金福菇真菌性病害種類調(diào)查及主要病原菌鑒定

汪 茜 龍艷艷 李冬萍 陳廷速

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西南寧530007）

金福菇（Tricholoma giganteum）是一種正處于開發(fā)中的珍稀食用菌。在真菌分類系統(tǒng)中，金福菇屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科，口蘑屬[1-3]。在非洲、南亞次大陸和我國臺灣、福建、廣東、香港、云南等地均有不同程度的自然分布。金福菇的經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，能為生產(chǎn)者創(chuàng)造較高的經(jīng)濟(jì)效益，具有很大的商業(yè)開發(fā)潛力[4]。因出菇溫度較高，適宜在夏季至秋季間栽培，有利于調(diào)節(jié)鮮菇市場或菇房實(shí)施周年栽培的品種搭配。但在金福菇的生產(chǎn)中，經(jīng)常發(fā)生真菌性病害[5-9]，嚴(yán)重地影響了金福菇的產(chǎn)量和質(zhì)量，甚至顆粒無收，經(jīng)濟(jì)損失很大，成為生產(chǎn)發(fā)展的主要限制因素之一。

目前，國內(nèi)的研究主要集中在引種馴化和栽培管理方面，而對于金福菇病害的研究較少，因而在病害防治上，也缺乏科學(xué)依據(jù)。迫切需要對金福菇的真菌性病害的種類及其形態(tài)特征、為害情況、癥狀等進(jìn)行研究，提出科學(xué)可行的綜合防治措施。為此，筆者對金福菇真菌性病害的種類進(jìn)行了調(diào)查及對主要病原菌進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑（1）病害標(biāo)本：2015年9月-2016年8月從廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所食用菌菌種廠采集染病的金福菇子實(shí)體和污染的菌種袋，共采集病害樣品25份，帶回實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。（2）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，用水定容至1 000 mL。

1.2 病原物的分離及鑒定

1.2.1 病原物的分離 在超凈工作臺內(nèi)，從發(fā)病的菌筒或子實(shí)體上直接挑取霉?fàn)钗镏糜诩佑墟溍顾兀ㄔ谂囵B(yǎng)基中加1%鏈霉素0.3 mL，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30 μg）的PDA培養(yǎng)基平板上，每平板接種6點(diǎn)，平板中央接種1點(diǎn)，周圍等距接種5點(diǎn)。28℃黑暗條件下培養(yǎng)，待菌落長至直徑1.5 cm左右時(shí)，用接種針挑取菌落邊緣，置無菌PDA平板純化培養(yǎng)。使用單孢分離法得到單孢。

1.2.2 致病性測定 按柯赫氏法則接種測定其致病性[10]。

①將供試真菌轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5～7 d，取菌絲生長情況基本一致的部位，用打孔器打成菌片（直徑3 mm左右）。②將報(bào)紙平鋪在保濕盒中，噴水保濕，然后放入試管。將預(yù)先清洗好的子實(shí)體分組放入保濕盒中，以備接種，每組的子實(shí)體菌蓋大小接近。③將打好的菌片貼在子實(shí)體菌蓋上，每株真菌三組重復(fù)。以打好的PDA培養(yǎng)基片貼在子實(shí)體菌蓋上做對照。④接種后每天觀察發(fā)病情況。⑤將發(fā)病子實(shí)體上的致病菌分離純化，看是否與接種菌一致。

1.2.3 病原菌形態(tài)鑒定 對病害標(biāo)本進(jìn)行制片鏡檢或保濕培養(yǎng)后鏡檢，疑難病害和新病害則進(jìn)行分離培養(yǎng)，性狀觀察和接種。純化的菌落在PDA中28℃黑暗條件下培養(yǎng)3～4 d，待長出菌落，切取菌落邊緣2 mm小塊轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基，置于28℃黑暗條件下培養(yǎng)，觀察菌落顏色和形狀等。根據(jù)病菌的培養(yǎng)性狀等特征，參照齊祖同[11]的《中國真菌志》（第五卷·曲霉屬及其相關(guān)有性型）、張中義[12]等的《植物病原真菌學(xué)》、陸家云[13]的《植物病原真菌學(xué)》、魏景超[14]的《真菌鑒定手冊》和文成敬[15]的《中國西南地區(qū)木霉屬分類研究》確定病菌的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原物的鑒定經(jīng)調(diào)查及病原菌鑒定，初步明確了為害金福菇的有曲霉、木霉、青霉等三個(gè)屬的病原菌，其中以曲霉菌的分布最廣，為害最重。

選取普查、分離中出現(xiàn)頻率較高的5種病原菌（3種曲霉，1種木霉，1種青霉），應(yīng)用形態(tài)學(xué)進(jìn)行分類鑒定，結(jié)果3種曲霉病原菌分別被鑒定到種為：黃曲霉原變種、黑曲霉、米曲霉原變種。

2.2 曲霉屬真菌引致的病害

2.2.1 黃曲霉原變種As1（Aspergillusflavus） 癥狀：菌株As1在子實(shí)體上生黃色團(tuán)粒狀霉，組成粗粉粒狀的菌落。

病原：半知菌亞門（Deuteromycotina）絲孢綱（Hyphomycetes）絲 孢 目（Moniliales）叢 梗 孢 科（Moniliaceae）曲霉屬（Aspergillus）。營養(yǎng)體由具橫隔的分枝菌絲構(gòu)成。分生孢子梗是從特化了的厚壁、膨大的足細(xì)胞生出，并略垂直于足細(xì)胞的長軸，不分枝，頂端膨大成球形或棍棒形的頂囊，其表面產(chǎn)生輻射狀單層或雙層的小梗，在小梗頂端串生分生孢子，最后成為不分枝的鏈。分生孢子梗無色，壁粗糙。分生孢子頭輻射狀，半球形、近球形，頂囊燒瓶形，有色。孢子結(jié)構(gòu)一層或兩層排列。分生孢子球形（直徑180～600 μm）、近球形，光滑，明顯比另外的曲霉的分生孢子小。菌落擴(kuò)展慢，黃色，在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)5 d，菌落直徑達(dá)35～40 mm（圖1-4）。

2.2.2 黑曲霉As2（Aspergillus niger） 癥狀：在子實(shí)體上生黑色團(tuán)粒狀霉，組成粗粉粒狀的菌落。

病原：分生孢子頭初為球形至輻射形，直徑130～450 μm，老化后分裂成幾個(gè)圓柱狀結(jié)構(gòu)；孢梗莖初無色，老后黃褐色，壁平滑；頂囊近球形，直徑35～75 μm；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層；分生孢子球形，直徑3.1～5.1 μm，老化后略扁，鑒定為黑曲霉。頂囊球形或近球形，直徑20～50 μm，大型的可達(dá)100 μm，黃褐色；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)兩層排列，常呈褐色至黑色；分生孢子球褐色，初光滑后變粗糙或具細(xì)刺，直徑2.5～4 μm，成鏈狀串生。在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)5 d，菌落直徑達(dá)64～70 mm。（圖5-7）

2.2.3 米曲霉原變種As3（Aspergillus oryzae） 癥狀：在子實(shí)體上生綠色團(tuán)粒狀霉，組成粗粉粒狀的菌落。

病原：菌絲無色，有隔膜和分枝。分生孢子梗從細(xì)胞內(nèi)垂直生出，無分枝和隔膜，頂端膨大成球形或橢圓形，放射狀密生許多先梗。分生孢子梗光滑，黃綠色至深橄欖褐色，孢子頭球形至放射形。分生孢子球形，表面光滑，淡褐色。菌落擴(kuò)展快，綠色，在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)5 d，菌落直徑達(dá)60～70 mm。（圖8-11）

圖1 As1菌株的菌落形態(tài)

圖2 As1菌株的的癥狀

圖3 As1菌株的分生孢子

圖4 As1菌株的分生孢子梗

圖5 As2菌株的菌落形態(tài)

圖6 As2菌株分生孢子

圖7 As2菌株的分生孢子梗

圖8 As3菌株的菌落形態(tài)

圖9 As3菌株的癥狀

圖10 As3菌株的分生孢子

圖11 As3菌株的分生孢子梗

圖12 木霉的菌落形態(tài)

圖13 木霉的癥狀圖

圖14 木霉分生孢子梗及分生孢子

圖15 青霉的菌落形態(tài)

圖16 青霉的癥狀

2.3 木霉屬真菌引致的病害癥狀：子實(shí)體受害后先在菌柄一側(cè)出現(xiàn)微褐色的水漬狀病斑，然后逐漸擴(kuò)展到菌蓋，呈褐色凹陷，出現(xiàn)綠色霉層，最后整個(gè)菇體腐爛。

病原：半知菌亞門（Deuteromycotina）絲孢綱（Hyphomycetes）絲 孢 目（Moniliales）叢 梗 孢 科（Moniliaceae）木霉屬（Trichoderma）。分生孢子梗成對分枝，分枝越到基部越長而形成金字塔形結(jié)構(gòu)，分枝、次級分枝與它們所著生的主軸成90°。著生瓶梗的細(xì)胞與瓶?；康葘捇蛏詫?。瓶梗常2～4個(gè)一組輪生，輪生的瓶梗與著生瓶梗的分枝成90°，分生孢子?；蚍种敹擞袝r(shí)單生；輪生的瓶梗常燒瓶形，中部增大，頂端下劇烈溢縮。輪生體中的終極瓶?；騿紊钠抗３A柱形，中部不顯著膨大，且比輪生體中的瓶梗長。分生孢子光滑，綠色，球形。（圖 12-14）

2.4 青霉屬真菌引致的病害癥狀：為害子實(shí)體，可形成圓形的菌落，外觀略呈粉末狀。隨著分生孢子的大量產(chǎn)生，顏色逐漸由白轉(zhuǎn)變?yōu)榫G或蘭。

病原：半知菌亞門（Deuteromycotina）絲孢綱（Hyphomycetes）絲孢目（Moniliales）曲霉科（Eurotiaceae）青霉屬（Penicillium）。菌絲體無色、淡色，具橫隔。由菌絲上形成直立分生孢子梗，先端呈帚狀分枝，由單輪或兩次到多次分枝系統(tǒng)構(gòu)成，對稱或不對稱，最后一級分枝即為分生孢子小梗。小梗用斷離法產(chǎn)生分生孢子，形成不分枝的鏈。分生孢子球形、橢圓形或短柱形，多呈藍(lán)綠色，有時(shí)無色或呈多種淡的顏色。菌絲質(zhì)地可分為絨狀、絮狀、繩狀或束狀，多為灰綠色，且隨菌落變老而改變。菌落的顏色有綠、黃綠、藍(lán)色等，在菌落外圈常見白色的新生長帶。（圖15-18）

3 小結(jié)與討論

金福菇病害的研究報(bào)道較少，參考文獻(xiàn)少。經(jīng)調(diào)查及病原鑒定，初步明確了金福菇發(fā)生的真菌性病害有曲霉等3個(gè)屬，在金福菇上的病害為國內(nèi)首次報(bào)道。其中，曲霉病是常見的病害。

圖17 青霉的分生孢子

圖18 青霉的分生孢子梗

在真菌的分類鑒定中，長期以來一直以形態(tài)和培養(yǎng)特征為主要依據(jù)，但有些特征受不同的培養(yǎng)條件影響而表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)牟町怺14]，同時(shí)曲霉、青霉大多具有產(chǎn)孢能力強(qiáng)的特征，其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)等的一些細(xì)微特征不易觀察，且許多真菌的形態(tài)特征復(fù)雜難以觀察、或者本身形態(tài)特征相近很難區(qū)分（如木霉）等原因，給真菌的分類鑒定，尤其是種及種級以下的分類鑒定帶來了一定的難度。因此，該病害調(diào)查中分離到的病原菌只有曲霉根據(jù)形態(tài)學(xué)特征鑒定到種，而木霉和青霉都只是鑒定到屬。下一步，應(yīng)通過病原菌在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀以及結(jié)合真菌核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序及序列分析的方法來鑒定真菌病原。