• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    香菇Y(jié)J-01原生質(zhì)體制備與再生條件的優(yōu)化

    2017-10-19 03:02:28杜雙田田夢媛
    食用菌 2017年5期
    關(guān)鍵詞:原生質(zhì)香菇菌絲

    劉 璐 高 原 杜雙田田夢媛 耿 緣

    (西北農(nóng)林科技大學生命科學學院,陜西楊凌712100)

    我國是香菇生產(chǎn)消費大國,栽培規(guī)模居世界前列,但育種研究滯后。曾采用引種、馴化及雜交方法選育得到并推廣的“武香一號”、冬菇L26、慶科20、Cr系列、“申香8號”等仍難以滿足市場對香菇質(zhì)量與產(chǎn)量的需求,香菇育種與種質(zhì)改良工作迫在眉睫[1-3]。原生質(zhì)體育種可有效縮短育種周期,目前由原生質(zhì)體育種得到并推廣示范栽培的新品種還未見報道,外加香菇菌絲在原生質(zhì)體制備過程中會出現(xiàn)原生質(zhì)體單核化現(xiàn)象[4-5],結(jié)合誘變育種、原生質(zhì)體融合育種可針對性的改良種質(zhì)[6-7],顯著提高香菇的產(chǎn)量、品質(zhì)與抗病性[8-17]。原生質(zhì)體的制備與再生是原生質(zhì)體育種的基礎(chǔ),研究采用通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計對香菇原生質(zhì)體制備的工藝及再生條件進行優(yōu)化,期望為香菇原生質(zhì)體育種工作提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料①香菇菌株:香菇(Lentinus edodes)菌株,編號YJ-01,由西北農(nóng)林科技大學生命科學學院提供。②母種培養(yǎng)基(g/L):木屑150.0(煎汁過濾),馬鈴薯 200.0,葡萄糖 10.0,蔗糖 10.0,蛋白胨 2.0,KH2PO41.0,MgSO40.5,瓊脂粉12.0,H2O 1000.0 mL,(pH5.5)。再生培養(yǎng)基:母種培養(yǎng)基用相應(yīng)穩(wěn)滲劑定容。③穩(wěn)滲劑分別為0.4 mol/L的NaCl、MgSO4、KCl、甘露醇,葡萄糖和蔗糖溶液(pH5.0)。

    主要試劑:酶液用對應(yīng)穩(wěn)滲劑配制酶濃度(W/V)1.0%的蝸牛酶,纖維素酶與混合酶(蝸牛酶∶纖維素酶=1∶1),0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌,現(xiàn)配現(xiàn)用。Cellulase(MP Biomedical)及 Snailase(Wolsen)等 為國產(chǎn)分析純。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 菌絲體培養(yǎng) 菌株活化及擴大培養(yǎng)參考文獻[18]。

    1.2.2 原生質(zhì)體制備與純化 原生質(zhì)體制備與純化方法參考文獻[19]。

    1.2.3 原生質(zhì)體計數(shù) 得到的原生質(zhì)體用穩(wěn)滲劑重懸后,血球計數(shù)板計數(shù),稀釋至108涂布平板。

    原生質(zhì)體產(chǎn)量(個/mL)=每小格平均原生質(zhì)體數(shù)×400×稀釋倍數(shù)×104

    1.2.4 原生質(zhì)體再生 原生質(zhì)體再生參考文獻[20]。

    原生質(zhì)體再生率(%)=[(再生平板菌落數(shù)-CK板菌落數(shù))×稀釋倍數(shù)]/(涂布體積×原生質(zhì)體濃度)×100

    1.2.5 試驗設(shè)計 對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率從以下7個因素進行研究,試驗水平見表1。

    表1 單因素試驗水平

    1.2.6 原生質(zhì)體制備與再生條件優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率為指標,按通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計安排試驗。

    1.3 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計分析采用DPS(Version 7.05),作圖采用Orign 9.0。

    2 結(jié)果與分析

    2.1各單因素對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    2.1.1 不同酶種類對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 圖1顯示,混合酶的酶解效果優(yōu)于單一酶。用混合酶酶解時,原生質(zhì)體產(chǎn)量(5.69×108個/mL)是纖維素酶的4.15倍,蝸牛酶的1.42倍;用混合酶酶解時原生質(zhì)體再生率(0.91%)僅次于蝸牛酶(0.90%),是纖維素酶的2.39倍。這是因為香菇菌絲細胞壁成分復(fù)雜,單一酶不能較好降解細胞壁從而獲得大量的原生質(zhì)體。而蝸牛酶是含有果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種酶的復(fù)合酶,而纖維素酶主要由內(nèi)切或外切β-葡聚糖酶等組成,因此蝸牛酶酶解細胞壁的效果顯著優(yōu)于纖維素酶,但仍不及混合酶的酶解效果。故在后續(xù)的多因素試驗中采用混合酶酶系。

    圖1 不同酶種類對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    2.1.2 酶解溫度對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 圖2顯示,酶解溫度對原生質(zhì)體的產(chǎn)量及其再生率的影響顯著。隨著酶解溫度的升高,原生質(zhì)體產(chǎn)量迅速增加,在酶解溫度為30℃左右時原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最大值,此后隨著酶解溫度的進一步升高,原生質(zhì)體產(chǎn)量急劇下降。從酶解溫度在30℃左右時,原生質(zhì)體的再生率也達到最大值。由回歸方程計算得,29℃酶解,原生質(zhì)體產(chǎn)量最高(4.06×108個/mL);30℃酶解,原生質(zhì)體再生率最高(1.08%)。這是由于酶解溫度影響了酶活,進而影響了原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率。蝸牛酶的最適溫度為30~37℃,纖維素酶的最適溫度在35℃,在適宜溫度下酶活高,細胞壁分解速率快。雖然在35℃左右,混合酶能保持較高的活性,但過高的溫度會打亂香菇菌絲細胞內(nèi)部代謝,破壞細胞膜的穩(wěn)定性,進而導致原生質(zhì)體細胞壁再生困難,所以溫度高于30℃時,原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率圖線均呈現(xiàn)下降的趨勢。

    2.1.3 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響由圖3知,酶解時間小于3 h,有利于提高原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率;酶解時間大于3 h時,原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率均下降。從2 h開始,原生質(zhì)體產(chǎn)量隨酶解時間延長急劇增加,2.5 h之后便緩慢下降。原生質(zhì)體再生率在2~4.5 h先增加再減小。經(jīng)回歸方程計算得,酶解時間3.44 h,原生質(zhì)體產(chǎn)量最高(2.27×108個/mL);酶解時間2.82 h,原生質(zhì)體再生率最高(1.70%)。

    2.1.4 pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 在圖4中,當3≤pH≤4時,原生質(zhì)體產(chǎn)量基本保持不變,再生率為0;4≤pH≤5時,原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率均急劇增加;5≤pH≤7時,原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率逐步減小。經(jīng)回歸方程計算,在pH5.10時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高(2.34×108個/mL),pH5.69時原生質(zhì)體再生率最高(1.86%)。

    圖2 酶解溫度對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    圖3 酶解時間對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    圖4 pH對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    圖5 菌齡對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    由于pH≤5.0時,再生培養(yǎng)基凝固狀態(tài)差,無法倒置培養(yǎng),也無法挑取再生菌落進行下一步試驗,故根據(jù)回歸曲線確定原生質(zhì)體制備過程中穩(wěn)滲劑pH5.0,原生質(zhì)體再生過程中再生培養(yǎng)基的pH5.5。

    2.1.5 菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 圖5顯示,當菌齡小于4 d時,原生質(zhì)體產(chǎn)量隨菌齡延長而增加;菌齡大于4 d時,原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸降低。當菌齡小于6 d時,原生質(zhì)體再生率隨菌齡延長而增加,當菌齡大于6 d時,原生質(zhì)體再生率急劇下降。6日齡菌絲與7日齡菌絲的原生質(zhì)體產(chǎn)量相近,再生率相差大。經(jīng)回歸方程計算可知,菌齡4.1 d時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高(2.01×108個/mL),菌齡5.4 d時原生質(zhì)體再生率最高(2.07%)。

    2.1.6 不同穩(wěn)滲劑對原生質(zhì)體制備產(chǎn)量與再生率的影響 由圖6可知,以甘露醇作為穩(wěn)滲劑,原生質(zhì)體產(chǎn)量最高但再生率低;以MgSO4做為穩(wěn)滲劑,原生質(zhì)體產(chǎn)量(2.74×108個/mL),僅次于甘露醇和葡萄糖,再生率分別為1.73%(MgSO4)和1.60%(葡萄糖),僅次于以蔗糖為穩(wěn)滲劑的再生平板(1.94%)。這是因為在制備原生質(zhì)體時,以MgSO4作為穩(wěn)滲劑,不僅可以維持細胞膜內(nèi)外的滲透壓平衡,同時Mg2+可以與羧基及磷脂質(zhì)交聯(lián),穩(wěn)定細胞膜。然而在原生質(zhì)體再生的過程中,Mg2+等無機鹽離子不足以為細胞提供再生細胞壁所需的能量,同時單糖無法滿足細胞壁再生的物質(zhì)需求。故以最大原生質(zhì)體再生率為目標,確定以MgSO4做制備穩(wěn)滲劑,以蔗糖做再生穩(wěn)滲劑。

    圖6 穩(wěn)滲劑種類對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    2.1.7 穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響 由圖7可知,適當濃度的穩(wěn)滲劑有利于提高原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率。以純水為穩(wěn)滲劑作為對照組,此時原生質(zhì)體產(chǎn)量低(4.2×107個/mL),再生率為0。隨穩(wěn)滲劑濃度逐漸提高,原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率均呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢。試驗結(jié)果顯示,低濃度穩(wěn)滲劑(0~0.2 mol/L)對原生質(zhì)體再生率有顯著提高作用,0.2~0.8 mol/L對再生率影響不顯著,再生率在緩慢升高至1.88%后(對應(yīng)穩(wěn)滲劑濃度0.6mol/L)便呈緩慢下降趨勢。由回歸方程計算得,穩(wěn)滲劑濃度0.51 mol/L時原生質(zhì)體產(chǎn)量有最大值(1.85×108個/mL),穩(wěn)滲劑濃度0.34 mol/L時,原生質(zhì)體再生率有最大值(1.97%)。

    2.2 原生質(zhì)體制備及再生條件優(yōu)化

    2.2.1 多因素試驗方案確立 為了優(yōu)化原生質(zhì)體的制備條件與再生條件,根據(jù)2.1中結(jié)果以原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率為指標,兼顧下一步試驗的實施性,最終確定以混合酶(纖維素酶∶蝸牛酶體積比1∶1)作為酶系,選擇pH5.0的MgSO4為原生質(zhì)體制備穩(wěn)滲劑,pH5.5的蔗糖作為原生質(zhì)體再生穩(wěn)滲劑。對另外4個因素酶解時間(X1),酶解溫度(X2),菌齡(X3)和穩(wěn)滲劑濃度(X4)按四因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(1/2實施)安排試驗,試驗因素及水平編碼見表2。

    2.2.2 原生質(zhì)體制備數(shù)學模型的建立與檢驗 依據(jù)表2實施試驗,結(jié)果見表3,方差分析見表4。經(jīng)計算得原生質(zhì)體產(chǎn)量(Y)與各因素(Xi)水平的函數(shù)關(guān)系:

    表2 試驗因素及水平編碼表

    表3 原生質(zhì)體產(chǎn)量試驗結(jié)果

    表4 原生質(zhì)體產(chǎn)量方差分析表

    由表4知:對回歸方程(1)進行失擬性檢驗,F(xiàn)失擬=4.62670<F0.05(5,3)=9.013,可知不失擬。F回歸=5.76012>F0.05(11,8)=3.313,P=0.0047<0.05,模型符合客觀實際。且,達極顯著水平,X2、達顯著水平。剔除方程(1)在α=0.10條件下不顯著項后得:

    2.2.3 單因素對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

    對方程(1)降維得:

    圖7 穩(wěn)滲劑濃度對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    由方程(3)-(6)得圖8。

    由方程(1)知,各因素在試驗范圍內(nèi)對YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量影響作用大小依次為:X2>X1>X3>X4。由圖8曲線知,隨酶解時間,酶解溫度,穩(wěn)滲劑濃度以及菌齡的增加,原生質(zhì)體產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢,各供試因素在試驗范圍內(nèi)均有最大值。

    對方程(3)-(6)求極值得:

    經(jīng)計算得:

    X1max=0.27;X2max=-0.85;X3max=0.075;X4max=0.01

    經(jīng)轉(zhuǎn)化公式計算得原生質(zhì)體制備條件:酶解時間(x1)=3.2 h,酶解溫度(x2)=27.9℃,菌齡(x3)=5.1 d,MgSO4穩(wěn)滲劑(x4)=0.5mol/L。即:在pH=5.0,以0.5mol/L MgSO4做穩(wěn)滲劑,對5日齡菌絲在28℃酶解3 h,最適原生質(zhì)體制備(原生質(zhì)體產(chǎn)量2.72×108個/mL)。

    圖8 各編碼水平對香菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

    2.2.4 原生質(zhì)體再生數(shù)學模型建立與檢驗 試驗結(jié)果見表5,方差分析見表6。

    經(jīng)計算得YJ-01原生質(zhì)體再生率與各試驗因素的回歸方程為:

    由方程(7)知,各因素對原生質(zhì)體再生率的影響效果依次為:X4>X1>X3>X2。對結(jié)果進行方差分析,見表6:

    依表6對回歸方程(7)進行失擬性檢驗與擬合分析,F(xiàn)失擬=3.65295<F0.05(5,3)=9.013,不失擬。F回歸=6.03451>F0.0(511,8)=3.313,P=0.0039<0.05,模型符合客觀實際。且,X1、X3、X4、、、X1X3與 X1X4達到顯著水平。剔除方程(7)在α=0.10條件下不顯著項后得:

    表5 原生質(zhì)體再生率試驗結(jié)果

    表6 原生質(zhì)體再生率方差分析表

    由方程(9)-(12)得圖9。

    對方程(9)-(12)求極值得:

    解得:

    圖9 各編碼水平對香菇原生質(zhì)體再生率的影響

    X1max=-0.35;X2max=-0.37;X3max=1.94;X4max=-0.56

    經(jīng)轉(zhuǎn)化公式計算得:x1=2.8 h,x2=29.1℃,x3=7.3 d,x4=0.43 mol/L。即:當無交互作用時,以0.45 mol/L蔗糖做再生平板的穩(wěn)滲劑,對7日齡菌絲在29℃酶解3 h,最適原生質(zhì)體再生(再生率1.36%)。

    2.2.6 交互作用對原生質(zhì)體再生的影響

    2.2.6.1 X1(酶解時間)與X3(菌齡)對香菇原生質(zhì)體再生率的影響

    由表6可見,在0.1顯著水平上,X1X3與X1X4兩個交互項滿足條件。故,X1和X3、X1和X4均存在顯著的交互作用。

    令X2=0,X4=0,將方程(7)降維后得:

    由方程(13)得圖10。

    由圖10可知,Y(原生質(zhì)體的再生率)在供試范圍內(nèi)有最大值,當X1一定時,Y隨X3增加呈先增加再減小的趨勢;當X3一定時,Y均隨X1增加呈先增加再減小的趨勢。

    2.2.6.2 X1(酶解時間)與X4(穩(wěn)滲劑濃度)對香菇原生質(zhì)體再生率的影響

    令X2=0,X3=0,方程(7)降維得:

    由方程(14)得圖11。由圖11可知,Y(原生質(zhì)體的再生率)在供試范圍內(nèi)有最大值,當X1一定時,Y隨X4增加呈先增加再減小的趨勢;當X4一定時,Y均隨X1增加呈先增加再減小的趨勢。

    圖10 X1與X3的交互作用對YJ-01原生質(zhì)體再生的影響

    圖11 X1與X4的交互作用對YJ-01原生質(zhì)體再生的影響

    2.2.6.3 模型優(yōu)化 對方程(7)求極值。

    對其各變量求一階偏導并另其為零,求得模型的極值點:

    解方程組得:

    X1=-0.24;X2=-0.90;X3=1.23;X4=-0.38

    帶入轉(zhuǎn)化公式計算得:x1=2.9 h,x2=27.8℃,x3=6.5 d,x4=0.5 mol/L。即:以0.5 mol/L蔗糖做穩(wěn)滲劑,對6.5日齡菌絲在27.8℃酶解2.9 h,原生質(zhì)體有最大再生率(1.39%)。

    2.2.6.4 驗證試驗 在以優(yōu)化得到的最優(yōu)再生條件下,進行驗證試驗,測得原生質(zhì)體產(chǎn)量分別為2.32×108個/mL,1.79×108個/mL,1.54×108個/mL。原生質(zhì)體再生率再生率分別為1.48%,1.06%,1.88%。與理論值相近,基本符合預(yù)測值。證明該條件具有科學性與穩(wěn)定性。

    3 小結(jié)與討論

    通過以上分析可得如下結(jié)論:

    (1)供試4種因素在一定范圍內(nèi),均可顯著提高YJ-01原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率。YJ-01原生質(zhì)體最優(yōu)制備條件為:在pH為5.0條件下,以0.5 mol/L MgSO4做穩(wěn)滲劑,對5日齡菌絲在28℃酶解3 h。最優(yōu)再生條件為:在pH為5.5條件下,以0.5 mol/L蔗糖做穩(wěn)滲劑,對6.5日齡菌絲在27.8℃酶解2.9 h。

    (2)原生質(zhì)體產(chǎn)量由酶活與酶解反應(yīng)時間決定,各因素對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響作用依次為:酶解溫度>酶解時間>菌齡>穩(wěn)滲劑濃度。酶解溫度和酶解液pH通過影響酶活來影響原生質(zhì)體產(chǎn)量。在pH4.5~6.0范圍內(nèi),纖維素酶最適溫度為45~55℃,蝸牛酶最適溫度為30~37℃,酶活越高,酶促反應(yīng)越快,相同時間內(nèi)的原生質(zhì)體產(chǎn)量越高。穩(wěn)滲劑濃度是通過影響細胞內(nèi)外滲透平衡而影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量,當穩(wěn)滲劑濃度過低時,原生質(zhì)體吸水膨脹甚至脹破;當穩(wěn)滲劑濃度過高時,原生質(zhì)體失水皺縮。酶種類和酶解時間通過控制酶解反應(yīng)來影響原生質(zhì)體產(chǎn)量,混合酶可針對不同底物進行反應(yīng),因而酶解效果優(yōu)于單一酶,相同酶解時間內(nèi)產(chǎn)生原生質(zhì)體數(shù)量多于單一酶。

    (3)原生質(zhì)體再生率由原生質(zhì)體活性決定,各因素對原生質(zhì)體再生率的影響作用依次為:穩(wěn)滲劑濃度>酶解時間>菌齡>酶解溫度。原生質(zhì)體再生過程中,當穩(wěn)滲劑濃度過低或過高會導致原生質(zhì)體嚴重吸水膨脹或皺縮,此時原生質(zhì)體活性降低,細胞壁再生性能降低,再生率也隨之降低。在酶的最適反應(yīng)條件范圍內(nèi),酶解反應(yīng)較快,混合酶系可針對不同底物進行酶解,酶解時間越長,原生質(zhì)體暴露在酶液中的時間越久,原生質(zhì)膜損傷也相對變大,原生質(zhì)體再生細胞壁的性能減弱,再生率降低。加上香菇菌絲與原生質(zhì)體最適生長溫度為(25±1)℃,過高的酶解溫度雖然會提高酶促反應(yīng)速率,但會降低原生質(zhì)體活性,進而降低影響原生質(zhì)體再生率。原生質(zhì)體再生率與菌齡有關(guān)可能是因為當菌絲過于幼嫩時,酶解后原生質(zhì)體不穩(wěn)定,再生困難,當菌齡過長時,菌絲細胞壁加厚,次生物質(zhì)增多,再生率下降。

    (4)試驗利用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法建立了原生質(zhì)體制備與再生的數(shù)學模型,并對模型優(yōu)化,得到原生質(zhì)體制備再生的較優(yōu)條件,且驗證試驗結(jié)果接近預(yù)測值。試驗所得結(jié)果,與邢振楠的研究結(jié)果[21(]酶解溫度30℃,p H=5.5時原生質(zhì)體產(chǎn)量最佳)接近,但與王鐠的研究結(jié)果[22(]34℃酶解時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高)、李蕤的研究結(jié)果[23(]菌齡6 d,酶解時間3 h,酶解溫度34℃,滲透壓穩(wěn)定劑0.6 mol/L甘露醇最適于原生質(zhì)體制備)、廖漢泉的研究結(jié)果[24(]菌齡5~6 d,以0.8 mol/L甘露醇作為穩(wěn)滲劑,用1.5%溶壁酶液酶解1.5~2 h,所得原生質(zhì)體的產(chǎn)量高達4×107個/mL,此時再生率也較高)存在差異,這可能與菌株及基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同有關(guān)。

    ▲更正 本刊2016年第6期第49頁“食用菌發(fā)酵罐制種技術(shù)”(作者姜固勝、張娣、杜萍、王金賀)的基金項目是黑龍江省教育科學規(guī)劃課題(ZJD1215012)。由于作者投稿時未注明,應(yīng)作者要求本刊現(xiàn)更正說明。

    猜你喜歡
    原生質(zhì)香菇菌絲
    Modeling and Verification of a Sentiment Analysis System Using Aspect-Oriented Petri Nets
    羊肚菌母種培養(yǎng)基配方的優(yōu)化研究
    羊肚菌母種培養(yǎng)基配方的優(yōu)化研究
    中國被毛孢三種菌絲形態(tài)的超顯微特征觀察
    香菇接種三招
    甘露醇對低溫下草菇菌絲的保護效應(yīng)研究
    新型抗菌肽菌絲霉素純化工藝研究
    廣東飼料(2016年5期)2016-12-01 03:43:21
    酶法制備黑曲霉原生質(zhì)體的條件
    電擊法介導的人參大片段DNA轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體的研究
    香菇皮炎二例施為
    精品久久久久久久久久免费视频 | 国产亚洲精品一区二区www | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黄色a级毛片大全视频| 91麻豆av在线| 成在线人永久免费视频| 在线永久观看黄色视频| 嫩草影视91久久| xxxhd国产人妻xxx| 性少妇av在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美乱妇无乱码| 精品一品国产午夜福利视频| 不卡av一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲九九香蕉| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 午夜影院日韩av| 精品福利观看| 午夜免费鲁丝| 老司机福利观看| 啦啦啦免费观看视频1| 国产99白浆流出| 女人久久www免费人成看片| 水蜜桃什么品种好| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产精品国产高清国产av | 国产99白浆流出| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 我的亚洲天堂| 99国产精品99久久久久| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 久久久国产精品麻豆| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产免费av片在线观看野外av| tube8黄色片| 国产成人系列免费观看| 国产成人系列免费观看| 无遮挡黄片免费观看| 一进一出抽搐gif免费好疼 | ponron亚洲| 久久人人97超碰香蕉20202| 嫩草影视91久久| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 男人舔女人的私密视频| 亚洲全国av大片| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品综合久久久久久久免费 | 日韩欧美免费精品| а√天堂www在线а√下载 | 咕卡用的链子| 国产精品久久久久成人av| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 狠狠狠狠99中文字幕| 满18在线观看网站| 久久这里只有精品19| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美激情久久久久久爽电影 | 老司机午夜福利在线观看视频| av天堂久久9| 精品一区二区三区av网在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| www.自偷自拍.com| 婷婷成人精品国产| 午夜福利欧美成人| 免费在线观看完整版高清| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 在线天堂中文资源库| 91成年电影在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| √禁漫天堂资源中文www| 正在播放国产对白刺激| 久久影院123| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 一夜夜www| 亚洲黑人精品在线| 国产色视频综合| 久久这里只有精品19| 久久久国产一区二区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 韩国av一区二区三区四区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品1区2区在线观看. | 黄片小视频在线播放| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 性色av乱码一区二区三区2| a级毛片在线看网站| 麻豆国产av国片精品| 十分钟在线观看高清视频www| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 91大片在线观看| 日日夜夜操网爽| 欧美激情久久久久久爽电影 | 黄色视频不卡| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 高清黄色对白视频在线免费看| 老鸭窝网址在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲中文av在线| 国产精品国产av在线观看| 国产xxxxx性猛交| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲精品在线观看二区| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲七黄色美女视频| av福利片在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美乱码精品一区二区三区| xxx96com| 制服人妻中文乱码| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| av国产精品久久久久影院| 女性被躁到高潮视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产成人欧美| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲成人国产一区在线观看| 在线免费观看的www视频| 黄色视频,在线免费观看| 18在线观看网站| 在线av久久热| 啦啦啦在线免费观看视频4| 中文字幕精品免费在线观看视频| 女同久久另类99精品国产91| 三上悠亚av全集在线观看| 91成人精品电影| 黄色女人牲交| www.999成人在线观看| 午夜福利免费观看在线| a级毛片在线看网站| 99精品久久久久人妻精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 首页视频小说图片口味搜索| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲五月色婷婷综合| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产不卡一卡二| 中文字幕人妻丝袜一区二区| www.999成人在线观看| 老司机影院毛片| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久精品成人免费网站| av福利片在线| 少妇的丰满在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 久久ye,这里只有精品| 中文欧美无线码| 亚洲精品一二三| 日本五十路高清| 久久久久久免费高清国产稀缺| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 成人手机av| 亚洲性夜色夜夜综合| 精品视频人人做人人爽| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 在线观看免费日韩欧美大片| 露出奶头的视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看 | 香蕉久久夜色| 国产乱人伦免费视频| 少妇粗大呻吟视频| 国产野战对白在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 91老司机精品| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品亚洲一级av第二区| 韩国精品一区二区三区| 精品国产一区二区三区四区第35| a级片在线免费高清观看视频| 欧美日韩乱码在线| 国产黄色免费在线视频| 欧美日韩一级在线毛片| 精品午夜福利视频在线观看一区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 不卡av一区二区三区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产主播在线观看一区二区| 国产欧美亚洲国产| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美日韩一级在线毛片| 国产男女内射视频| 国产成人免费无遮挡视频| 不卡av一区二区三区| av线在线观看网站| 1024香蕉在线观看| 天堂√8在线中文| 午夜亚洲福利在线播放| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| av一本久久久久| 99久久99久久久精品蜜桃| 老汉色∧v一级毛片| 国产成人系列免费观看| 深夜精品福利| 大型av网站在线播放| 波多野结衣一区麻豆| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产不卡一卡二| 国产精品免费一区二区三区在线 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 91国产中文字幕| 99久久综合精品五月天人人| 91老司机精品| 亚洲国产精品合色在线| 午夜精品国产一区二区电影| 国产又爽黄色视频| 90打野战视频偷拍视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 涩涩av久久男人的天堂| 午夜福利,免费看| 亚洲av成人av| 国产深夜福利视频在线观看| 婷婷成人精品国产| 妹子高潮喷水视频| 精品福利观看| 一级黄色大片毛片| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 成人av一区二区三区在线看| 老司机靠b影院| 18禁观看日本| 好男人电影高清在线观看| 日本五十路高清| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲国产精品sss在线观看 | 成人国语在线视频| 高清av免费在线| 国产精品久久久久成人av| 国产在线一区二区三区精| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 欧美日韩黄片免| av在线播放免费不卡| 久久中文字幕人妻熟女| 国产麻豆69| 又黄又粗又硬又大视频| 国产高清激情床上av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲精品av麻豆狂野| 9热在线视频观看99| 在线视频色国产色| 国产免费现黄频在线看| 国产熟女午夜一区二区三区| av网站在线播放免费| 国产免费男女视频| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 在线观看舔阴道视频| av天堂在线播放| 日本黄色日本黄色录像| 香蕉丝袜av| 三级毛片av免费| 精品一区二区三区av网在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 精品电影一区二区在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲欧美激情综合另类| 精品国产乱子伦一区二区三区| 少妇 在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 国产av精品麻豆| 女警被强在线播放| 久久人妻av系列| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产成人系列免费观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜激情av网站| 国产精品.久久久| 国产亚洲欧美98| 日韩中文字幕欧美一区二区| 日本黄色日本黄色录像| x7x7x7水蜜桃| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产成人精品久久二区二区91| 久久草成人影院| 成人精品一区二区免费| 亚洲少妇的诱惑av| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品熟女少妇八av免费久了| 真人做人爱边吃奶动态| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品二区激情视频| 国产色视频综合| 黄片播放在线免费| 欧美日韩黄片免| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 高清毛片免费观看视频网站 | 欧美日韩乱码在线| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 少妇粗大呻吟视频| 天堂√8在线中文| 欧美日韩福利视频一区二区| 午夜免费鲁丝| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久中文看片网| 1024视频免费在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 日韩大码丰满熟妇| 最近最新中文字幕大全电影3 | 女警被强在线播放| 热re99久久国产66热| 国产真人三级小视频在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产成人精品无人区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产成人系列免费观看| 国产精品 国内视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 嫩草影视91久久| 丝袜美腿诱惑在线| 精品欧美一区二区三区在线| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产主播在线观看一区二区| 高清黄色对白视频在线免费看| 女人被狂操c到高潮| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日韩欧美三级三区| 黄色片一级片一级黄色片| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲少妇的诱惑av| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲精品乱久久久久久| 女性被躁到高潮视频| 在线永久观看黄色视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 精品久久久精品久久久| 国产在线观看jvid| 午夜福利在线观看吧| 十分钟在线观看高清视频www| 制服人妻中文乱码| 国产精品久久久久久精品古装| 成人免费观看视频高清| 香蕉国产在线看| 亚洲成a人片在线一区二区| 免费av中文字幕在线| 中文字幕高清在线视频| av线在线观看网站| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 999久久久精品免费观看国产| 国产三级黄色录像| 很黄的视频免费| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产区一区二久久| av不卡在线播放| 成年动漫av网址| 国产av又大| 色播在线永久视频| av欧美777| 午夜精品久久久久久毛片777| 超碰成人久久| 亚洲av成人av| 91在线观看av| 不卡一级毛片| 天天添夜夜摸| 成人三级做爰电影| 日本黄色视频三级网站网址 | 国产成人免费观看mmmm| 美国免费a级毛片| 亚洲成人国产一区在线观看| 精品久久久久久电影网| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久久久精品人妻al黑| 久久香蕉激情| 一本综合久久免费| av在线播放免费不卡| 国产精品久久视频播放| 精品第一国产精品| 亚洲专区中文字幕在线| 午夜亚洲福利在线播放| √禁漫天堂资源中文www| 日本黄色视频三级网站网址 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品亚洲一级av第二区| 99re6热这里在线精品视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品高清国产在线一区| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美在线一区亚洲| 国产精品一区二区免费欧美| 男人舔女人的私密视频| а√天堂www在线а√下载 | 欧美在线黄色| 国产成人精品无人区| 久久人妻av系列| 午夜精品国产一区二区电影| 69av精品久久久久久| 久久久久久久久免费视频了| 91字幕亚洲| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产成人欧美| 99精国产麻豆久久婷婷| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久国产精品麻豆| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 三上悠亚av全集在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 午夜成年电影在线免费观看| 一区二区三区激情视频| 五月开心婷婷网| 大片电影免费在线观看免费| 久久久精品区二区三区| 91成年电影在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 九色亚洲精品在线播放| 捣出白浆h1v1| 欧美黄色淫秽网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 欧美激情极品国产一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx| 中文亚洲av片在线观看爽 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久国产精品大桥未久av| 午夜成年电影在线免费观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 一级,二级,三级黄色视频| 乱人伦中国视频| avwww免费| 这个男人来自地球电影免费观看| 黄色怎么调成土黄色| 精品亚洲成国产av| 久久精品91无色码中文字幕| 脱女人内裤的视频| 搡老岳熟女国产| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲av片天天在线观看| 在线永久观看黄色视频| 很黄的视频免费| 国产亚洲av高清不卡| 大陆偷拍与自拍| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产深夜福利视频在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 色播在线永久视频| 国产欧美日韩一区二区三| 两人在一起打扑克的视频| 女同久久另类99精品国产91| 免费高清在线观看日韩| av一本久久久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 在线观看午夜福利视频| 男男h啪啪无遮挡| av视频免费观看在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 免费观看a级毛片全部| 欧美不卡视频在线免费观看 | 窝窝影院91人妻| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久99久视频精品免费| 国产精品1区2区在线观看. | a在线观看视频网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲第一青青草原| 亚洲免费av在线视频| 麻豆乱淫一区二区| 欧美色视频一区免费| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲成国产人片在线观看| 黄色 视频免费看| cao死你这个sao货| 真人做人爱边吃奶动态| 国产av一区二区精品久久| 老司机午夜十八禁免费视频| 黄色成人免费大全| 免费高清在线观看日韩| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 天天影视国产精品| 日韩有码中文字幕| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品av久久久久免费| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 搡老岳熟女国产| 一进一出抽搐动态| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 日韩成人在线观看一区二区三区| 成人手机av| 国产乱人伦免费视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 91在线观看av| 亚洲人成77777在线视频| 国产片内射在线| av欧美777| 国产人伦9x9x在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 夜夜躁狠狠躁天天躁| 午夜福利一区二区在线看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美国产精品一级二级三级| 丝瓜视频免费看黄片| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 精品福利观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 9色porny在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 天天影视国产精品| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲精品国产区一区二| 1024视频免费在线观看| 岛国在线观看网站| 亚洲九九香蕉| 看片在线看免费视频| 精品乱码久久久久久99久播| 成人18禁在线播放| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99热网站在线观看| ponron亚洲| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲欧美日韩另类电影网站| av网站免费在线观看视频| 国产精品久久久久成人av| 国产免费现黄频在线看| 我的亚洲天堂| 午夜福利,免费看| 国产片内射在线| av在线播放免费不卡| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 后天国语完整版免费观看| 国产亚洲av高清不卡| 啪啪无遮挡十八禁网站| 99国产精品一区二区三区| 黄色视频,在线免费观看| av国产精品久久久久影院| 午夜福利,免费看| 多毛熟女@视频| 搡老岳熟女国产| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲人成电影观看| 国产亚洲av高清不卡| 国产精品成人在线| 午夜两性在线视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲一区二区三区不卡视频| 91成年电影在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久久久久久免费视频了| 国产欧美日韩一区二区三| 黄色丝袜av网址大全| 国产一区在线观看成人免费| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美在线黄色| 91麻豆av在线| 国产xxxxx性猛交| av网站在线播放免费| 欧美黑人精品巨大| 午夜久久久在线观看| 天天影视国产精品| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 91精品三级在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费 | 成人永久免费在线观看视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品国产国语对白av| 大陆偷拍与自拍| 日韩免费高清中文字幕av| 男女免费视频国产| 手机成人av网站| 麻豆av在线久日| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 老鸭窝网址在线观看| 9热在线视频观看99| 亚洲一码二码三码区别大吗| 热99国产精品久久久久久7| 久久中文字幕一级| 老司机深夜福利视频在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 搡老熟女国产l中国老女人|