防治臍橙炭疽病生防菌的篩選

張曉媛+賴聞玲+許楊

摘要：采用杯碟法測(cè)定枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、木霉菌（Trichodermaspp）、瓦克青霉（Penicillium waksmanii）、白淺灰鏈霉菌（Streptomyces albo-griseolus）對(duì)臍橙炭疽病病原菌菌株GXA5-1的防治效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，白淺灰鏈霉菌抑制菌絲體生長(zhǎng)的效果最顯著，在不同稀釋度下的相對(duì)抑制率都是最大的，稀釋10、100、200倍的相對(duì)抑制率為96.31%、85.82%、62.69%?？莶菅挎邨U菌抑制孢子萌發(fā)的效果是最顯著的，稀釋10、100、200倍的相對(duì)抑制率分別為89.93%、67.59%、48.76%。

關(guān)鍵詞：臍橙炭疽??；生防菌；生物防治

中圖分類號(hào)：S436.661.14 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0152—02

炭疽病是嚴(yán)重危害農(nóng)作物生產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)運(yùn)的一大真菌性病害，具有危害廣和危害時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，主要侵害農(nóng)作物葉片、枝條、花、果實(shí)和果柄，常造大量落葉、枝條枯死、落花、落果和果實(shí)腐爛。炭疽病的病原菌因植物不同而有所不同，主要由半知菌亞門腔孢綱黑盤孢目炭疽菌屬（Colletotrichum）中的真菌引起。炭疽病病原一般可直接在寄主上產(chǎn)生無(wú)性繁殖階段，而有性繁殖階段則很少見(jiàn)到。

引起柑橘炭疽病的病原菌無(wú)性階段是半知菌亞門炭疽菌屬的膠孢炭疽菌（CoUetotrichum gleosporioides Penz），有性階段為子囊菌門小叢殼屬（Glomerella cingulata Stonem），該病菌寄主范圍廣，能侵害多種熱帶、亞熱帶和溫帶農(nóng)產(chǎn)品品種。在很多情況下炭疽病是多種病原菌相互作用引起的，例如c.gloeosporioides、C.acutatum和C.fragariae引起草莓炭疽病。

目前，防治炭疽病主要依靠化學(xué)藥物。眾所周知化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期泛濫使用，極易增強(qiáng)病原菌的耐藥性。根據(jù)美國(guó)加利福尼亞的調(diào)查，抑霉唑在柑橘上連續(xù)使用5年以后，出現(xiàn)了抗抑霉唑菌株指狀青霉?；瘜W(xué)殺菌劑的濫用造成土壤、空氣的二次污染及農(nóng)產(chǎn)品中的殘留農(nóng)藥超標(biāo)，再次威脅環(huán)境和人類健康。因此植物炭疽病的防治研究開(kāi)始轉(zhuǎn)到生物技術(shù)應(yīng)用上來(lái)。部分用于防治農(nóng)產(chǎn)品采后炭疽病害的安全有效的生物制劑已經(jīng)研發(fā)出來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)拮抗菌篩選及采后果害的研究也取得了一定的成果。但是在柑橘屬農(nóng)產(chǎn)品上，至今尚未發(fā)現(xiàn)能抑制炭疽病菌達(dá)12 h以上的生物殺菌劑。本研究立足于地方臍橙產(chǎn)業(yè)中炭疽病害頻發(fā)現(xiàn)狀，旨在篩選出經(jīng)濟(jì)、安全、高效的抑菌菌株，為進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)和微生物農(nóng)藥的選育提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1培養(yǎng)基 細(xì)菌培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH值7.0～7.2，121℃滅菌20 min）。真菌培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，121℃滅菌20 min）。

1.1.2供試菌株 炭疽病致病菌株GXA5-1，分離自江西省贛州市贛縣梅林果園臍橙炭疽病發(fā)病病葉。按照科赫氏法則完成病原菌的分離純化、鑒定及致病性測(cè)定，確認(rèn)為膠孢炭疽菌?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluores-cens）、木霉菌（Trichodermaspp）、瓦克青霉（Penicillium waks-manii）、白淺灰鏈霉菌（Streptomyces albogriseolus）購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3生防菌處理液的制備 枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、熒光假單胞菌于100 mL牛肉膏液體培養(yǎng)基37℃、150 r/min振蕩活化12 h，取菌液5 mL加至95 mL牛肉膏液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，渾濁后以4 000 r/min離心10 min，取上清備用。

木霉菌、瓦克青霉接種至查彼固體培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)3 d，再轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，25℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，出現(xiàn)大量菌絲后過(guò)濾，4000 r/min離心10 min，取上清備用。

白淺灰鏈霉菌接種至高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基，28℃活化培養(yǎng)2 d，再轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，渾濁后以4 000 r/min離心10 min，取上清備用。

1.1.4菌株處理液對(duì)臍橙炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響采用杯碟法，配制含有生防菌處理液的PDA平板，稀釋度為10、100、200倍。直徑4 mm的打孔器切取菌塊，移植至含有生防菌處理液的PDA平板中央，28℃下培養(yǎng)。3 d后測(cè)量菌落直徑，記錄生長(zhǎng)情況。不含處理液的PDA平板，作為對(duì)照。每個(gè)菌株做3次重復(fù)，計(jì)算相對(duì)抑制率。

1.1.5菌株處理液對(duì)臍橙炭疽病病原菌孢子萌發(fā)的影響制備濃度為5×10⁴個(gè)/mL的孢子懸浮液。將生防菌處理液和孢子懸浮液稀釋10、100、200倍，滴在無(wú)菌凹玻片上，28℃保濕培養(yǎng)18 h后鏡檢，3次重復(fù)，無(wú)菌水做對(duì)照。每處理500個(gè)孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率和抑制率。

2結(jié)果與分析

2.1不同生防菌處理液對(duì)臍橙炭疽GXA5-1菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

從表1可以看出，在相同濃度下，各生防菌對(duì)病原菌的生長(zhǎng)影響表現(xiàn)有顯著性差異，白淺灰鏈霉菌的抑制效果最顯著，在不同稀釋度下的相對(duì)抑制率都是最大的。細(xì)菌中蘇云金芽孢桿菌的防治效果不明顯，枯草芽孢桿菌的防治效果較顯著。蘇云金芽孢桿菌比其他生防菌的抑制率都低，在稀釋10倍時(shí)抑制率為42.69%。相同生防菌菌株隨著濃度下降，對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率也下降。

2.2不同生防菌處理液對(duì)臍橙炭疽GXA5-1孢子的抑制作用

從表2可以看出，在相同濃度下各生防菌對(duì)分生孢子萌發(fā)影響差異顯著，其中枯草芽孢桿菌在不同稀釋度下的相對(duì)抑制率都是最大的，而蘇云金芽孢桿菌的抑制效果不明顯，當(dāng)稀釋度為10倍時(shí)蘇云金芽孢桿菌的抑制率為36.49%。相同生防菌菌株隨著濃度的下降對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率也下降。

3討論

采用杯碟法測(cè)定枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、熒光假單孢菌、木霉菌、瓦克青霉、白淺灰鏈霉菌5種生防菌對(duì)菌株GXA5-1的抑制效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示白淺灰鏈霉菌抑制菌絲體生長(zhǎng)的效果最顯著，在不同稀釋度下的相對(duì)抑制率都是最大的，稀釋10、100、200倍的相對(duì)抑制率分別為96.31%、85.82%、62.69%。枯草芽孢桿菌抑制孢子萌發(fā)的效果是最顯著的，稀釋10、100、200倍的相對(duì)抑制率分別為89.93%、67.59%、48.76%。

生防菌防治植物病害防效是植物體、病原菌和殺菌劑共同作用的結(jié)果，生防菌對(duì)臍橙炭疽病病原菌的生防機(jī)理呈多樣性，包括競(jìng)爭(zhēng)作用、抑菌作用和誘導(dǎo)植物抗性等。在室內(nèi)毒力測(cè)定中，主要是生防菌分泌抗菌物質(zhì)抑制病原菌生長(zhǎng)。如枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌素伊枯草素（iturin）能有效防治植物腐爛病，丁香假單胞桿菌產(chǎn)生丁香素防治檸檬綠霉病。當(dāng)然防效是依靠多種機(jī)制協(xié)同作用，目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)單一機(jī)制決定生物防效的生防菌。

本研究結(jié)果顯示，生防菌抑制率受有效濃度直接影響，隨著試驗(yàn)濃度下降，抑制率也下降很快。而在大田生產(chǎn)中，生防菌有效濃度受陽(yáng)光、氣溫、濕度及土壤營(yíng)養(yǎng)條件等自然環(huán)境因素影響較大，因此生防菌的不穩(wěn)定性成為目前生物農(nóng)藥研發(fā)的最大阻礙。

雖然目前生防菌的防治機(jī)理研究不夠深入，在大田生產(chǎn)中對(duì)自然環(huán)境依賴性強(qiáng)故而導(dǎo)致對(duì)植物病害的防治效果不如化學(xué)藥物，但是從環(huán)境影響和安全的角度考慮，選育高效生防菌替代化學(xué)藥物防治植物病害是今后生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。