玉米莖腐病生防菌的篩選鑒定及最佳培養(yǎng)條件研究

李宛澤+郭月霞+王忠武

摘要： 以禾谷鐮刀菌為指示菌測(cè)定生物活性，分離自土壤的7個(gè)細(xì)菌菌株對(duì)玉米莖腐病禾谷鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，其抑菌率在46.9%～81.3%。采用生防菌菌懸液，于發(fā)病初期對(duì)莖基部噴霧，生防菌G3田間防效達(dá)78.3%，后對(duì)生防效果最好的G3菌株進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基pH值為8，光照條件為光暗交替，最適合溫度為25 ℃。

關(guān)鍵詞： 玉米莖腐??；篩選；生防菌；培養(yǎng)條件

中圖分類號(hào)： S435.131.4+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0148-02

玉米莖腐病又稱玉米莖基腐病、玉米青枯病等，是世界玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的一種土傳病害。嚴(yán)重者玉米葉片全部黃枯，根壞死，果穗下垂，莖基髓部中空，極易折倒。發(fā)病率一般在10%～20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)75%。通過化學(xué)藥劑防治可以控制種傳或土傳病菌引起的苗期病害，但是對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境造成很大的危害。隨著人們健康和環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，探索和研制高效的、對(duì)人體和生態(tài)環(huán)境無害的生防制劑引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍重視。應(yīng)用生物防治手段防治玉米病害的研究日益受到重視。本試驗(yàn)對(duì)該病的生物防治技術(shù)進(jìn)行了初步研究，通過對(duì)病株根際土壤樣品的篩選獲得有效控制玉米莖腐病的生防菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)玉米品種為感病品種黃早4，試驗(yàn)對(duì)照化學(xué)藥劑為20%?！た丝蓾裥苑蹌?。

1.2 供試病原菌

玉米莖腐病禾谷類鐮刀菌，由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 生防細(xì)菌的分離

采自吉林市郊區(qū)以往莖腐病發(fā)病農(nóng)田的根際土樣52份，用NA培養(yǎng)基稀釋分離，共分離菌株107株，將分離到的菌株編號(hào)保存。

1.4 生防菌抑菌效果測(cè)定

將PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)好的的供選生防菌，挑1環(huán)用無菌水稀釋至108倍，取2 mL和25 mL的NA培養(yǎng)基混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中制成帶毒培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)基凝固后，在每個(gè)平板中接入1個(gè)供試菌菌餅（直徑為7 mm），使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，以水與 PDA培養(yǎng)基混合的平板為對(duì)照，每個(gè)處理 3 次重復(fù)，25 ℃下培養(yǎng)4～7 d后，用十字交叉法測(cè)定供試菌生長(zhǎng)直徑，計(jì)算抑制率直徑。

1.5 生防菌株田間防效小區(qū)試驗(yàn)

成株期傷莖根埋法接種，結(jié)合自然發(fā)病方法，對(duì)篩選到的7株生防菌菌株進(jìn)行田間防效試驗(yàn)。每小區(qū)5行，每行17株玉米，9個(gè)處理（包括7株生防菌，對(duì)照藥劑，清水對(duì)照），每個(gè)處理4次重復(fù)。各生防菌用無菌水配制成108 CFU/mL的菌懸液，于發(fā)病初期對(duì)莖基部噴霧，每個(gè)小區(qū)5 L菌懸液。對(duì)照化學(xué)藥劑使用劑量按照商品說明書劑量使用。

1.6 調(diào)查方法

8月中旬和9月初對(duì)各小區(qū)進(jìn)行調(diào)查，每小區(qū)逐株調(diào)查，計(jì)算防治效果：

防治效果=[（對(duì)照田發(fā)病株數(shù)-防治田發(fā)病株數(shù)）/對(duì)照田發(fā)病株數(shù)]×100%。

1.7 發(fā)酵及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.7.1 不同碳、氮源對(duì)生防菌液抑菌活性的影響 分別以蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉代替葡萄糖；再分別以硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、尿素代替谷氨酸。按照“1.4”節(jié) 的方法測(cè)定，重復(fù)3次，確定最佳碳源和氮源。

1.7.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)生防菌液抑菌活性的影響 在其他培養(yǎng)條件一致的條件下，用0.1% NaOH溶液和0.1%HCl溶液配制pH值為4、5、6、7、8、9的培養(yǎng)皿，共6個(gè)處理，3次重復(fù)，后按照“1.4”節(jié)的方法測(cè)定，確定最佳培養(yǎng)pH值。在其他培養(yǎng)條件一致的條件下，將培養(yǎng)皿分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱，共7個(gè)處理，3次重復(fù)，按照“1.4”節(jié) 的方法測(cè)定，確定最佳培養(yǎng)溫度。在其他培養(yǎng)條件一致的條件下，將生防菌分別置于全光照、全黑暗、光暗交替條件下于恒溫生化培養(yǎng)箱中，共3個(gè)處理，3次重復(fù)，后按照“1.4”節(jié) 的方法測(cè)定，確定最佳光照培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本菌種判別

7株生防菌，革蘭氏染色均為陽(yáng)性，細(xì)胞呈直桿狀，芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，初步鑒定為芽孢桿菌屬。

2.2 7株菌株對(duì)玉米莖腐病的抑菌力比較

從土壤中分離到107株細(xì)菌菌株，抑菌圈培養(yǎng)有7株生防菌對(duì)玉米莖腐病表現(xiàn)出抑制活性，這7株菌株對(duì)玉米莖腐病的抑菌率見表1，菌絲直徑均在15 mm以上，其中G3抑制活性最高，抑菌直徑平均為26.00 mm，抑制率達(dá)到81.3%，G21，G45次之，菌絲直徑為24.00 mm和23.00 mm抑制率達(dá)75.0%和71.8%，其余4株生防菌株，菌絲直徑在15.00～19.00 mm。

2.3 生防菌防治玉米莖腐病田間藥效試驗(yàn)

從表2可以看出，7株生防菌對(duì)玉米莖腐病均有防治效果，防效達(dá)到21.1%～78.3%。生防菌G3防效最高，達(dá)到78.3%，與對(duì)照藥劑的防治效果81.11%差異不顯著，其次是G21、G45，雖與對(duì)照藥劑差異顯著但防治效果也分別為70.6% 和62.0%，G27、G17、G44、G23防治效果較差，防治效果在47.1%～21.1%。

2.4 對(duì)生防菌G3發(fā)酵及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 不同碳、氮源對(duì)生防菌G3抑菌活性的影響 以5 種不同碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的生防菌G3對(duì)玉米莖腐病均有一定的抑菌活性，其中乳糖培養(yǎng)的抑菌效果最好，抑菌率為83.1%，麥芽糖及淀粉培養(yǎng)的抑菌活性較差（表3），因此，選用乳糖作為碳源。以5 種氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的生防菌G3對(duì)玉米莖腐病均有一定的抑菌活性，其中氯化銨培養(yǎng)的抑菌效果最好，抑菌率為 85.1%，其次是硝酸鈉和谷氨酸，最差為尿素，抑菌率為47.1%（表3），因此，選用氯化銨作為碳源。

2.4.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基pH值為8，光照條件為光暗交替，最適溫度為25 ℃，其抑菌活性最好。

3 結(jié)論與討論

近幾年生物農(nóng)藥發(fā)展迅速，土壤中存在著豐富的細(xì)菌資源，目前，生物農(nóng)藥僅占現(xiàn)有農(nóng)藥體系的很少一部分，還有很大的發(fā)展空間。本次試驗(yàn)共從莖腐病發(fā)病土壤中分離得到107株生防菌株，通過抑菌試驗(yàn)、田間藥效試驗(yàn)篩選到7 株對(duì)玉米莖腐病有較好防治效果的細(xì)菌菌株。其中G3田間藥效最高，可達(dá)到78.3%。在研究中還進(jìn)行了對(duì)G3培養(yǎng)條件的優(yōu)化，結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基pH值為8，光照條件為光暗交替，最適溫度為25 ℃。這些試驗(yàn)結(jié)果為下一步生防制劑的研究提供了基礎(chǔ)。

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