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    北冬蟲夏草蟲草素提取工藝研究

    2017-10-19 03:02:40張鳳清劉美善崔林虎玄永男
    食用菌 2017年5期
    關(guān)鍵詞:目篩冬蟲夏草固液

    張鳳清 趙 麗 劉美善 崔林虎 滕 月 玄永男*

    (1長春工業(yè)大學(xué),吉林長春130014;2延邊林業(yè)科學(xué)研究院,吉林延吉133001)

    北冬蟲夏草(Cordyceps militaris),別名蛹蟲草、北蟲草,隸屬于子囊菌亞門,麥角菌科、蟲草屬[1],是蟲草屬的模式種。野生的北冬蟲夏草與冬蟲夏草具有相似的生物活性成分,主要包括蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、麥角甾醇、氨基酸、核苷類物質(zhì)等,功效與冬蟲夏草相似[2-4]。

    冬蟲夏草菌和北冬蟲夏草菌發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì),其中,最著名的就是蛹蟲草菌產(chǎn)生的蟲草素[5],蟲草素具有抗菌、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等多種生物功效,已引起國內(nèi)外專家的極大關(guān)注。目前,已有不少以蟲草素為主的藥品、保健品及化妝品研發(fā)成果,如蟲草素膠囊、用于治療動脈粥樣硬化及抗抑郁的藥物等。而我國由蟲草素合成的治療白血病新藥也已進(jìn)入Ⅰ期臨床階段[6]。試驗選擇桑蠶蛹為培養(yǎng)基質(zhì)栽培得到的北冬蟲夏草進(jìn)行蟲草素提取工藝的研究,以期為進(jìn)一步進(jìn)行蟲草素工業(yè)化提取提供技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 試驗試劑、設(shè)備蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品,(純度>98%)上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。高效液相色譜:Agilent 1200 infinity Series美國Sigma公司。超高壓設(shè)備:HPP600 MPa/30 L,包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司。其他試劑均為分析純。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精確稱取干燥至質(zhì)量恒定蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品4 mg于50 mL容量瓶中,用水溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液,質(zhì)量濃度為80 μg/mL。用超純水分別稀釋成2、5、10、20、40、80 μg/mL的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    1.2.2 樣品前處理 將蟲草原料置于40℃烘干箱中烘干,經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200目篩,精確稱取干燥至質(zhì)量恒定的樣品0.50 g于50 mL離心管中,加入25 mL提取液后超聲提取,提取結(jié)束后將離心管置于20℃、5000 r/min的離心機(jī)中離心10 min,吸取上清液1 mL,經(jīng)0.45 μm水相微孔濾膜過濾后直接注入進(jìn)樣瓶以供分析。

    1.2.3 色譜條件 色譜柱:XBridgeTM C18(4.6 mm×250 mm,51 μm);流動相:以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液(取三氟乙酸600 μL加水配制成600 mL,(2∶98),流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為10 μL,進(jìn)樣方式為自動進(jìn)樣;柱溫為30℃,檢測波長為260 nm。

    1.2.4 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6個不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋振蕩充分混勻,用0.45 μm水相微孔濾膜過濾后直接注入進(jìn)樣瓶。每個進(jìn)樣重復(fù)3次,以蟲草素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,蟲草素均在2~801 μg/mL范圍內(nèi),質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,蟲草素的回歸方程為y=38505x+8952.2,r=0.9993。

    1.2.5 提取方法優(yōu)選

    1.2.5.1 水熱回流法 精密稱取粉碎過60目篩的北冬蟲夏草10 g。置于80℃水浴鍋中提取3次,加水量分別為樣品重的10、8.8倍,提取時間為每次2 h,合并提取液過濾,收集濾液并定容至250 mL。

    1.2.5.2 醇熱回流法 精密稱取粉碎過60目篩的北冬蟲夏草10 g,置于80℃水浴鍋中提取三次,加入75%乙醇量分別為樣品重的10、8.8倍,提取時間為每次2 h,合并提取液過濾,收集濾液并定容至250 mL。

    1.2.5.3 超高壓萃取 精密稱取粉碎過60目篩的北冬蟲夏草10 g,準(zhǔn)確加入250 mL 50%乙醇,密封混勻,300 MPa,5 min。

    1.2.6 提取工藝條件優(yōu)選

    1.2.6.1 單因素試驗 溶劑體積分?jǐn)?shù):分別準(zhǔn)確加入10%,30%,50%,70%,90%體積分?jǐn)?shù)的乙醇500 mL;

    固液比:精確稱定10 g樣品5份,以10、25、50、75、100倍分別加入70%乙醇。

    壓力的選擇:精確稱定10 g樣品5份,分別加入70%乙醇1000 mL。密封混勻,加壓100、200、300、400、500、600 MPa。

    1.2.6.2 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上,按照盡量減少試驗次數(shù)和尋求設(shè)計最優(yōu)的原則,選擇提取壓力(A)、容積體積分?jǐn)?shù)(B)和固液比(C)作為因素,每個因素各取3個水平,正交試驗方案見2.2.4。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同方法提取蟲草素情況比較由表1結(jié)果可知超高壓萃取法的提取率遠(yuǎn)高于其他兩種方法,故選擇超高壓萃取法為提取方法。

    表1 不同提取方法對蟲草素提取率的影響

    2.2 提取工藝條件優(yōu)選

    2.2.1 溶劑體積分?jǐn)?shù)的選擇 隨著乙醇的體積分?jǐn)?shù)逐漸增大,蟲草素隨之升高,而乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時,蟲草素的提取率明顯降低,因此選擇乙醇的最佳體積分?jǐn)?shù)為30%~70%。

    表2 超高壓萃取提取蟲草素的乙醇體積分?jǐn)?shù)

    2.2.2 固液比的選擇 由表3可以看出隨著固液比的增加蟲草素的提取率逐漸增加。但考慮到有效成分提取分離的后處理的工作量以及經(jīng)濟(jì)性,選擇最佳固液比范圍為1∶25~1∶75。

    2.2.3 壓力的選擇 由表4可見隨著提取壓力的提高,提取率逐漸升高,在100~500 MPa時,兩者呈線性正相關(guān)關(guān)系,當(dāng)壓力達(dá)到600 MPa時,提取率有所降低,由此可得最佳壓力為100~500 MPa。

    2.2.4 正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果 結(jié)果表明,各因素對蟲草素提取率影響大小為A=C>B,最佳試驗方案為A3B2C3,即提取壓力500 MPa、容積體積分?jǐn)?shù)為50%,固液比1∶75、提取時間為2 min,追加試驗結(jié)果

    表3 超高壓提取蟲草素的不同固液比

    表4 超高壓提取蟲草素的不同壓力收率比較

    表5 L9(34)正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果

    3 小結(jié)與討論

    最佳提取工藝條件為使用超高壓提取方法,提取壓力500 MPa、容積體積分?jǐn)?shù)為50%,固液比1∶75、提取時間為2 min,提取率達(dá)到5.5 mg/g。

    超高壓技術(shù)在我國還處于起步階段,該技術(shù)在國內(nèi)外主要應(yīng)用于食品業(yè),目的是為了防止食物的微生物污染、延長食品儲藏時間[7]。2004年吉林工業(yè)大學(xué)張守勤等[8]率先將該技術(shù)應(yīng)用于中藥提取,隨后,在黃酮類[9,10]皂苷類[11,12]多糖類[13,14]等的提取中均得到了應(yīng)用,結(jié)果表明其在有效成分提取方面具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢。超高壓提取在常溫下進(jìn)行,該條件有助于對溫度敏感的成分的活性保持,適用范圍廣,提取時間短,一般只需1~20 min;提取效率高,提取產(chǎn)物雜質(zhì)含量少,能夠明顯減少原料中的微生物含量,從而延長存放時間;提取過程中無溶劑的揮發(fā),不會對環(huán)境造成污染,而且提取工藝簡單,機(jī)械化程度高,適宜由實驗室推廣到現(xiàn)代化大生產(chǎn)中[13]。

    試驗以桑蠶蛹北冬蟲夏草為試驗對象,選用超高壓提取方法對蟲草素進(jìn)行提取,全程只需要加壓的階段消耗電能,一次可以處理幾十千克物料,提取時間短,提取率高,是適合蟲草素工業(yè)化提取的綠色環(huán)保節(jié)能的提取工藝。

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