高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定植物源保健食品中6種砷形態(tài)化合物

孟珊 邵陽 胡偉杰 封淑華

1?引?言

我國保健食品的快速發(fā)展，主要是基于“藥食同源”的中藥材等植物源成分的引入，這使得其在食品功能的基礎(chǔ)上具備了一定的保健功能。中藥材不僅可以用作治療疾病，也可以作為維持機(jī)體正常生理功能的保健食品原料。有研究指出，目前保健食品原料使用較多的中藥材包括決明子、白芍、蘆薈、淫羊藿、三七、番瀉葉、紅花、五味子、川穹等約20種。近年來，中藥材由于種植方式及植物特性引起的重金屬污染多有報(bào)道，因此，引入中藥材等植物源的保健食品也應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注重金屬方面的污染。

隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，僅測(cè)定重金屬元素總量已經(jīng)不能滿足質(zhì)量監(jiān)測(cè)的需求。元素的生理、毒理特性與其存在的化學(xué)形態(tài)有密切關(guān)系，同一元素的不同形態(tài)生理作用存在很大差異。如砷形態(tài)化合物中，復(fù)雜的有機(jī)砷化合物砷甜菜堿和砷膽堿毒性極小，一般不被人體吸收，不易引起中毒。而無機(jī)砷中，亞砷酸的毒性明顯大于砷酸，需重點(diǎn)關(guān)注。電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）在測(cè)定元素方面，具有檢出限低、分析速度快、干擾小等優(yōu)勢(shì)。高效液相色譜（HPLC）技術(shù)主要用于元素形態(tài)的分離，其與ICP-MS的聯(lián)用技術(shù)，在保證有效分離的基礎(chǔ)上，可實(shí)現(xiàn)高效、準(zhǔn)確的含量測(cè)定。

本研究選取植物源保健食品為研究對(duì)象，采用硝酸溶液超聲提取樣品，建立了HPLC-ICP-MS法測(cè)定植物源保健食品中6種砷形態(tài)化合物的檢測(cè)方法，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述及分析，以期為保健食品的砷形態(tài)化合物檢測(cè)提供技術(shù)依據(jù)，以便進(jìn)一步評(píng)價(jià)其質(zhì)量安全性。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

島津 20A液相色譜儀（日本島津公司）; ThermoFisheriCAPTM Q電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）; CEM MARS5微波消解系統(tǒng)。

22批次樣品均購自市場(chǎng)， 包括減肥類、改善睡眠類、增強(qiáng)免疫力類、輔助降血糖類等保健食品。 硝酸，優(yōu)級(jí)純; 碳酸銨，優(yōu)級(jí)純; 6種砷形態(tài)化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)： 砷甜菜堿（As B），二甲基砷（DMA），亞砷酸（As Ⅲ），砷膽堿（As C），一甲基砷（MMA），砷酸（As Ⅴ），均來自中國計(jì)量科學(xué)研究院; 調(diào)諧液： Ba、Bi、Ce、Co、In、Li、U混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，1 μg/L，Thermo SCIENTIFIC; 超純水（18.2 MΩ·cm）由Milli-Q制水系統(tǒng)制得，用于配制所有標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液。

液相色譜工作條件： 色譜柱： 陰離子分析柱Thermo SCIENTIFIC AS7（4×250 mm）; 柱溫： 25℃; 進(jìn)樣量： 20 μL; 流速： 1.1 mL/min。流動(dòng)相： A為0.35 g/L碳酸銨溶液; B為8g/L碳酸銨溶液。 梯度洗脫程序： 0.0～3.0 min，0%～80% A; 3.0～3.1 min，80%～100% A; 3.1～5.4 min，100% A; 5.4～6.0 min， 100%～0% A; 6.1～12 min， 0% A。

ICP-MS工作條件： 等離子體功率： 1550 W; 冷卻氣流速： 14 L/min; 輔助氣： 0.8 L/min; 載氣流速： 1.07 L/min; 采樣深度： 5 mm; 霧化室溫度： 2.7℃，Ni采樣錐、截取錐; 采用碰撞池技術(shù)（KED）; 分析模式： 全定量; 氧化物： CeO/Ce<3.0%。采集質(zhì)量數(shù)： 75 As; 積分時(shí)間： 0.2 s; 采集時(shí)間： 720 s。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

分別精密移取適量6種砷形態(tài)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水溶解， 稀釋配制成濃度為1.0mg/L（以As計(jì)）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用水逐級(jí)稀釋成濃度范圍為0.5～100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，儀器根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

樣品溶液制備方法一： 精密稱取研磨均勻的樣品約2.0 g，置于25mL容量瓶中，加入約20 mL 2%硝酸溶液，超聲提取30 min后，定容至刻度，搖勻。同時(shí)作空白試驗(yàn)。

樣品溶液制備方法二： 精密稱取研磨均勻的樣品約0.3 g，置于消解罐中，加消解液8mL硝酸，放入微波消解儀中進(jìn)行消解。待消解完成后，進(jìn)行趕酸處理，趕酸至0.5 mL左右，放至室溫，用超純水定容至25mL容量瓶中，搖勻。同時(shí)作空白試驗(yàn)。

3?結(jié)果與討論

3.1?色譜條件

本研究考察了Thermo SCIENTIFIC AS7兩種規(guī)格的色譜柱： （1）2×250 mm; （2）4×250 mm。1號(hào)柱僅能實(shí)現(xiàn)5種砷形態(tài)化合物的分離，且分析時(shí)間較長; 2號(hào)柱能有效分離6種砷形態(tài)化合物，通過改變柱流速，在流速為1.1 mL/min時(shí)仍能得到良好的分離效果，結(jié)果見圖1。

3.2?樣品前處理

采用2.2節(jié)中方法一對(duì)樣品進(jìn)行前處理， 測(cè)定6種砷形態(tài)化合物，方法一主要參考了GB 5009.11-2014第二篇第二法27.2.1的處理方法，并在此基礎(chǔ)上減少了處理步驟，僅用超聲提取的方法提取目標(biāo)化合物，并用加標(biāo)回收率來考察提取率，該方法的提取率范圍為97.5%～103.2%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。對(duì)方法一的提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，考察了15、30、60 min的樣品提取率。發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間為30 min時(shí)，6種砷形態(tài)化合物提取率均大于94%; 當(dāng)提取時(shí)間為15 min時(shí)，提取率約為85%; 提取時(shí)間60 min與30 min的提取率基本一致。 最終選擇超聲提取時(shí)間為30 min。

3.3?線性范圍與檢出限

采用優(yōu)化的條件， 測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 以各組分標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，各組分響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種砷形態(tài)化合物在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)（R）均>0.999。線性方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限見表1。

3.4?回收率與精密度

取空白樣品，分別添加6種砷形態(tài)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為5、20、80 ng/mL， 按2. 2節(jié)方法一進(jìn)行前處理，測(cè)定并計(jì)算回收率和精密度，平均回收率為94.4%～105.3%， RSD（n=6）為0.7%～5.0%。

3.5?實(shí)際樣品測(cè)定

選取植物源保健食品22批次，運(yùn)用2.2方法一測(cè)定6種砷形態(tài)化合物的含量，結(jié)果見表2。

測(cè)定的22批次樣品中，未檢出As C。1批次樣品檢出AsⅢ和MMA，檢出率為4.5%，結(jié)果均為0.01 mg/kg; As B檢出率為27.3%，測(cè)定結(jié)果為0.01～0.04 mg/kg; DMA檢出率為59.1%，測(cè)定結(jié)果為 0.01～0.09 mg/kg; AsⅤ檢出率為77.3%，測(cè)定結(jié)果為0.01～0.56 mg/kg。將6種砷形態(tài)化合物的含量進(jìn)行加和得到總砷含量，其中約有64.7%的AsⅤ含量超過總砷含量的50%，甚至有3批次樣品只含有AsⅤ。22批次樣品的AsⅤ含量平均值約為AsB的12倍，DMA的6倍。由此可見，22批次的植物源保健食品中砷形態(tài)化合物存在形式以AsⅤ為主，且總砷含量主要為AsⅤ的含量。

將22批次樣品運(yùn)用2.2方法二進(jìn)行消解處理，測(cè)定總砷，結(jié)果見表2。利用SPSS 21.0對(duì)兩種處理方法測(cè)定的總砷結(jié)果進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)為0.960（p<0.01），呈極顯著正相關(guān); 雙側(cè)配對(duì)t檢驗(yàn)的p=0.510（>0.05），兩組結(jié)果沒有顯著差異。本研究中采用酸溶液超聲提取測(cè)定的總砷含量與傳統(tǒng)微波消解測(cè)定的總砷含量結(jié)果基本一致，說明通過砷形態(tài)分析法可以準(zhǔn)確測(cè)定總砷含量。HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)不僅可以有效分離樣品中砷形態(tài)的存在形式，而且可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。