這一技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用。PEG/CaCl2是以原生質(zhì)體作為感受態(tài)細(xì)胞,將所轉(zhuǎn)化DNA和原生質(zhì)體混合后,在含有一定濃度 CaC12和PEG等堿性環(huán)境下進(jìn)行的。

    PEG是一種能夠促進(jìn)原生質(zhì)體吸收外源DNA的化學(xué)誘導(dǎo)劑,在高pH環(huán)境可以通過電荷間的相互作用與外源DNA形成緊密復(fù)合物,原生質(zhì)體通過內(nèi)吞作用將這些復(fù)合物吸收至細(xì)胞內(nèi),隨后再進(jìn)入細(xì)胞核并整合到受體基因組中[21]。在轉(zhuǎn)化過程中,可用于制備原生質(zhì)體的絲狀真菌出發(fā)材料有多種選擇,如無性孢子、新鮮菌絲體或者擔(dān)孢子[22]。PEG轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)點(diǎn)是受體細(xì)胞數(shù)量大,容易獲得純合型的轉(zhuǎn)化子,效率高、整合度和遺傳性高等,因此原生質(zhì)體融合在米曲霉遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用廣泛[23]。韓志雙等[24]通過PEG/CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體法選育出2株米曲霉酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株。劉肖凱[25]也用該方法敲除了米曲霉4177中Rho GTPase家族中的6個(gè)成員,并獲得了相應(yīng)表型的突變菌株。同時(shí),原生質(zhì)體法也存在一些缺陷,如培養(yǎng)難度大,再生頻率低和周期長(zhǎng),并且價(jià)格昂貴,不易獲得轉(zhuǎn)化體以及轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。

    1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(Agrobacterium tumefaciensmediated transformation,ATMT)是通過根癌農(nóng)桿菌將外源 DNA 轉(zhuǎn)入植物、細(xì)菌和真菌細(xì)胞內(nèi)[26],在1995年Bundock等[27]首次成功進(jìn)行了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)酵母菌的遺傳轉(zhuǎn)化。在此之后,科學(xué)家們相繼對(duì)絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方法加以重視。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)為絲狀真菌功能基因組的研究奠定了基礎(chǔ),遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)比較成熟,很多結(jié)果表明也都成功獲得轉(zhuǎn)化子[28-29],但是由于米曲霉的多耐藥性,因此該方法在米曲霉中的應(yīng)用目前在國內(nèi)尚未見報(bào)道。而在2016年,Nguyen等[30]利用pyrG作為篩選標(biāo)記首次將農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法應(yīng)用在米曲霉中,并與綠色熒光蛋白GFP融合,成功構(gòu)建了米曲霉的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的過表達(dá)體系。隨后,在2017年,該作者通過改造該載體,利用同源重組的原理,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化成功構(gòu)建了米曲霉RIB40的敲除體系[31]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的米曲霉轉(zhuǎn)化體系的確立,克服了原有轉(zhuǎn)化體系操作繁雜、轉(zhuǎn)化效率低、耗時(shí)多等缺點(diǎn),將成為一種主流的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。但本課題組在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化米曲霉時(shí)發(fā)現(xiàn),通過這種方法獲得的轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定,因?yàn)槊浊勾蠖嗑哂卸嗪爽F(xiàn)象,在傳代過程中個(gè)別核很容易丟失,因此很難篩選到純合子。劉雪[22]通過多輪過濾的方式,大大提高了單核孢子的比例。因此,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化篩選轉(zhuǎn)化子時(shí),可以通過多輪富集和篩選的方法,將單核孢子從轉(zhuǎn)化子中篩選出來,本課題組利用膜過濾的方法,將單核孢子的比例從11%提高到30%,提高了純合子篩選概率[19,32]。

    1.2.3 電擊轉(zhuǎn)化法 電擊轉(zhuǎn)化法是將原生質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)膜在高壓脈沖作用下,形成瞬間通道,將外源吸收至細(xì)胞內(nèi)部,由于質(zhì)膜可以進(jìn)行自我修復(fù),從而修復(fù)高電壓脈沖造成的穿孔。雖然電擊轉(zhuǎn)化步驟簡(jiǎn)單,但是轉(zhuǎn)化效率較低。陳鳳等[33]研究表明,在多次電擊轉(zhuǎn)化米曲霉 niaD300時(shí),未將基因成功轉(zhuǎn)進(jìn)米曲霉中。同時(shí),電擊法轉(zhuǎn)化米曲霉價(jià)格昂貴,且轉(zhuǎn)化前還需對(duì)電擊參數(shù)進(jìn)行探索,相對(duì)比較繁瑣,因此電擊轉(zhuǎn)化法在米曲霉功能基因組研究過程中應(yīng)用較少。

    1.3 遺傳操作

    有效的篩選標(biāo)記和高效的轉(zhuǎn)化方法是遺傳操作的前提,也是功能基因組研究的基礎(chǔ)。由于篩選標(biāo)記的限制和轉(zhuǎn)化體系的不成熟,傳統(tǒng)的遺傳操作(如同源重組、誘導(dǎo)突變等),相對(duì)于酵母和構(gòu)巢曲霉,在米曲霉中報(bào)道較少。近年來,CRISPR/Cas9技術(shù)由于其高效性,已經(jīng)快速應(yīng)用在多個(gè)物種當(dāng)中,但是在米曲霉中僅有2篇文獻(xiàn)報(bào)道。2015年,Katayama等在米曲霉中首次建立了CRISPR/Cas9系統(tǒng),并成功敲除了wA,pygG和yA基因,突變率在10%-20%之間[34];隨后該課題組在2018年進(jìn)一步改良了CRISPR/Cas9系統(tǒng),在米曲霉中的敲除效率達(dá)到了50%-100%,并實(shí)現(xiàn)了多基因同步敲除[35]。

    2 米曲霉功能基因組研究進(jìn)展

    2.1 分生孢子

    米曲霉作為形態(tài)結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜的微生物,發(fā)揮著越來越大的應(yīng)用價(jià)值和潛力,它會(huì)在生命周期呈現(xiàn)出不同的生命狀態(tài),米曲霉的分生孢子是由一個(gè)特殊的發(fā)育營養(yǎng)結(jié)構(gòu)而形成的,被稱作菌絲梗[36]。菌絲梗在一定時(shí)期形成基地菌絲體上的足細(xì)胞,然后在生長(zhǎng)發(fā)育成囊泡,囊泡出芽形成瓶梗,接著分生孢子形成在瓶梗表面。在分生孢子的形成過程中受到多個(gè)基因的調(diào)控。brlA基因的激活是曲霉分生孢子形成最基本的步驟,brlA通過控制早期的發(fā)育調(diào)控基因abaA、rodA和yA的表達(dá)調(diào)控分生孢子的表達(dá),使其正常的分化;在中期,BrlA蛋白激活abaA基因,abaA基因與AbaA 結(jié)合,控制著發(fā)育基因的表達(dá);在后期,wetA基因受 AbaA 蛋白誘導(dǎo)激活,brlA、abaA和wetA這三個(gè)基因決定基因激活的順序[37-38]。另外,有研究表明白光可以通過下調(diào)brlA的表達(dá)而抑制分生孢子的產(chǎn)生,這個(gè)現(xiàn)象與其他曲霉屬物種相反[39]。隨著生物信息學(xué)、基因組學(xué)和分子生物學(xué)等的快速發(fā)展,米曲霉產(chǎn)孢機(jī)制及相關(guān)基因的研究將更加深入。

    2.2 蛋白分泌和表達(dá)

    米曲霉作為發(fā)酵工業(yè)重要的菌株,具有強(qiáng)大的蛋白分泌能力。Liu等[40]對(duì)米曲霉基因組通過文獻(xiàn)總結(jié)和生物信息學(xué)分析,共鑒定米曲霉中369個(gè)分泌蛋白,與此同時(shí)還發(fā)現(xiàn)米曲霉相對(duì)于植物和哺乳動(dòng)物具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌、合成能力以及快速生長(zhǎng),易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn),與大腸桿菌和酵母相比也具有強(qiáng)大的翻譯后修飾功能[41]。正是由于米曲霉的這些特點(diǎn),米曲霉異源蛋白的表達(dá),現(xiàn)今成為一個(gè)熱點(diǎn)話題,已有很多方法提高異源蛋白的產(chǎn)量,如提高基因拷貝數(shù)、使用強(qiáng)啟動(dòng)子、基因融合、蛋白酶缺陷株、優(yōu)化培養(yǎng)條件等[42]。Jin等[43]通過UV定向變異和選擇標(biāo)記性基因敲除技術(shù),構(gòu)建了米曲霉的多重營養(yǎng)缺陷型菌株,并通過構(gòu)建酸性蛋白酶PepE和三肽酶TppA雙基因敲除菌株來表達(dá)外源人溶菌酶(Human lysozyme,HLY)基因,使酶產(chǎn)量提高20倍以上。Wang等[44]利用基因重組等技術(shù)獲得突變體菌株 RIII-7,高果糖基轉(zhuǎn)移酶(FTase)活性180 Ug-1是原始菌株的2倍,在發(fā)酵培養(yǎng)中,達(dá)到最大值353 U/g。雖然米曲霉具有強(qiáng)大的蛋白分泌能力,可作為理想的外源蛋白表達(dá)宿主,但由于米曲霉復(fù)雜的蛋白酶系和自噬系統(tǒng),使得外源蛋白的表達(dá)產(chǎn)物難以積累和分泌,另外外源基因在轉(zhuǎn)錄過程中,會(huì)受多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,因此米曲霉蛋白分泌和表達(dá)的分子機(jī)制研究還有待加深,以實(shí)現(xiàn)米曲霉生產(chǎn)外源蛋白的工業(yè)化。

    2.3 次級(jí)代謝產(chǎn)物

    米曲霉不但有較強(qiáng)的分泌蛋白的能力,而且還有豐富的次生代謝產(chǎn)物。聶麗娟[45]在米曲霉中分離得到近20余種化合物,其中包括10余種小分子藥理活性物質(zhì),如抗真菌的Asperfuran,抗高血壓的Mutaaspergillic acid等,也包含一些真菌毒素,如圓弧偶氮酸(Cyclopiazonic acid),曲酸(Kojic acid)等;Marui等[46]通過基因組比較發(fā)現(xiàn),在米曲霉中保留有生產(chǎn)青霉素的基因簇,而且保持非常高度的完整性,但產(chǎn)量極低。通過人為調(diào)控基因的高效表達(dá),使青霉素的產(chǎn)量提高了100倍。另外,雖然米曲霉在基因組上接近黃曲霉,但米曲霉不會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素。Zhang等[47]報(bào)道了米曲霉的黃曲霉毒素生物合成基因簇的同系物,甚至在有利于黃曲霉和寄生曲霉的黃曲霉毒素表達(dá)條件下也不會(huì)表達(dá),其原因是米曲霉缺少aflR基因,正是因?yàn)檫@種特性使得米曲霉可以用在食品工藝上。另外,常用于化妝品和食品加工領(lǐng)域的曲酸也是米曲霉的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物之一。曲酸的合成依賴于米曲霉基因簇上的14個(gè)基因,從AO090113000132到AO090113000145,其中包含3個(gè)關(guān)鍵基因:kojR、kojA和kojT。

    隨著米曲霉功能基因組的迅速發(fā)展,很多研究者利用基因工程和代謝工程來提高米曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。Li等[48]通過過表達(dá)米曲霉脂肪酸去飽和酶基因D9D,發(fā)現(xiàn)米曲霉在提高不飽和脂肪酸含量的同時(shí)也可以提高其耐鹽性。Knuf等[49]敲除了米曲霉中乳酸脫氫酶基因以提高乳酸產(chǎn)量,該工程菌在以淀粉為基質(zhì)的培養(yǎng)基中乳酸產(chǎn)量可達(dá)30 g/L。雖然米曲霉中被鑒定的次級(jí)代謝產(chǎn)物種類在逐漸增加,但是合成這些次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因簇和相關(guān)基因卻報(bào)道甚少。對(duì)于米曲霉發(fā)酵和蛋白分泌上的優(yōu)勢(shì),是否能通過代謝工程用米曲霉大規(guī)模生產(chǎn)藥物先導(dǎo)化合物或者通過基因工程手段提高有用次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量?對(duì)于米曲霉的安全性,在一些特定環(huán)境中米曲霉是否會(huì)產(chǎn)生污染食品的真菌毒素?這些問題都值得重視并且進(jìn)行深入的研究。

    3 展望

    米曲霉作為食品工業(yè)生產(chǎn)的一類重要微生物,主要應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造行業(yè)。同時(shí),米曲霉強(qiáng)大的蛋白分泌能力使其在酶制劑和重組蛋白等行業(yè)也應(yīng)用廣泛,而其豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物使米曲霉具有藥物先導(dǎo)化合物優(yōu)質(zhì)來源的潛力。隨著米曲霉功能基因組學(xué)研究的不斷深入,最終將從分子、進(jìn)化和生產(chǎn)各層面闡述重要基因的生物學(xué)功能,揭示米曲霉蛋白分泌和表達(dá)、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的分子機(jī)理,最終為工業(yè)生產(chǎn)提高效率和質(zhì)量。應(yīng)用基因工程對(duì)米曲霉菌株的改造和代謝工程對(duì)米曲霉發(fā)酵的優(yōu)化,還需要更深入和廣泛的研究:開發(fā)更多的安全篩選標(biāo)記,保證發(fā)酵食品的安全性;多種轉(zhuǎn)化方法相結(jié)合,提高遺傳轉(zhuǎn)化效率;探討不同條件下米曲霉的代謝物變化,提高米曲霉發(fā)酵效率和控制發(fā)酵過程中的真菌毒素;深入研究米曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因簇,開發(fā)藥物前體的新來源。米曲霉功能基因組的研究成果將為提高米曲霉的發(fā)酵效率、保證米曲霉發(fā)酵食品的安全性和擴(kuò)大米曲霉在工業(yè)上的應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ)。

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