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    香菇Y(jié)J-01原生質(zhì)體制備與再生條件的優(yōu)化

    2017-10-19 03:02:28杜雙田田夢媛
    食用菌 2017年5期
    關(guān)鍵詞:原生質(zhì)香菇菌絲

    劉 璐 高 原 杜雙田田夢媛 耿 緣

    (西北農(nóng)林科技大學生命科學學院,陜西楊凌712100)

    我國是香菇生產(chǎn)消費大國,栽培規(guī)模居世界前列,但育種研究滯后。曾采用引種、馴化及雜交方法選育得到并推廣的“武香一號”、冬菇L26、慶科20、Cr系列、“申香8號”等仍難以滿足市場對香菇質(zhì)量與產(chǎn)量的需求,香菇育種與種質(zhì)改良工作迫在眉睫[1-3]。原生質(zhì)體育種可有效縮短育種周期,目前由原生質(zhì)體育種得到并推廣示范栽培的新品種還未見報道,外加香菇菌絲在原生質(zhì)體制備過程中會出現(xiàn)原生質(zhì)體單核化現(xiàn)象[4-5],結(jié)合誘變育種、原生質(zhì)體融合育種可針對性的改良種質(zhì)[6-7],顯著提高香菇的產(chǎn)量、品質(zhì)與抗病性[8-17]。原生質(zhì)體的制備與再生是原生質(zhì)體育種的基礎(chǔ),研究采用通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計對香菇原生質(zhì)體制備的工藝及再生條件進行優(yōu)化,期望為香菇原生質(zhì)體育種工作提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料①香菇菌株:香菇(Lentinus edodes)菌株,編號YJ-01,由西北農(nóng)林科技大學生命科學學院提供。②母種培養(yǎng)基(g/L):木屑150.0(煎汁過濾),馬鈴薯 200.0,葡萄糖 10.0,蔗糖 10.0,蛋白胨 2.0,KH2PO41.0,MgSO40.5,瓊脂粉12.0,H2O 1000.0 mL,(pH5.5)。再生培養(yǎng)基:母種培養(yǎng)基用相應(yīng)穩(wěn)滲劑定容。③穩(wěn)滲劑分別為0.4 mol/L的NaCl、MgSO4、KCl、甘露醇,葡萄糖和蔗糖溶液(pH5.0)。

    主要試劑:酶液用對應(yīng)穩(wěn)滲劑配制酶濃度(W/V)1.0%的蝸牛酶,纖維素酶與混合酶(蝸牛酶∶纖維素酶=1∶1),0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌,現(xiàn)配現(xiàn)用。Cellulase(MP Biomedical)及 Snailase(Wolsen)等 為國產(chǎn)分析純。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 菌絲體培養(yǎng) 菌株活化及擴大培養(yǎng)參考文獻[18]。

    1.2.2 原生質(zhì)體制備與純化 原生質(zhì)體制備與純化方法參考文獻[19]。

    1.2.3 原生質(zhì)體計數(shù) 得到的原生質(zhì)體用穩(wěn)滲劑重懸后,血球計數(shù)板計數(shù),稀釋至108涂布平板。

    原生質(zhì)體產(chǎn)量(個/mL)=每小格平均原生質(zhì)體數(shù)×400×稀釋倍數(shù)×104

    1.2.4 原生質(zhì)體再生 原生質(zhì)體再生參考文獻[20]。

    原生質(zhì)體再生率(%)=[(再生平板菌落數(shù)-CK板菌落數(shù))×稀釋倍數(shù)]/(涂布體積×原生質(zhì)體濃度)×100

    1.2.5 試驗設(shè)計 對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率從以下7個因素進行研究,試驗水平見表1。

    表1 單因素試驗水平

    1.2.6 原生質(zhì)體制備與再生條件優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率為指標,按通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計安排試驗。

    1.3 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計分析采用DPS(Version 7.05),作圖采用Orign 9.0。

    2 結(jié)果與分析

    2.1各單因素對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    2.1.1 不同酶種類對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 圖1顯示,混合酶的酶解效果優(yōu)于單一酶。用混合酶酶解時,原生質(zhì)體產(chǎn)量(5.69×108個/mL)是纖維素酶的4.15倍,蝸牛酶的1.42倍;用混合酶酶解時原生質(zhì)體再生率(0.91%)僅次于蝸牛酶(0.90%),是纖維素酶的2.39倍。這是因為香菇菌絲細胞壁成分復(fù)雜,單一酶不能較好降解細胞壁從而獲得大量的原生質(zhì)體。而蝸牛酶是含有果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種酶的復(fù)合酶,而纖維素酶主要由內(nèi)切或外切β-葡聚糖酶等組成,因此蝸牛酶酶解細胞壁的效果顯著優(yōu)于纖維素酶,但仍不及混合酶的酶解效果。故在后續(xù)的多因素試驗中采用混合酶酶系。

    圖1 不同酶種類對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    2.1.2 酶解溫度對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 圖2顯示,酶解溫度對原生質(zhì)體的產(chǎn)量及其再生率的影響顯著。隨著酶解溫度的升高,原生質(zhì)體產(chǎn)量迅速增加,在酶解溫度為30℃左右時原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最大值,此后隨著酶解溫度的進一步升高,原生質(zhì)體產(chǎn)量急劇下降。從酶解溫度在30℃左右時,原生質(zhì)體的再生率也達到最大值。由回歸方程計算得,29℃酶解,原生質(zhì)體產(chǎn)量最高(4.06×108個/mL);30℃酶解,原生質(zhì)體再生率最高(1.08%)。這是由于酶解溫度影響了酶活,進而影響了原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率。蝸牛酶的最適溫度為30~37℃,纖維素酶的最適溫度在35℃,在適宜溫度下酶活高,細胞壁分解速率快。雖然在35℃左右,混合酶能保持較高的活性,但過高的溫度會打亂香菇菌絲細胞內(nèi)部代謝,破壞細胞膜的穩(wěn)定性,進而導致原生質(zhì)體細胞壁再生困難,所以溫度高于30℃時,原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率圖線均呈現(xiàn)下降的趨勢。

    2.1.3 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響由圖3知,酶解時間小于3 h,有利于提高原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率;酶解時間大于3 h時,原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率均下降。從2 h開始,原生質(zhì)體產(chǎn)量隨酶解時間延長急劇增加,2.5 h之后便緩慢下降。原生質(zhì)體再生率在2~4.5 h先增加再減小。經(jīng)回歸方程計算得,酶解時間3.44 h,原生質(zhì)體產(chǎn)量最高(2.27×108個/mL);酶解時間2.82 h,原生質(zhì)體再生率最高(1.70%)。

    2.1.4 pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 在圖4中,當3≤pH≤4時,原生質(zhì)體產(chǎn)量基本保持不變,再生率為0;4≤pH≤5時,原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率均急劇增加;5≤pH≤7時,原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率逐步減小。經(jīng)回歸方程計算,在pH5.10時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高(2.34×108個/mL),pH5.69時原生質(zhì)體再生率最高(1.86%)。

    圖2 酶解溫度對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    圖3 酶解時間對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    圖4 pH對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    圖5 菌齡對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    由于pH≤5.0時,再生培養(yǎng)基凝固狀態(tài)差,無法倒置培養(yǎng),也無法挑取再生菌落進行下一步試驗,故根據(jù)回歸曲線確定原生質(zhì)體制備過程中穩(wěn)滲劑pH5.0,原生質(zhì)體再生過程中再生培養(yǎng)基的pH5.5。

    2.1.5 菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 圖5顯示,當菌齡小于4 d時,原生質(zhì)體產(chǎn)量隨菌齡延長而增加;菌齡大于4 d時,原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸降低。當菌齡小于6 d時,原生質(zhì)體再生率隨菌齡延長而增加,當菌齡大于6 d時,原生質(zhì)體再生率急劇下降。6日齡菌絲與7日齡菌絲的原生質(zhì)體產(chǎn)量相近,再生率相差大。經(jīng)回歸方程計算可知,菌齡4.1 d時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高(2.01×108個/mL),菌齡5.4 d時原生質(zhì)體再生率最高(2.07%)。

    2.1.6 不同穩(wěn)滲劑對原生質(zhì)體制備產(chǎn)量與再生率的影響 由圖6可知,以甘露醇作為穩(wěn)滲劑,原生質(zhì)體產(chǎn)量最高但再生率低;以MgSO4做為穩(wěn)滲劑,原生質(zhì)體產(chǎn)量(2.74×108個/mL),僅次于甘露醇和葡萄糖,再生率分別為1.73%(MgSO4)和1.60%(葡萄糖),僅次于以蔗糖為穩(wěn)滲劑的再生平板(1.94%)。這是因為在制備原生質(zhì)體時,以MgSO4作為穩(wěn)滲劑,不僅可以維持細胞膜內(nèi)外的滲透壓平衡,同時Mg2+可以與羧基及磷脂質(zhì)交聯(lián),穩(wěn)定細胞膜。然而在原生質(zhì)體再生的過程中,Mg2+等無機鹽離子不足以為細胞提供再生細胞壁所需的能量,同時單糖無法滿足細胞壁再生的物質(zhì)需求。故以最大原生質(zhì)體再生率為目標,確定以MgSO4做制備穩(wěn)滲劑,以蔗糖做再生穩(wěn)滲劑。

    圖6 穩(wěn)滲劑種類對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    2.1.7 穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 由圖7可知,適當濃度的穩(wěn)滲劑有利于提高原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率。以純水為穩(wěn)滲劑作為對照組,此時原生質(zhì)體產(chǎn)量低(4.2×107個/mL),再生率為0。隨穩(wěn)滲劑濃度逐漸提高,原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率均呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢。試驗結(jié)果顯示,低濃度穩(wěn)滲劑(0~0.2 mol/L)對原生質(zhì)體再生率有顯著提高作用,0.2~0.8 mol/L對再生率影響不顯著,再生率在緩慢升高至1.88%后(對應(yīng)穩(wěn)滲劑濃度0.6mol/L)便呈緩慢下降趨勢。由回歸方程計算得,穩(wěn)滲劑濃度0.51 mol/L時原生質(zhì)體產(chǎn)量有最大值(1.85×108個/mL),穩(wěn)滲劑濃度0.34 mol/L時,原生質(zhì)體再生率有最大值(1.97%)。

    2.2 原生質(zhì)體制備及再生條件優(yōu)化

    2.2.1 多因素試驗方案確立 為了優(yōu)化原生質(zhì)體的制備條件與再生條件,根據(jù)2.1中結(jié)果以原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率為指標,兼顧下一步試驗的實施性,最終確定以混合酶(纖維素酶∶蝸牛酶體積比1∶1)作為酶系,選擇pH5.0的MgSO4為原生質(zhì)體制備穩(wěn)滲劑,pH5.5的蔗糖作為原生質(zhì)體再生穩(wěn)滲劑。對另外4個因素酶解時間(X1),酶解溫度(X2),菌齡(X3)和穩(wěn)滲劑濃度(X4)按四因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(1/2實施)安排試驗,試驗因素及水平編碼見表2。

    2.2.2 原生質(zhì)體制備數(shù)學模型的建立與檢驗 依據(jù)表2實施試驗,結(jié)果見表3,方差分析見表4。經(jīng)計算得原生質(zhì)體產(chǎn)量(Y)與各因素(Xi)水平的函數(shù)關(guān)系:

    表2 試驗因素及水平編碼表

    表3 原生質(zhì)體產(chǎn)量試驗結(jié)果

    表4 原生質(zhì)體產(chǎn)量方差分析表

    由表4知:對回歸方程(1)進行失擬性檢驗,F(xiàn)失擬=4.62670<F0.05(5,3)=9.013,可知不失擬。F回歸=5.76012>F0.05(11,8)=3.313,P=0.0047<0.05,模型符合客觀實際。且,達極顯著水平,X2、達顯著水平。剔除方程(1)在α=0.10條件下不顯著項后得:

    2.2.3 單因素對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

    對方程(1)降維得:

    圖7 穩(wěn)滲劑濃度對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    由方程(3)-(6)得圖8。

    由方程(1)知,各因素在試驗范圍內(nèi)對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量影響作用大小依次為:X2>X1>X3>X4。由圖8曲線知,隨酶解時間,酶解溫度,穩(wěn)滲劑濃度以及菌齡的增加,原生質(zhì)體產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢,各供試因素在試驗范圍內(nèi)均有最大值。

    對方程(3)-(6)求極值得:

    經(jīng)計算得:

    X1max=0.27;X2max=-0.85;X3max=0.075;X4max=0.01

    經(jīng)轉(zhuǎn)化公式計算得原生質(zhì)體制備條件:酶解時間(x1)=3.2 h,酶解溫度(x2)=27.9℃,菌齡(x3)=5.1 d,MgSO4穩(wěn)滲劑(x4)=0.5mol/L。即:在pH=5.0,以0.5mol/L MgSO4做穩(wěn)滲劑,對5日齡菌絲在28℃酶解3 h,最適原生質(zhì)體制備(原生質(zhì)體產(chǎn)量2.72×108個/mL)。

    圖8 各編碼水平對香菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

    2.2.4 原生質(zhì)體再生數(shù)學模型建立與檢驗 試驗結(jié)果見表5,方差分析見表6。

    經(jīng)計算得YJ-01原生質(zhì)體再生率與各試驗因素的回歸方程為:

    由方程(7)知,各因素對原生質(zhì)體再生率的影響效果依次為:X4>X1>X3>X2。對結(jié)果進行方差分析,見表6:

    依表6對回歸方程(7)進行失擬性檢驗與擬合分析,F(xiàn)失擬=3.65295<F0.05(5,3)=9.013,不失擬。F回歸=6.03451>F0.0(511,8)=3.313,P=0.0039<0.05,模型符合客觀實際。且,X1、X3、X4、、、X1X3與 X1X4達到顯著水平。剔除方程(7)在α=0.10條件下不顯著項后得:

    表5 原生質(zhì)體再生率試驗結(jié)果

    表6 原生質(zhì)體再生率方差分析表

    由方程(9)-(12)得圖9。

    對方程(9)-(12)求極值得:

    解得:

    圖9 各編碼水平對香菇原生質(zhì)體再生率的影響

    X1max=-0.35;X2max=-0.37;X3max=1.94;X4max=-0.56

    經(jīng)轉(zhuǎn)化公式計算得:x1=2.8 h,x2=29.1℃,x3=7.3 d,x4=0.43 mol/L。即:當無交互作用時,以0.45 mol/L蔗糖做再生平板的穩(wěn)滲劑,對7日齡菌絲在29℃酶解3 h,最適原生質(zhì)體再生(再生率1.36%)。

    2.2.6 交互作用對原生質(zhì)體再生的影響

    2.2.6.1 X1(酶解時間)與X3(菌齡)對香菇原生質(zhì)體再生率的影響

    由表6可見,在0.1顯著水平上,X1X3與X1X4兩個交互項滿足條件。故,X1和X3、X1和X4均存在顯著的交互作用。

    令X2=0,X4=0,將方程(7)降維后得:

    由方程(13)得圖10。

    由圖10可知,Y(原生質(zhì)體的再生率)在供試范圍內(nèi)有最大值,當X1一定時,Y隨X3增加呈先增加再減小的趨勢;當X3一定時,Y均隨X1增加呈先增加再減小的趨勢。

    2.2.6.2 X1(酶解時間)與X4(穩(wěn)滲劑濃度)對香菇原生質(zhì)體再生率的影響

    令X2=0,X3=0,方程(7)降維得:

    由方程(14)得圖11。由圖11可知,Y(原生質(zhì)體的再生率)在供試范圍內(nèi)有最大值,當X1一定時,Y隨X4增加呈先增加再減小的趨勢;當X4一定時,Y均隨X1增加呈先增加再減小的趨勢。

    圖10 X1與X3的交互作用對YJ-01原生質(zhì)體再生的影響

    圖11 X1與X4的交互作用對YJ-01原生質(zhì)體再生的影響

    2.2.6.3 模型優(yōu)化 對方程(7)求極值。

    對其各變量求一階偏導并另其為零,求得模型的極值點:

    解方程組得:

    X1=-0.24;X2=-0.90;X3=1.23;X4=-0.38

    帶入轉(zhuǎn)化公式計算得:x1=2.9 h,x2=27.8℃,x3=6.5 d,x4=0.5 mol/L。即:以0.5 mol/L蔗糖做穩(wěn)滲劑,對6.5日齡菌絲在27.8℃酶解2.9 h,原生質(zhì)體有最大再生率(1.39%)。

    2.2.6.4 驗證試驗 在以優(yōu)化得到的最優(yōu)再生條件下,進行驗證試驗,測得原生質(zhì)體產(chǎn)量分別為2.32×108個/mL,1.79×108個/mL,1.54×108個/mL。原生質(zhì)體再生率再生率分別為1.48%,1.06%,1.88%。與理論值相近,基本符合預(yù)測值。證明該條件具有科學性與穩(wěn)定性。

    3 小結(jié)與討論

    通過以上分析可得如下結(jié)論:

    (1)供試4種因素在一定范圍內(nèi),均可顯著提高YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率。YJ-01原生質(zhì)體最優(yōu)制備條件為:在pH為5.0條件下,以0.5 mol/L MgSO4做穩(wěn)滲劑,對5日齡菌絲在28℃酶解3 h。最優(yōu)再生條件為:在pH為5.5條件下,以0.5 mol/L蔗糖做穩(wěn)滲劑,對6.5日齡菌絲在27.8℃酶解2.9 h。

    (2)原生質(zhì)體產(chǎn)量由酶活與酶解反應(yīng)時間決定,各因素對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響作用依次為:酶解溫度>酶解時間>菌齡>穩(wěn)滲劑濃度。酶解溫度和酶解液pH通過影響酶活來影響原生質(zhì)體產(chǎn)量。在pH4.5~6.0范圍內(nèi),纖維素酶最適溫度為45~55℃,蝸牛酶最適溫度為30~37℃,酶活越高,酶促反應(yīng)越快,相同時間內(nèi)的原生質(zhì)體產(chǎn)量越高。穩(wěn)滲劑濃度是通過影響細胞內(nèi)外滲透平衡而影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量,當穩(wěn)滲劑濃度過低時,原生質(zhì)體吸水膨脹甚至脹破;當穩(wěn)滲劑濃度過高時,原生質(zhì)體失水皺縮。酶種類和酶解時間通過控制酶解反應(yīng)來影響原生質(zhì)體產(chǎn)量,混合酶可針對不同底物進行反應(yīng),因而酶解效果優(yōu)于單一酶,相同酶解時間內(nèi)產(chǎn)生原生質(zhì)體數(shù)量多于單一酶。

    (3)原生質(zhì)體再生率由原生質(zhì)體活性決定,各因素對原生質(zhì)體再生率的影響作用依次為:穩(wěn)滲劑濃度>酶解時間>菌齡>酶解溫度。原生質(zhì)體再生過程中,當穩(wěn)滲劑濃度過低或過高會導致原生質(zhì)體嚴重吸水膨脹或皺縮,此時原生質(zhì)體活性降低,細胞壁再生性能降低,再生率也隨之降低。在酶的最適反應(yīng)條件范圍內(nèi),酶解反應(yīng)較快,混合酶系可針對不同底物進行酶解,酶解時間越長,原生質(zhì)體暴露在酶液中的時間越久,原生質(zhì)膜損傷也相對變大,原生質(zhì)體再生細胞壁的性能減弱,再生率降低。加上香菇菌絲與原生質(zhì)體最適生長溫度為(25±1)℃,過高的酶解溫度雖然會提高酶促反應(yīng)速率,但會降低原生質(zhì)體活性,進而降低影響原生質(zhì)體再生率。原生質(zhì)體再生率與菌齡有關(guān)可能是因為當菌絲過于幼嫩時,酶解后原生質(zhì)體不穩(wěn)定,再生困難,當菌齡過長時,菌絲細胞壁加厚,次生物質(zhì)增多,再生率下降。

    (4)試驗利用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法建立了原生質(zhì)體制備與再生的數(shù)學模型,并對模型優(yōu)化,得到原生質(zhì)體制備再生的較優(yōu)條件,且驗證試驗結(jié)果接近預(yù)測值。試驗所得結(jié)果,與邢振楠的研究結(jié)果[21(]酶解溫度30℃,p H=5.5時原生質(zhì)體產(chǎn)量最佳)接近,但與王鐠的研究結(jié)果[22(]34℃酶解時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高)、李蕤的研究結(jié)果[23(]菌齡6 d,酶解時間3 h,酶解溫度34℃,滲透壓穩(wěn)定劑0.6 mol/L甘露醇最適于原生質(zhì)體制備)、廖漢泉的研究結(jié)果[24(]菌齡5~6 d,以0.8 mol/L甘露醇作為穩(wěn)滲劑,用1.5%溶壁酶液酶解1.5~2 h,所得原生質(zhì)體的產(chǎn)量高達4×107個/mL,此時再生率也較高)存在差異,這可能與菌株及基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同有關(guān)。

    ▲更正 本刊2016年第6期第49頁“食用菌發(fā)酵罐制種技術(shù)”(作者姜固勝、張娣、杜萍、王金賀)的基金項目是黑龍江省教育科學規(guī)劃課題(ZJD1215012)。由于作者投稿時未注明,應(yīng)作者要求本刊現(xiàn)更正說明。

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