超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用技術用于膽道閉鎖患兒尿液代謝組學研究

李維薇 汪受傳 單進軍 戴啟剛 徐珊 謝彤 林麗麗 杜麗娜 楊燕

摘?要?利用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用技術（Ultra-high performance liquid chromatography with linear ion trap-orbitrap mass spectrometry， UHPLC-LTQ/Orbitrap-MS）對膽道閉鎖患兒（Biliary atresia，BA）和健康嬰兒（Normal control， NC）的尿液進行代謝組學分析，篩選膽道閉鎖患兒尿液中的潛在生物標志物。收集了32例膽道閉鎖患兒及40例健康嬰兒的尿液樣本，獲得尿液樣本的代謝輪廓，通過主成分分析法（Principle component analysis， PCA）及正交偏最小二乘法-判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）等多元統(tǒng)計分析，最終篩選并鑒定32種內(nèi)源性差異代謝物可作為膽道閉鎖潛在的生物標記物。涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代謝，組氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路紊亂。提示在膽道閉鎖過程中伴隨廣泛的蛋白質(zhì)代謝紊亂。其中，谷氨酸、L-谷氨酰胺、瓜氨酸、脯氨酸、胍基乙酸、5'-甲硫腺苷、ε-（γ-谷氨酰）-賴氨酸等物質(zhì)表達差異趨勢明顯，涉及一系列膽道閉鎖相關的病理機制。本研究為了解膽道閉鎖的發(fā)病機制和早期篩查提供了科學依據(jù)。

關鍵詞?膽道閉鎖; 超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱質(zhì)譜; 代謝組學; 尿液; 生物標志物

1?引 言

膽道閉鎖（Biliary atresia，BA）是一種機制尚不明確的膽管破壞性疾病，表現(xiàn)為肝內(nèi)外膽管阻塞，并可導致淤膽性肝硬化，是小兒外科領域常見病之一[1]。膽道閉鎖早期及時進行Kasai手術可有效改善肝臟功能，幫助膽汁順利排出[2]。通過該手術，約50%的患者術后5年可維持較好的肝功能[3]。如不及時治療，膽道閉鎖患兒會在兩年內(nèi)死于肝臟衰竭[4]。臨床常用經(jīng)內(nèi)鏡逆行性胰膽管造影（Endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）和肝臟活檢診斷膽道閉鎖。但這兩種檢查手段均為有創(chuàng)檢查，會對患兒的健康造成損害，且診斷的準確率有待提高[5]。運用新技術篩選膽道閉鎖的生物標記物，有助于了解該疾病的發(fā)病機制，有利于快速臨床診斷和治療。

近年來，代謝組學發(fā)展技術發(fā)展迅速。在臨床醫(yī)學領域，利用代謝組學技術可研究疾病發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)疾病生物標記物以及監(jiān)測疾病進程[6～9]。但目前有關膽道閉鎖的代謝組學研究較少，Zhao等[10]基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（Liquid chromatography-mass spectrometry， LC-MS）對膽道閉鎖患兒的血漿樣本進行探究，發(fā)現(xiàn)與嬰兒肝炎綜合征相比，膽道閉鎖患兒在氨基酸代謝和?；鈮A代謝存在紊亂。Zhou等[11]同樣采用LC-MS技術，針對膽道閉鎖患兒的膽汁酸代謝進行研究，發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖患兒的?；撬崦撗跄懰犸@著上調(diào)，而鵝去氧膽酸顯著下調(diào)。本研究組前期采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（Gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS）進行嬰兒巨細胞病毒（Human cytomegalovirus， HCMV）肝炎的研究時也發(fā)現(xiàn)，合并HCMV感染的膽道閉鎖患兒血漿樣本代謝特征與嬰兒肝炎綜合征及嬰兒膽汁淤積性肝病患兒存在較大差異[12]。隨后又采用GC-MS技術探究了膽道閉鎖患兒尿液樣本的代謝特征，并基于膽道閉鎖的尿液特征性代謝物構建了診斷模型[13]。但由于檢測儀器的特性，GC-MS技術僅能檢測m/z 50～500的小分子物質(zhì)，無法全面了解膽道閉鎖的發(fā)病機制及代謝特征。因此，采用檢測范圍更廣的儀器，可望進一步發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖相關代謝物，闡明其代謝機制。

考慮到尿液樣本的收集過程簡單且安全，無創(chuàng)傷性，對嬰兒沒有任何危害和副作用， 嬰兒飲食結(jié)構簡單，受外環(huán)境影響較小，是進行尿液代謝組學研究的理想對象，因此本研究采用患兒的尿液樣本進行膽道閉鎖的代謝組學研究。利用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用（Ultra-high performance liquid chromatography with linear ion trap-orbitrap mass spectrometry， UHPLC-LTQ/Orbitrap-MS）技術檢測膽道閉鎖患兒與正常對照組嬰兒的尿液樣本，通過主成分分析法篩選潛在的生物標志物，為進一步探討膽道閉鎖的發(fā)病機制提供科學依據(jù)。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Dionex UltiMate 3000 超高效液相色譜儀和線性離子阱/靜電場軌道阱質(zhì)譜（美國Thermo Fisher公司）; Allegra 64R Centrifuge型離心機（美國Beckman Coulter公司）; Synergy型超純水系統(tǒng)（美國Millpore公司）。乙腈（HPLC級，德國Merck公司）; 甲酸和甲酸銨（HPLC級，美國ROE Scientific公司）; 內(nèi)標13C5-L-Glutamine和13C2-L-Tryosine（美國Sigma-Aldrich公司）。

2.2?樣本來源及處理

膽道閉鎖患兒尿樣和健康嬰兒尿樣均由首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院提供，經(jīng)過北京兒童醫(yī)院機構倫理委員會批準，所有患兒監(jiān)護人均簽署了知情同意書。以2016年1月～2016年12月在北京兒童醫(yī)院經(jīng)膽道造影確診為膽道閉鎖的32例患兒為研究對象，同時選取同時期在北京兒童醫(yī)院通過體檢確定為健康的嬰兒40例。兩組患兒的一般情況見表1。取兩組嬰兒晨起空腹第一次尿液約2 mL，于80℃保存。

取90 μL樣品，于室溫下溶解，加入100 μL含有20 μg/mL內(nèi)標13C5-L-Glutamine和13C2-L-Tryosine的雙蒸水稀釋尿樣。渦旋振蕩10 min，17000 r/min離心10 min，取上清液150 μL，再以17000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，待測。

2.3?色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件： Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（150 mm × 2.1 mm，1.7 μm），流動相A為含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨的水溶液，流動相B為含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨的乙腈/水溶液（95∶5，V/V）。梯度洗脫程序： 0～2 min，100% B; 2～7.7 min，70% B; 7.7～9.5 min，40% B; 9.5～10.25 min，30% B; 10.25～12.75 min，30%～100% B; 12.75～16 min，100% B。柱溫40℃; 流速0.4 mL/min; 正離子模式下進樣量2 μL，負離子模式下進樣量5 μL。

質(zhì)譜條件： 采用電噴霧離子源（ESI），正、負離子全掃模式檢測，噴霧電壓4.5 kV，離子源電壓3.5 V，離子源溫度300℃，鞘氣45 arb，輔助氣10 arb。MS1譜圖通過FTMS模式獲取，質(zhì)量掃描范圍m/z 80～1000，分辨率30000 FWHM; MS2譜圖通過ITMS模式獲取，分辨率7500 FWHM，碰撞能35 eV。

2.4?數(shù)據(jù)處理與分析

2.4.1?數(shù)據(jù)質(zhì)量評價?所有尿液樣本均取100 μL等量混合，制成質(zhì)量控制樣本（Quality control，QC），處理方法同一般尿液樣本。樣本檢測前先進5針QC樣本，使系統(tǒng)平衡。每隔10個樣本插入1個QC樣本進行檢測，同時所有樣本按Excel生成的隨機數(shù)字表進樣，以消除進樣次序?qū)Ψ治鼋Y(jié)果的影響。根據(jù)QC樣本中分布于不同保留時間的代表性離子的色譜峰強度信息，對儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性和分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行評價。采用PCA分析評估QC樣本聚類效果，并為后續(xù)樣本預處理參數(shù)設定提供依據(jù)。

2.4.2?數(shù)據(jù)預處理?原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用ABF converter（http：//www.reifycs.com/AbfConverter/ index.html）軟件轉(zhuǎn)換為“abf”格式，利用MS-DIAL[12]進行數(shù)據(jù)預處理，包括峰提取、峰校準、濾噪和數(shù)據(jù)簡化處理，并通過Mona數(shù)據(jù)庫（http：//mona.fiehnlab.ucdavis.edu/）進行物質(zhì)鑒定，得到三維矩陣數(shù)據(jù)集，坐標分別為： 化合物名稱、保留時間及根據(jù)峰高提取的峰面積（Peak heigh）。隨后對數(shù)據(jù)集進行Loess校準（Loess normalization）及Pareto校準（Pareto scalling）。

2.4.3?多元統(tǒng)計分析?采用MetaboAnalyst 4.0[13]?（http： / /www.metaboanalyst.ca）進行PCA和OPLS-DA分析。同時，對數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換（Log transformation），使其基本滿足正態(tài)分布及方差齊性，進行組間獨立樣本t檢驗和倍數(shù)變化（Fold change， FC）分析。根據(jù)FC及t檢驗所得的p值及False discovery rate（FDR）值篩選差異性代謝物，當 FC>1.50或 FC<0.67及FDR<0.05 時，提示該代謝物為膽道閉鎖潛在生物標志物。

2.4.4?潛在生物標志物鑒定及代謝通路分析?根據(jù)精確分子量和MS/MS 結(jié)果以及與HMDB、METLIN數(shù)據(jù)庫或標準品進行比較，鑒定尿液中膽道閉鎖潛在的生物標志物。隨后，將這些代謝物導入MetaboAnalyst 4.0中進行代謝通路分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?膽道閉鎖患兒和正常嬰兒尿液LC-MS總離子流圖

尿液樣本采用UHPLC-LTQ/Orbitrap-MS分別在正負離子模式下進行檢測分析。圖1為隨機選取一例正常嬰兒和一例膽道閉鎖患兒的在正負離子模式下的總離子流圖（Total ion current，TIC）。由圖1可見，不同類型的代謝物均得到較好分離。本研究從譜圖中最終鑒定出34個差異性代謝物，如圖1A及圖1C中的標記，相應代謝物的詳細信息見表2。為獲取譜圖中詳細定量生物學信息，進一步采用PCA和OPLS-DA分析對膽道閉鎖組和正常對照組之間的差異進行評估。

3.2?數(shù)據(jù)質(zhì)量評價

將經(jīng)過loess校準后的數(shù)據(jù)集導入MetaboAnalyst 4.0軟件進行PCA分析。如圖2所示，正離子和負離子模式下，QC樣本位于95%置信區(qū)間內(nèi)，且集中于一點，代表質(zhì)量控制樣本偏差小，實驗過程中儀器誤差及人工誤差均較小。經(jīng)計算，正離子模式下QC內(nèi)各離子峰面積的相對標準偏差（RSD）均值為4.4%，負離子模式下QC內(nèi)各離子峰面積的RSD均值為8.6%，表明數(shù)據(jù)可靠。

3.3?膽道閉鎖代謝輪廓分析及差異性代謝物鑒定

采用PCA分析統(tǒng)計膽道閉鎖組和正常組尿樣中的代謝物變化趨勢。圖3為正負離子模式下的PCA得分圖。圖3中每個點代表一個樣本在二維平面上的投影，每個樣本的位置由其自身的代謝決定。處于相似的生理病理狀態(tài)的樣本通常具有相似的代謝狀態(tài)，因此在PCA得分圖上也會處于相似的位置。如圖3所示，膽道閉鎖組與正常組分別聚集，兩組呈分離趨勢。

進一步對兩組進行OPLS-DA分析。由兩組正負離子模式下的OPLS-DA圖（圖4）可見，膽道閉鎖組嬰兒與正常組嬰兒完全區(qū)分，提示膽道閉鎖與正常嬰兒的尿液確實存在代謝差異。通過FC>1.50或 FC<0.67及t檢驗（FDR<0.05）篩選膽道閉鎖潛在的生物標志物。

3.4?潛在生物標志物的鑒定

根據(jù)精確分子量和MS/MS結(jié)果以及與HMDB、METLIN和Mona數(shù)據(jù)庫比較，鑒定尿液中潛在的膽道閉鎖生物標志物。以負離子模式下的離子m/z 154.0622為例說明生物標記物的鑒定過程。該離子的提取離子色譜圖及在保留時間10.04 min時的組分質(zhì)譜圖如圖5A和5B所示。將結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中化合物進行對比，初步鑒定化合物為組氨酸。如圖5C所示，串聯(lián)質(zhì)譜的分析結(jié)果與標準品的結(jié)果完全一致，因此被鑒定為組氨酸。以同樣方法鑒定其它化合物，其中一些化合物未能鑒定出。表2列出了潛在的34種生物標志物的鑒定結(jié)果。

3.5?膽道閉鎖潛在生物標志物可能的生理學意義

將鑒定出的34種化合物數(shù)據(jù)導入MetaboAnalyst 4.0中進行代謝通路分析，根據(jù)通路影響值和顯著性分析，確定膽道閉鎖相關的代謝通路（富集分析p<0.05，impactor factor>0.1）。如圖6所示，有5條在膽道閉鎖過程中較為重要的代謝通路，分別為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代謝，組氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，提示在膽道閉鎖過程中伴隨廣泛的蛋白質(zhì)代謝紊亂，且氨基酸類差異性代謝物， 如N-乙酰-L-賴氨酸、N-乙?；?L-精氨酸、賴氨酰-天冬氨酸、L-脯氨酸、L-高瓜氨酸、瓜氨酸、L-谷氨酰胺、N-乙酰甘氨酸、蘇氨酸、組氨酸、谷氨酸等，在膽道閉鎖組均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。

本研究中膽道閉鎖患兒均存在不同程度的肝臟損害，肝臟是氨基酸代謝的主要場所，肝病過程中必然會伴隨氨基酸代謝的擾動。Zhou等[16]在基于血漿樣本的代謝組學研究中同樣發(fā)現(xiàn)，膽道閉鎖患兒體內(nèi)7種氨基酸含量呈上調(diào)趨勢，與本研究的結(jié)果一致。在本研究中，谷氨酸及谷氨酰胺參與了3條代謝通路。文獻[17]報道了L-谷氨酸可作為體內(nèi)的保護調(diào)節(jié)劑，用于應對氧化應激、腸道損傷及信號轉(zhuǎn)導抑制。此外，考慮到膽道閉鎖組患兒ALT水平整體呈升高趨勢，谷氨酸也可能來源于ALT催化丙氨酸與α-酮戊二酸生成。

精氨酸和脯氨酸代謝通路紊亂同樣存在于膽道閉鎖組。精氨酸的上下游代謝物，如L-谷氨酸、谷氨酰胺、瓜氨酸及脯氨酸，在膽道閉鎖組上調(diào)，胍基乙酸在膽道閉鎖組下調(diào)。這一代謝紊亂同樣見于以黃疸為主要表現(xiàn)的肝病患者[18]。BA患兒也存在不同程度的黃疸癥狀，推測精氨酸和脯氨酸代謝可能與膽紅素代謝紊亂有一定相關性。在前期研究[13]中發(fā)現(xiàn)，膽道閉鎖患兒的血漿樣本中同樣存在精氨酸和脯氨酸代謝通路紊亂，其中，鳥氨酸、谷氨酰胺及胍基乙酸在膽道閉鎖組呈上調(diào)趨勢。

5'-甲硫腺苷在膽道閉鎖組顯著上調(diào)，5'-甲硫腺苷是蛋氨酸合成的中間物質(zhì)，由5'-脫氧-5'-甲硫腺苷經(jīng)5'-脫氧-5'-甲硫腺苷磷酸化酶轉(zhuǎn)化生成，隨后生成蛋氨酸，5'-甲硫腺苷的顯著上調(diào)會導致蛋氨酸含量的升高。有文獻報道肝細胞功能不全的患者血漿蛋氨酸升高，且蛋氨酸代謝中主要酶的mRNA水平降低[19，20]，與本研究結(jié)果相一致。

膽道閉鎖組尿液中?；切苋パ跄懰幔═auroursodeoxycholic acid， TUDCA）也呈顯著上調(diào)。TUDCA可減少膽汁酸誘導產(chǎn)生的細胞凋亡和細胞溶解[21]，廣泛用于治療原發(fā)硬化性膽管炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化和慢性肝炎等常見疾病[22]。推測膽道閉鎖組TUDCA上調(diào)與服用此藥物相關。

酒精性肝病、原發(fā)性膽汁性肝硬化及肝外膽道閉鎖等疾病可見到肝細胞玻璃樣變，胞質(zhì)中細胞中間絲前角蛋白變性的病理改變，稱Mallory小體[23]。研究表明，Mallory小體內(nèi)存在大量由ε-（γ-谷氨酰）-賴氨酸構成的蛋白質(zhì)交聯(lián)[24]。推測這可能是患兒組ε-（γ-谷氨酰）-賴氨酸升高的原因。

雖然不能忽視研究對象飲食對于尿液代謝產(chǎn)物的影響，但考慮到所有研究對象均為約3個月的嬰兒，飲食結(jié)構簡單，且采集的尿液樣本均為通宵禁食后的晨尿，認為飲食對本研究的影響較小。

References

1?Fouquet V， Alves A， Branchereau S， Grabar S， Debray D， Jacquemin E， Devictor D， Durand P， Baujard C， Fabre M， Pariente D， Chardot C， Dousset B， Massault P P， Bernard D， Houssin D， Bernard O， Gauthier F， Soubrane O. Liver Transplant.， 2005， 11（2）： 152-160

2?Tam P， Chung P， St Peter S， Gayer C， Ford H， Tam G， Wong K， Pakarinen M， Davenport M. Lancet， 2017， ?390（10099）： 1072-1082

3?Davenport M， Ong E， Sharif K， Alizai N， Mcclean P， Hadzic N， Kelly D. Pediatr. Surg.， 2011， ?46（9）： 1689-1694

4?Balistreri W F， Grand R， Hoofnagle J H， Suchy F J， Ryckman F， Perlmutter D H， Sokol R. Hepatology， 1996， ?23（6）： 1682-1692

5?Verkade H J， Bezerra J A， Davenport M， Schreiber R， Mieli-Vergani G， Hulscher J B F， Sokol R J， Kelly D， Ure B， Whitington P F， Samyn M， Petersen C. J. Hepatol.， 2016， ?65（3）： 631-642

6?Mamas M， Dunn W B， Neyses L， Goodacre R. Arch. Toxicol.， 2011， ?85（1）： 5-7

7?ZHENG Si-Jia， WANG Qing-Qing， WANG Xiao-Lin， ZHAO Xin-Jie， XU Guo-Wang. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（12）： 1921-1929

鄭思佳， 王晴晴， 王曉琳， 趙欣捷， 許國旺. 分析化學， 2017， 45（12）： 1921-1929

8?Vinayavekhin N， Homan E A， Saghatelian A. ACS Chem. Biol.， 2010， ?5（1）： 91-103

9?WANG Su-Lan， GAO Hua-Ping， ZHANG Jing， YE Xiang. Chinese Journal of Chromatography， 2017， 35（9）： 934-940

王素蘭， 高華萍， 張 菁， 葉 翔. 色譜， 2017， 35（9）： 934-940

10?Zhao D， Han L， He Z， Jun Z， Zhang Y. Plos One， 2014， ?9（1）： e85694

11?Zhou K， Wang J，Xie G， Zhou Y， Yan W， Pan W， Che Y， Zhang T， Wong L L， Kwee S A， Xiao Y， Wen J， Cai W， Jia W. J. Proteome Res.， 2015， ?14（11）： 4844-4850

12?Li W W， Shan J J， Lin L L， Xie T， He L L， Yang Y， Wang S C. Sci. Rep.， 2017， ?7： 15696

13?Li W W， Yang Y， Dai Q G， Lin L L， Xie T， He L L， Tao J L， Shan J J， Wang S C. Metabolomics， 2018， ?14（7）： 89-90

14?Tsugawa H， Cajka T， Kind T， Ma Y， Higgins B， Ikeda K， Kanazawa M， Vandergheynst J， Fiehn O， Arita M. Nat. Methods， 2015， ?12（6）： 523-526

15?Xia J， Sinelnikov I V， Han B， Wishart D S. Nucleic Acids Res.， 2015， ?43（W1）： W251-W257

16?Zhou K， Xie G， Wang J， Zhao A， Liu J， Su M， Ni Y， Zhou Y， Pan W， Che Y， Zhang T， Xiao Y， Wang Y， Wen J， Jia W， Cai W. J. Proteome Res.， 2015， ?14（6）： 2569-2574

17?Wu M， Xiao H， Ren W， Yin J， Tan B， Liu G， Li L， Nyachoti C M， Xiong X， Wu G. Plos One， 2014， ?9（7）： e100591

18?Wang X， Zhang A， Han Y， Wang P， Sun H， Song G， Dong T， Yuan Y， Yuan X， Zhang M， Xie N， Zhang H， Dong H， Dong W. Mol. Cell. Proteomic， 2012， ?11（8）： 370-380

19?Marchesini G M， Bugianesi E， Bianchi G， Fabbri A， Marchi E， Zoli M， Pisi E， Marchesini G. Hepatology， ?1992， ?16（1）： 149-155

20?Avila M， Berasain C， Torres L， Martin-Duce A， Corrales F J， Yang H， Prieto J， Lu S C， Caballeria J， Rodes J. J. Hepatol.， 2001， ?33（6）： 907-914

21?Benz C， Angermüller S， Tx U， Klters-Plachky P， Riedel H D， Sauer P， Stremmel W， Stiehl A. J. Hepatol.， ?1998， ?28（1）： 99-106

22?Crosignani A， Setchell K D， Invernizzi P， Larghi A， Rodrigues C， Podda M. Clin. Pharmacokinet.， ?1996， ?30（5）： 333-358

23?Zatloukal K， French S W， Stumptner C， Strnad P， Harada M， Toivola D M， Cadrin M， Omary M B. Exp. Cell. Res.， 2007， ?313（10）： 2033-2049

24?Zatloukal K， Fesus L， Denk H， Tarcsa E， Spurej G， Bck G. Lab Invest.， ?1992， ?66（6）： 774-777