人凝血因子7a核酸適配體的篩選與鑒定

羅鈺 王騰飛 李文靜 王金娥 裴仁軍

摘?要?人凝血因子7a （FVIIa）是外源性凝血途徑的核心因子，檢測參與凝血過程的FVIIa及針對FVIIa開發(fā)安全有效和經(jīng)濟(jì)的凝血?jiǎng)┖涂鼓獎(jiǎng)┦蔷哂兄匾囊饬x。本研究基于指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) （Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），采用酸纖維素膜法，通過11輪篩選成功分離出FVIIa的DNA適配體，并模擬了其二級結(jié)構(gòu)。此適配體與FVIIa蛋白結(jié)合的表觀解離常數(shù)為102 nmol/L。同時(shí)，基于所獲得的高親和力適配體，建立了基于適配體的熒光檢測方法。本方法簡單高效，對FVIIa蛋白的定量檢測范圍達(dá)到30～80 nmol/L，為人凝血因子7a的檢測提供了一條新途徑。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和適配體的熒光檢測方法結(jié)果表明， 此適配體具有良好的選擇性。

關(guān)鍵詞?凝血因子7a; 適配體; 指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù); 篩選; 熒光檢測

1?引 言

經(jīng)典凝血假說認(rèn)為，在高等生命體中的凝血機(jī)制存在兩個(gè)啟動(dòng)過程，分別是內(nèi)源性凝血和外源性凝血 [1]。在正常的凝血過程及各種血栓性疾病中，凝血過程通過激活外源性途徑觸發(fā)。外源性凝血由凝血因子7a（Factor VIIa，F(xiàn)VIIa）與組織因子（Tissue factor，TF）形成的復(fù)合物引發(fā)[2，3]。FVIIa是一種胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，在缺乏組織因子的情況下，對大分子底物的活性較低[4]。TF-FVIIa復(fù)合物的形成為大分子底物提供了一個(gè)合適的結(jié)合面，并通過改變FVIIa的活性位點(diǎn)提高其催化性能[5，6]。經(jīng)過一系列反應(yīng)，TF-FVIIa復(fù)合物通過外源性凝血途徑最終促成纖維蛋白凝塊的形成，參與凝血[7]。盡管此凝血途徑的作用機(jī)制已被闡明，但現(xiàn)有技術(shù)對診斷和治療由各凝血因子障礙而引起的血液疾病仍存在明顯不足。因此，檢測參與凝血過程的各因子，并針對特定疾病開發(fā)安全有效和低成本的凝血?jiǎng)┖涂鼓獎(jiǎng)匀皇且粋€(gè)亟待解決的問題。

適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) （Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX） 在體外篩選獲得的一種單鏈核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸，對其相應(yīng)的靶標(biāo)具有高親和力和高選擇性[8～11]。作為一種功能化核酸，適配體可用于對靶標(biāo)分子的識別[12]。目前，很多適配體序列已被成功分離，相應(yīng)的靶標(biāo)包含小分子[13]、蛋白質(zhì)[14]、細(xì)胞系[15]、病毒[16]等。有多種方法被用于篩選蛋白靶標(biāo)，如親和色譜柱法 [17]、磁珠法[18]、硝酸纖維素膜法[19]等。由于適配體具有高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)，基于適配體的傳感器近年也得到了迅猛發(fā)展[20，21]。目前，已發(fā)展出可用于小分子檢測[13，22]、蛋白分子檢測[23]、細(xì)胞成像[15，24]?等的適配體傳感器。

本研究以外源性凝血途徑的核心因子FVIIa為靶蛋白，基于硝酸纖維素膜分離的篩選方法，成功分離出FVIIa的DNA適配體，此適配體與FVIIa蛋白結(jié)合的表觀解離常數(shù)為102 nmol/L，并具有較好的選擇性?；谒@得的高親和力適配體，建立了一種簡單的熒光傳感方法，用于檢測FVIIa蛋白。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Eppendorf Mastercycler Nexus PCR儀（德國Eppendorf公司）; VICTOR×4酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer公司）; 電泳儀（美國BioRad公司）; LAS 4000 mini凝膠成像系統(tǒng)（日本Fujifilm公司）。

人凝血因子 7a蛋白由諾和諾德中國研發(fā)中心周蓉博士提供; ?DNA序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）; 0.45-μm硝酸纖維素膜（通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展（上海）有限公司）; 25-mm 可拆卸濾器（默克密理博實(shí)驗(yàn)室設(shè)備（上海）有限公司）; 鏈霉親和素瓊脂糖微珠、SYBR Green Ι（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）; 10×PCR緩沖液、脫氧核苷三磷酸（dNTPs）、rTaq 聚合酶、20 bp DNA Marker、6×DNA上樣緩沖液、PMD18-T載體克隆試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）; 工程化大腸桿菌 BL21 （美國模式培養(yǎng)物集存庫）; 10×PBS緩沖液、5×TBE緩沖液、鮭魚精DNA、LB液體培養(yǎng)基（干粉）、LB固體培養(yǎng)基（干粉）、30% 丙烯酰胺、10% 過硫酸銨、四甲基乙二胺（北京索萊寶科技有限公司）; 瓊脂糖、NaOH、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、MgCl2、牛血清白蛋白、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸、Na2CO3、NaHCO3（西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司）。所用試劑均為分析純， 實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?溶液配制?結(jié)合緩沖液為1×PBS， 5 mmol/L MgCl2， 0.1 mg/mL牛血清白蛋白， 25 μg/mL鮭魚精DNA。儲(chǔ)備溶液為2×結(jié)合緩沖液。各溶液配制后于20℃保存。

洗脫緩沖液含7 mol/L 尿素、7 mmol/L 十二烷基硫酸鈉和1 mmol/L 乙二胺四乙酸。儲(chǔ)備溶液為1×洗脫緩沖液。配制后于4℃保存。

純化液為鮭魚精DNA、乙酸鈉和無水乙醇的混合液： 準(zhǔn)確稱取20 mg 鮭魚精DNA、12.30 g NaAC溶于50 mL水中，并用乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.2，以無水乙醇定容至500 mL，混勻，于20℃保存。

包被液為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH=9.6），封閉液為3%（w/V））牛血清白蛋白溶液。

2.2.2?篩選過程?（1）負(fù)篩選過程?取100 μmol/L 隨機(jī)寡核苷酸庫20 μL 溶于50 μL水中，95℃水浴加熱5 min，取出冷卻至室溫，加入50 μL 2×結(jié)合緩沖液，輕微振蕩搖勻。室溫下與純凈的硝酸纖維素膜共孵育1 h，棄膜，收集上清液，用于后續(xù)正篩選。（2）正篩選過程?將上述處理過的隨機(jī)寡核苷酸庫與200 μL人凝血因子7a 蛋白溶液于室溫下共孵育1 h。將硝酸纖維素膜固定在可拆卸濾器中，使用1×結(jié)合緩沖液潤濕濾器中的硝酸纖維素膜，使共孵育液緩慢的通過硝酸纖維素膜，此過程重復(fù)5次。使用800 μL 1×結(jié)合緩沖液緩慢洗去游離在膜表面的寡核苷酸序列，此過程重復(fù)3次。（3）變性?將硝酸纖維素膜取出并將其剪碎，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中。加入200 μL 洗脫緩沖液，充分振蕩。95℃水浴加熱10 min，使蛋白變性，與寡核苷酸分離。此過程重復(fù)2次，合并兩次洗脫液。（4）純化?加入1 mL純化液，80℃ 靜置2 h。4℃ 下14000 r/min 離心25 min。棄上清液，加入1 mL 70%（V/V）預(yù)冷乙醇，重復(fù)離心1次，棄上清液，65℃ 烘箱中烘干。（5）擴(kuò)增?將干燥的寡核苷酸粉末用150 μL水溶解。每個(gè)PCR反應(yīng)體系為50 μL，每個(gè)反應(yīng)體系含有400 μmol/L dNTPs、1 μmol/L 正向引物、1 μmol/L 反向引物、25 U/mL rTaq聚合酶、5 μL 10×PCR緩沖液、2 μL DNA模板，總反應(yīng)體系6 mL; 將PCR程序設(shè)置為： 95℃ 5 min; 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s（將此步設(shè)為10～20個(gè)循環(huán)）; 72℃ 5 min; 10℃ 保持至結(jié)束。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳以檢驗(yàn)產(chǎn)物純度，取 8 μL PCR 產(chǎn)物與 2 μL 6×DNA電泳緩沖液（每 mL 含有 SYBR GReen I 10 μL）混勻后上樣，凝膠為3%非變性瓊脂糖凝膠，電泳緩沖溶液為1×TBE緩沖液，電壓為140 V。電泳結(jié)束后利用凝膠成像系統(tǒng)對其拍照并分析。（6）制備單鏈?將PCR產(chǎn)物與鏈霉親和素修飾的瓊脂糖親和柱孵育，由于PCR使用生物素標(biāo)記的反向引物，利用生物素和親和素的相互作用將PCR產(chǎn)物固定在親和柱上。用800 μL 1×結(jié)合緩沖液洗3次后，用0.1 mol/L NaOH溶液洗脫ssDNA，并用適量HCl中和NaOH。加入1 mL 預(yù)冷無水乙醇，80℃靜置2 h。4℃下14000 r/min 離心25 min。棄上清液，加入1 mL 70%（V/V）預(yù)冷乙醇; 重復(fù)離心1次，棄上清液，65℃烘干。將干燥的寡核苷酸粉末用20 μL水溶解，取1 μL稀釋至50 μL，測定260 nm處的吸光度，計(jì)算其中寡核苷酸含量。重復(fù)步驟（1）～（6）。自第二輪篩選開始寡核苷酸隨機(jī)文庫的用量降至300 pmol。

2.2.3?測序與序列分析?擴(kuò)增經(jīng)過數(shù)次篩選的富集庫，轉(zhuǎn)入工程化大腸桿菌BL21中， 37℃ 培養(yǎng)過夜; 挑取隨機(jī)菌落并送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

利用序列比對程序?qū)λ眯蛄羞M(jìn)行分析，如 ClustalX 1.83 比對序列，分析適配體序列的一級結(jié)構(gòu)及其同源性，將各序列分組，并用 NUPACK 模擬其二級結(jié)構(gòu)，選擇結(jié)構(gòu)具有代表性的序列進(jìn)行合成，以進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2.4?熒光測量?將96 孔ELISA酶標(biāo)板用200 μL 1×結(jié)合緩沖液預(yù)先潤洗1次，孔中包被100 pmol靶蛋白溶液（1 μmol/L， 100 μL，使用包被液稀釋），或等量對照蛋白（牛血清白蛋白和鏈霉親和素），4℃ 下濕盒中過夜，棄去蛋白溶液。在包被蛋白的孔中加入封閉液，37℃孵育2 h; 將50 μL FITC修飾的隨機(jī)文庫或適配體序列在95℃水浴中加熱5 min，取出冷卻至室溫，加入50 μL 2×結(jié)合緩沖液，混勻后加入處理過的酶標(biāo)板中，37℃下孵育2 h; 用1×PBS洗去游離的DNA，使用酶標(biāo)儀讀?。ǖ鬃x）實(shí)驗(yàn)孔在485 nm處熒光強(qiáng)度。

2.2.5?非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳?將100 pmol 靶蛋白（20 μmol/L， 5 μL） 與 200 pmol （200 μmol/L， 1 μL） 已預(yù)先退火的熒光標(biāo)記的適配體鏈混勻，加入4 μL 2×結(jié)合緩沖液，室溫下孵育1 h， 同時(shí)設(shè)置空白對照及牛血清白蛋白和鏈霉親和素作為陰性對照。孵育后加入2 μL 6×DNA上樣緩沖液，混勻后上樣。凝膠為8% 非變性聚丙烯酰胺凝膠，電泳電壓80 V。電泳結(jié)束后利用凝膠成像系統(tǒng)對其拍照并分析。

2.2.6?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?采用Origin Pro 8.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間差異分析采用t檢驗(yàn)， 組間多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?篩選方法

本研究選擇硝酸纖維素膜分離方法用于篩選靶蛋白FVIIa的DNA核酸適配體。在篩選過程中，先使蛋白與核酸文庫在緩沖溶液中孵育，再依靠膜對蛋白的吸附作用分離有作用的DNA序列。這種先孵育再分離的方法使得蛋白與適配體的結(jié)合在液相均相中進(jìn)行。

硝酸纖維素膜對蛋白的吸附作用使得適配體-蛋白復(fù)合物保留在膜表面，再用緩沖液洗去游離在膜表面的未結(jié)合的序列，留存在膜上的DNA經(jīng)過提取純化后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)入到下一輪篩選中。

采用熒光法監(jiān)測篩選過程中庫的富集效果。FITC標(biāo)記的核酸庫由FITC標(biāo)記的正向引物通過PCR反應(yīng)制得。如圖1所示，隨著篩選輪數(shù)的增加，保留在蛋白表面的序列增多，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。經(jīng)過11輪富集，熒光強(qiáng)度不再發(fā)生明顯增長，因此對第11輪文庫進(jìn)行測序。

3.2?測序結(jié)果

經(jīng)第11輪篩選的文庫被轉(zhuǎn)入工程化大腸桿菌BL21中，培養(yǎng)過夜后，挑取隨機(jī)單克隆菌落進(jìn)行測序。對測序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，結(jié)果如圖2所示。將所獲得序列通過M-fold （http：//unafold.rna.albany.edu/） 做二級結(jié)構(gòu)模擬，合成有一定同源性且二級結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定的序列，并做進(jìn)一步分析。如圖3所示， 選擇FVIIa-7和FVIIa-16， 并在5'端標(biāo)記FITC， 以進(jìn)一步考察親和力和特異性等，F(xiàn)VIIa-7和FVIIa-16的二級結(jié)構(gòu)如圖3所示。相關(guān)寡核苷酸序列見表1。

3.3?親和力測定

通過熒光法測定適配體的親和力（解離常數(shù)）。先將靶蛋白固定在酶標(biāo)板上，再使之與熒光標(biāo)記的適配體作用。除去游離在表面的適配體，可檢測的熒光信號全部來自與蛋白作用的適配體，熒光信號越強(qiáng)，說明與蛋白作用的適配體越多。本方法操作簡單，所需試劑種類及數(shù)量較少，是一種簡單經(jīng)濟(jì)的表征方法。如圖4所示，配制終濃度為0、10、25、50、75、100、125、150、200、300、400和500 nmol/L的適配體（每孔100 μL）與靶蛋白作用，按公式（1）擬合，解離常數(shù)（Kd）計(jì)算結(jié)果由Graphpad Prism 5給出：

其中， F為加入適配體后的熒光信號，F(xiàn)0為背景信號， c為所加入適配體的濃度， Fmax為擬合曲線Y軸上最高點(diǎn)， Kd為所求的解離常數(shù)。

FVIIa-7的解離常數(shù)為296.3 nmol/L（圖4A），而FVIIa-16具有更高的親和力，解離常數(shù)為102.0 nmol/L（圖4B）。

3.4?FVIIa的定量檢測

采用競爭結(jié)合法確定FVIIa-16對靶蛋白的檢測濃度范圍。

實(shí)驗(yàn)原理如圖5所示，在溶液相中加入不同量的蛋白，與適量的適配體孵育，再將含有蛋白-適配體復(fù)合物、游離蛋白、游離適配體的混合溶液加入到包被了FVIIa蛋白的酶標(biāo)板中，通過測定與酶標(biāo)板上固定蛋白結(jié)合的適配體發(fā)出的熒光信號，間接反映待測溶液中FVIIa蛋白的濃度。

首先在酶標(biāo)板中包被100 pmol靶蛋白，將終濃度為0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、150、200和300 nmol/L 的靶蛋白與200 pmol已變性處理的適配體在結(jié)合緩沖液中 （總體積100 μL）于 37℃孵育1 h，將溶液依次轉(zhuǎn)移至包被有蛋白的酶標(biāo)板中，37℃下孵育2 h; 洗去游離的DNA，測定各孔在485 nm 的熒光強(qiáng)度。如圖6所示，適配體對FVIIa-16定量檢測范圍為30～80 nmol/L，線性回歸方程為 ΔF485 nm=-6.18C （nmol/L） + 602.27（R2=0.978）。

3.5?方法的特異性

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳考察適配體的特異性 [18]，如圖7所示，熒光標(biāo)記的適配體與FVIIa結(jié)合后，相比于對照組蛋白條帶滯后。利用熒光法檢驗(yàn)了熒光標(biāo)記的適配體與FVIIa及對照組蛋白間的作用，酶標(biāo)板中每孔包被100 pmol蛋白，與300 pmol 已變性處理的適配體孵育，記錄其熒光強(qiáng)度; 基于t檢驗(yàn)計(jì)算同種蛋白組間顯著性差異，結(jié)果如圖8所示，空白對照組為不加適配體的蛋白本底熒光值，樣品組為加入熒光標(biāo)記適配體的響應(yīng)值，結(jié)果表明，F(xiàn)VIIa-16能顯著區(qū)分靶蛋白的空白對照與樣品組，而不與其它對照蛋白作用，具有良好的特異性。

4?結(jié) 論

采用硝酸纖維素膜法，經(jīng)過11輪篩選，成功篩選分離了人凝血因子FVIIa的DNA適配體。此適配體的表觀解離常數(shù)為102.0 nmol/L，對FVIIa定量檢測范圍為30～80 nmol/L，具有良好的選擇性。FVIIa蛋白的RNA適配體已被成功分離，此適配體可通過阻止TF-FVIIa復(fù)合物的形成影響FVIIa，并延長凝血時(shí)間[25]。但RNA成本高，并需要嚴(yán)格的使用環(huán)境。DNA適配體成本較RNA適配體低，合成簡單，并具有更好的穩(wěn)定性。本研究篩選的DNA適配體與FVIIa有較高的親和性，可用于FVIIa的高靈敏、高選擇性的檢測，并有望基于此適配體開發(fā)經(jīng)濟(jì)有效的凝血?jiǎng)┗蚩鼓齽?/p>

References

1?Davie E W， Fujikawa K， Kisiel W. Biochemistry， 1991， 30（43）： 10363-10370

2?Srensen B B， Persson E， Freskgrd P O， Kjalke M， Ezban M， Williams T， Rao L V M. J. Biol. Chem.， ?1997， ?272（18）： 11863-11868

3?McCallum C D， Hapak R C， Neuenschwanderi P F， Morrisseyi J H， Johnson A E. J. Biol. Chem.， ?1996， ?271（45）： 28168-28175

4?Nemerson Y. Blood， ?1988， ?71（1）： 1-8

5?Lawson J H， Butenas S， Mann K G. J. Biol. Chem.， ?1992， ?267： 4834-4843

6?Banner D W， D'Arcy A， Chène C， Winkler F K， Guha A， Konigsberg W H， Nemerson Y， Kirchhofer D. Nature， ?1996， ?380（6569）： 41-46

7?Hoffman M， Monroe D M， Oliver J A， Roberts H R. Blood， ?1995， ?86（5）： 1794-1801

8?Tuerk C， Gold L. Science， ?1990， ?249（4968）： 505-510

9?Ellington A D， Szostak J W. Nature， ?1990， ?346（6287）： 818-822

10?WANG Wei-Wei， LIU Su-Qin， XUE Yun， WANG Yan， YAN Chao. Chinese Journal of Chromatography， 2017， 35（1）： 99-104

王薇薇， 劉素琴， 薛 蕓， 王 彥， 閻 超. 色譜， 2017， 35（1）： 99-104

11?LIU Xiao-Hui， WANG Ze-Cheng， ZHANG Xiao-Bing， XU Dan-Ke. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（12）： 1971-1979

劉曉輝， 王則呈， 張曉兵， 許丹科. 分析化學(xué)， 2017， 45（12）： 1971-1979

12?Liu J， Cao Z， Lu Y. Chem. ?Rev.， ?2009， ?109（5）： 1948-1998

13?Luo Y， Wang J， Yang L Y， Gao T， Pei R J. Sens. Actuators B， ?2018， ?276： 128-135

14?DU Zhen-Ya， JIA Ru-Han， LI Wen-Hui， YANG Jing， XI Jing， SHI Da-Lin， HAN Yue-Wu. Chin. J. Biochem. Mol. Biol.， ?2018， ?34（10）： 1065-1072

杜振亞， 賈茹涵， 李文慧， 楊 靜， 習(xí) 靜， 石大林， 韓躍武. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)， ?2018， ?34（10）： 1065-1072

15?Wang J， Zhang Y J， Chen Y， Hong S N， Sun Y， Sun N， Pei R J. Talanta， ?2017， ?175： 235-242

16?Liu D L， Zhang Z L， Yin Y J， Jia F， Wu Q P， Tian P， Wang D P. Talanta， ?2019， ?193： 199-205

17?LI Hui， WANG Wei， DING Hong-Mei， DONG Jie， HUANG Ai-Xue， LUO Zhao-Feng， LI Jie， BAI Chen-Jun， LI Shao-Hua， SHAO Ning-Sheng. Lett. Biotech.， ?2018， ?29（4）： 459-464

李 慧， 王 瑋， 丁紅梅， 董 潔， 黃皚雪， 羅昭鋒， 李 潔， 白琛俊， 李少華， 邵寧生. 生物技術(shù)通訊， ??2018， ?29（4）： 459-464

18?Abdessamad T A， Laura F， Nick M， Jamal I， Pascale R， William J. Nucleic Acids Res.， ?2002， ?30： 10e35

19?LIU Zhong-Cheng， ZHAO Li-Jun， ZHANG Yan-Fen， SHI Hai-Lang， XIE Yao. Acta Pharm. Sin.， ?2012， ?47（12）： 1605-1611

劉中成， 趙麗君， 張艷芬， 時(shí)海浪， 解 瑤. ?藥學(xué)學(xué)報(bào)， ??2012， ?47（12）： 1605-1611

20?WANG Kun， TAO Zhan-Hui， XU Lei， LIU Ya-Qing. Chinese J. Anal. Chem.， ?2014， ?42（2）： 298-304

王 昆， 陶占輝， 徐 蕾， 劉亞青. 分析化學(xué)， ?2014， ?42（2）： 298-304

21?DU Yu-Lin， MO Liu-Ting， YI Ya-Sha， QIU Li-Ping， TAN Wei-Hong. Chinese J. Anal. Chem.， ?2017， ?45（12）： 1757-1765

堵玉林， 莫柳婷， 易婭莎， 邱麗萍， 譚蔚泓. ?分析化學(xué)， ??2017， ?45（12）： 1757-1765

22?Stojanovic M N， de Prada P， Landry D W. J. Am. Chem. Soc.， ?2001， ?123（21）： 4928-4931

23?Nutiu R， Li Y. J. Am. Chem. Soc.， ?2003， ?125（16）： 4771-4778

24?Song W J， Strack R L， Sevensen N， Jaffrey S R. J. Am. Chem. Soc.， ?2014， ?136（4）： 1198-1201

25?Rusconi C P， Yeh A， Lyerly H K， Lawson J H， Sullenger B A. Thromb. Haemost.， ?2000， ?84： 841-848