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    氧化對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)、乳液穩(wěn)定性及消化特性的影響

    2019-07-26 08:24:38沈鵬輝樊詩(shī)堃趙謀明周非白
    食品科學(xué) 2019年14期
    關(guān)鍵詞:二硫鍵亞基乳液

    沈鵬輝,樊詩(shī)堃,趙謀明,周非白*

    (華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510640)

    大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白,其必需氨基酸組成完整,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值接近于動(dòng)物蛋白。同時(shí),因具有多種功能特性,大豆蛋白被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。然而在豆制品加工過(guò)程中,高活性脂肪氧合酶易催化多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),產(chǎn)生大量活性氧及次生氧化產(chǎn)物,可進(jìn)一步誘導(dǎo)蛋白氧化[1]。氧化通過(guò)修飾氨基酸側(cè)鏈可以改變蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu);而羰基、共價(jià)鍵的形成等會(huì)進(jìn)一步改變蛋白構(gòu)象,導(dǎo)致其二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的改變[2]。蛋白的結(jié)構(gòu)與功能緊密相關(guān),而氧化通常會(huì)伴隨著蛋白質(zhì)溶解性、保水性、凝膠性及乳化性等[3-5]功能特性的改變,從而影響蛋白的加工特性。生產(chǎn)實(shí)際中,油脂-蛋白共存現(xiàn)象使得蛋白氧化不可避免,鑒于脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程及產(chǎn)物的復(fù)雜性,明晰反應(yīng)主要副產(chǎn)物對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響是相關(guān)工作開(kāi)展的基礎(chǔ)。

    乳液是食品工業(yè)中最重要的食品體系之一,常見(jiàn)的如牛奶、乳飲料、酸奶、涂抹醬及乳化肉制品等均可歸為蛋白穩(wěn)定的乳液體系[6]。當(dāng)今社會(huì),高脂膳食導(dǎo)致人體能量攝入過(guò)剩,使得高血脂、肥胖等健康問(wèn)題日益突出。因此,乳液中脂質(zhì)的消化問(wèn)題受到越來(lái)越多食品科技工作者的關(guān)注[7-9]。通常認(rèn)為,乳液的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性與其消化特性具有密切關(guān)系。作為常用乳液界面穩(wěn)定劑,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變是影響蛋白基乳液結(jié)構(gòu)及脂肪消化特性的直接因素。梁晗妮[10]利用不同濃度脲素作用于蕓豆7S球蛋白,發(fā)現(xiàn)高濃度的脲素會(huì)使蕓豆7S球蛋白的三聚體結(jié)構(gòu)逐漸解離成單聚體,導(dǎo)致油水界面吸附蛋白濃度的減少和油滴絮凝程度的增加。Sarkar等[11]研究表明,通過(guò)控制界面蛋白的聚集可降低油脂的生物利用度,增加乳液胃排空時(shí)間,從而延緩脂質(zhì)消化。前期研究表明,氧化可改變蛋白分子間的交聯(lián)類型及交聯(lián)程度,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及表面特性的變化,進(jìn)而影響蛋白的界面行為及體相/界面蛋白的相互作用[12]。目前,關(guān)于氧化誘導(dǎo)的蛋白結(jié)構(gòu)變化對(duì)乳液消化特性影響的研究仍然很有限。

    本實(shí)驗(yàn)以丙二醛(malondialdehyde,MDA)為代表性次級(jí)油脂氧化產(chǎn)物作用于大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI),研究不同MDA濃度作用下蛋白結(jié)構(gòu)(巰基、羰基、席夫堿、等電點(diǎn)和亞基組成)的變化。進(jìn)一步以氧化蛋白制備水包油(O/W)型乳液并建立體外模擬脂質(zhì)消化體系,研究乳液在消化過(guò)程中的穩(wěn)定性及脂肪酸釋放動(dòng)力學(xué)。本研究擬從生物化學(xué)角度探究氧化對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)、乳液形成及乳液消化特性的影響及內(nèi)在關(guān)聯(lián),為全面評(píng)估蛋白質(zhì)氧化行為對(duì)營(yíng)養(yǎng)健康的影響提供一定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    冷凍脫脂豆粕 山東禹王有限公司;金龍魚(yú)玉米油市售;1,1,3,3-四甲氧基丙烷、牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)、乙二胺四乙酸二鈉 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、疊氮化鈉、甲醇、乙酸 廣州精科化玻儀器公司;溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R250、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、巰基乙醇、甘油、丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺 美國(guó)Genview公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SL2000A多功能粉碎機(jī) 青島納麗雅廚具設(shè)備有限公司;EL 204/EL 3002電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;CR22N高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;Sorvall Legend Micro 17微量離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;WN7501V紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海佐科工業(yè)設(shè)備有限公司;pHS-3E pH計(jì) 北京雷磁儀器有限公司;Mini-PROTEAN 3 Cell電泳儀 美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司;JB-1磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司;Nano-ZS納米粒度及Zeta電位分析儀、Mastersizer 2000粒度分布儀 英國(guó)Malvern公司;THZ-82A恒溫振蕩器常州澳華儀器有限公司;C300化學(xué)發(fā)光分子成像系統(tǒng)美國(guó)Azure Biosysterms公司。

    1.3 方法

    1.3.1 SPI制備

    將脫脂低溫豆粕粉碎至粉末,過(guò)40 目篩,然后以1∶10的質(zhì)量比加入蒸餾水分散,并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 8.0,在室溫下攪拌2 h。然后紗布過(guò)濾,室溫下以8 000×g離心20 min,收集上清液,用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 4.5,4 ℃靜置30 min后離心(8 000×g,20 min),收集沉淀,后用蒸餾水洗滌沉淀多次除去表面殘留清蛋白。取出沉淀稱量濕質(zhì)量,加入濕質(zhì)量7 倍的蒸餾水后緩慢攪拌,調(diào)節(jié)至pH 7.5,待樣品溶解后透析48 h,期間每6 h換水一次。透析后凍干,所得分離蛋白于干燥低溫的環(huán)境下保存?zhèn)溆?,并以凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量。

    1.3.2 MDA儲(chǔ)備液及氧化SPI的制備

    1.3.2.1 MDA儲(chǔ)備液的制備

    通過(guò)水解1,1,3,3-四甲氧基丙烷配制MDA儲(chǔ)備液,方法參照Wu Wei等[13]有所改進(jìn)。MDA儲(chǔ)備液經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS,10 mmol/L,pH 7.0)稀釋后在267 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,摩爾吸光系數(shù)為31 500 L(mol·cm)。

    1.3.2.2 MDA氧化SPI的制備

    將SPI分散于PBS配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的蛋白分散液,于室溫下攪拌2 h,4 ℃水化過(guò)夜(12 h),離心(10 000×g,20 min,20 ℃)并收集上清液。添加不同濃度的MDA溶液作用于蛋白分散液,使MDA的終濃度分別為0、0.1、1、2.5、5、10 mmol/L,體系蛋白終質(zhì)量濃度為30 mg/mL(含NaN30.5 mg/mL)?;旌衔锸覝兀?5 ℃)避光反應(yīng)24 h后透析36 h(取透析液于267 nm比色以確定透析完全)獲得不同氧化程度的蛋白,Lowry法測(cè)定蛋白濃度后凍干保存。

    1.3.3 氧化SPI的結(jié)構(gòu)表征

    1.3.3.1 羰基含量的測(cè)定

    參考Morzel等[14]的方法,采用DNPH比色法測(cè)定氧化SPI的羰基值,結(jié)果以nmol/mg表示。

    1.3.3.2 巰基含量的測(cè)定

    參考Morzel等[14]的方法,通過(guò)5,5’-二硫硝基苯甲酸衍生測(cè)定氧化SPI的巰基含量,結(jié)果以nmol/mg表示。

    1.3.3.3 席夫堿熒光光譜掃描

    將氧化SPI用PBS稀釋至一定質(zhì)量濃度(0.2 mg/mL)以進(jìn)行席夫堿的內(nèi)源熒光掃描。將激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為350 nm,記錄400~600 nm的發(fā)光光譜。設(shè)定狹縫寬度為5 nm,以240 nm/min收集數(shù)據(jù)。記錄峰值及峰值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)。電壓為500 mV。

    1.3.3.4 氧化SPI等電點(diǎn)的測(cè)定

    將凍干SPI分散于蒸餾水中(1 mg/mL),充分水化后單向調(diào)整樣品pH 6.5~3.5,采用Nano-ZS納米粒度及電位分析儀測(cè)定不同pH值條件下蛋白分散液Zeta電位,并以此判斷氧化對(duì)SPI等電點(diǎn)的影響。

    1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

    參照Flores等[15]的方法有所改進(jìn),并分別在還原及非還原情況下進(jìn)行。其中還原性樣品緩沖液組成為:60 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)、2 g/100 mL十二烷基硫酸鈉,25%甘油、14.4 mmol/L β-巰基乙醇、0.05 g/100 mL溴酚藍(lán);非還原性樣品緩沖液不含β-巰基乙醇,其他組成與還原性樣品一致。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Markers分子質(zhì)量25~170 kDa。最終上樣量為25 μg蛋白。凝膠電泳于恒流條件(25 mA)下進(jìn)行,其中濃縮膠及分離膠分別為5%及12%。凝膠染色及脫色后于C300成像系統(tǒng)進(jìn)行圖片處理。

    1.3.5 乳液制備

    將氧化SPI分散于PBS配制成一定質(zhì)量濃度的分散液,加入玉米油,使得體系蛋白質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL,玉米油為10 g/100 mL。上述混合液經(jīng)高速均質(zhì)攪拌機(jī)預(yù)乳化(10 000×g,2 min)后,超聲處理5 min(150 W、1 s脈沖,冰浴),即得新鮮制備的乳液。添加0.02% NaN3以防微生物作用。

    1.3.6 乳液體外消化模型

    參考Tokle[16]和Zeeb[17]等的方法進(jìn)行乳液體外模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)。

    模擬胃部消化:取20 mL乳液和模擬胃液(含2 g/L NaCl,84 mmol/L HCl,3.2 g/L胃蛋白酶)1∶1混合,調(diào)pH 2.0,在120 r/min、37 ℃模擬胃部消化1 h。反應(yīng)結(jié)束后調(diào)pH 7.0。

    模擬腸道消化:取30 mL上述混合物與模擬腸液混合后進(jìn)行模擬腸道消化(37 ℃、120 r/min),終體系含10 mmol/L CaCl2、150 mmol/L NaCl、10 mg/mL膽鹽、1.6 mg/mL胰脂肪酶。在此消化的2 h內(nèi),采用pH-Stat法,通過(guò)不斷加入0.1 mol/L NaOH維持體系pH 7.0,記錄反應(yīng)時(shí)間及NaOH消耗量。通過(guò)消耗的NaOH量可計(jì)算乳液體系中游離脂肪酸釋放率,公式如下:

    式中:V(NaOH)為中和所產(chǎn)生的游離脂肪酸所需的氫氧化鈉的體積/mL;m(NaOH)為氫氧化鈉溶液濃度(0.1 mol/L);WLipid為初始脂質(zhì)的總質(zhì)量(1.5 g);MLipid為玉米油的摩爾質(zhì)量(800 g/mol)。

    1.3.7 乳液的結(jié)構(gòu)表征

    1.3.7.1 乳液粒徑的測(cè)定

    采用Mastersizer 2000粒度分布儀測(cè)定乳液油滴的粒徑大小。參數(shù)設(shè)置:顆粒折射率為1.473;顆粒吸收率為0.002;分散劑為水;分散劑折射率為1.330。采用d[3,2]表面積平均直徑表征油滴粒度的平均大?。?/p>

    式中:ni和di分別為液滴數(shù)及液滴直徑/μm。每組測(cè)3 個(gè)平行數(shù)據(jù)。

    1.3.7.2 乳液界面蛋白含量測(cè)定

    取1 mL乳液以室溫10 000×g離心60 min,得到上下兩層,其中上層為乳析層,下層為乳清層。用帶針頭的注射器將下清層取出,并過(guò)0.22 μm的濾膜,濾液采用Lowry法以BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定濾液中蛋白質(zhì)含量。界面蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算公式如下:

    式中:Cs為用于乳液制備的初始蛋白分散液質(zhì)量濃度/(mg/mL);Cf為濾液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

    1.3.7.3 非界面蛋白組成

    取1.3.7.2節(jié)得到的下清層,分別添加還原/非還原的電泳樣品緩沖液使所得樣品的蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL,樣品充分振蕩并過(guò)夜。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)參考1.3.4節(jié)。

    1.3.7.4 乳液電勢(shì)分析

    將乳液用PBS稀釋100 倍后,采用Nano-ZS納米粒度及電位分析儀測(cè)定不同pH值條件下蛋白分散液的Zeta電位,每組測(cè)3 個(gè)平行數(shù)據(jù)。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,以 ±s表示最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用SPSS 11.5(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析,通過(guò)Studente Newmane Keuls(S-N-K)測(cè)試用以比較3 組實(shí)驗(yàn)均值在5%水平上是否有顯著性差異。采用Origin 8.0軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 MDA氧化對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響

    MDA可導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛性的氧化,形成蛋白質(zhì)羰基衍生物和共價(jià)交聯(lián)物[14]。由表1可知,在較低濃度的MDA(0~2.5 mmol/L)作用下,羰基含量與MDA濃度基本呈線性變化關(guān)系,說(shuō)明MDA中的一個(gè)活性羰基以1∶1加成方式與蛋白質(zhì)的伯胺反應(yīng)形成烯胺,這與Burcham等[18]的研究結(jié)果一致。而隨著MDA濃度的進(jìn)一步增加(5~10 mmol/L),羰基的增長(zhǎng)速率明顯降低,可能是由于蛋白在MDA作用下與Cys、His和Lys殘基的NH或NH2基團(tuán),特別是與Lys殘基的ε-氨基反應(yīng)形成席夫堿而產(chǎn)生蛋白-蛋白交聯(lián)[19],通過(guò)形成蛋白聚集體而包埋了親核側(cè)鏈。

    表1 氧化對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和等電點(diǎn)的影響Table 1 Effects of oxidation on protein structure and isoelectric point

    如表1所示,較低濃度MDA(0~2.5 mmol/L)對(duì)SPI巰基含量的影響整體較?。≒>0.05),其中1 mmol/L濃度MDA作用可輕微提高SPI的游離巰基含量,可能與低氧化刺激下蛋白結(jié)構(gòu)的展開(kāi)有關(guān)。而高濃度MDA(5~10 mmol/L)作用下,巰基含量顯著下降至1.8 nmol/mg(P<0.05),損失率約32%。蛋白氧化過(guò)程中巰基會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng),出現(xiàn)一定程度的損耗并形成各種氧化產(chǎn)物,如次磺酸、亞磺酸和二硫化物等,因而蛋白氨基酸側(cè)鏈在MDA作用下可因形成二硫鍵主導(dǎo)的共價(jià)交聯(lián)而導(dǎo)致巰基損失。結(jié)合羰基含量的變化結(jié)果可知,巰基的損失伴隨著羰基的生成,表明油脂氧化產(chǎn)物MDA氧化攻擊的廣泛性。

    此外,隨著MDA濃度的增加,SPI的席夫堿熒光強(qiáng)度明顯加強(qiáng),并在0.1~5 mmol/L MDA濃度下呈線性增長(zhǎng)(y=683.48x+113.58,R2=0.996),表明席夫堿含量的增加。MDA是包含兩個(gè)反應(yīng)性羰基官能團(tuán)的分子,這些基團(tuán)易與蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)形成席夫堿,使分子間發(fā)生強(qiáng)交聯(lián);同時(shí),席夫堿熒光光譜峰值處的吸收波長(zhǎng)隨MDA作用濃度的增加而發(fā)生輕微紅移,表明蛋白所處疏水環(huán)境發(fā)生變化,可能與氧化誘導(dǎo)的蛋白交聯(lián)/聚集相關(guān)。

    由表1可知,低濃度MDA(0~1 mmol/L)對(duì)蛋白等電點(diǎn)的影響較小,而在較高M(jìn)DA濃度(2.5~10 mmol/L)作用下,SPI的等電點(diǎn)向低pH值偏移,可能與MDA作用下帶電荷氨基酸的氧化損失(NH或NH2基團(tuán)受到氧化形成席夫堿,導(dǎo)致帶正電荷基團(tuán)的損失[20])或因蛋白結(jié)構(gòu)聚集而導(dǎo)致的內(nèi)卷有關(guān)[21]。

    2.2 MDA氧化對(duì)蛋白亞基組成的影響

    圖1 經(jīng)不同濃度MDA作用后SPI的凝膠電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE patterns of SPI upon treatment with MDA at different concentrations

    SPI主要由β-伴大豆球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)組成[22]。7S是三聚體糖蛋白,分子質(zhì)量為150~200 kDa。組成7S的主要亞基分別為α(分子質(zhì)量約為68 kD)、α’(分子質(zhì)量約為72 kD)、β(分子質(zhì)量約為52 kD),這3 個(gè)亞基通過(guò)疏水相互作用形成三聚體。11S是一種六聚體蛋白,不含糖基,分子質(zhì)量為300~380 kDa。11S由5 個(gè)亞基組成,每個(gè)亞基均由一條酸性肽鏈(A亞基,分子質(zhì)量約為35 kDa)和一條堿性肽鏈(B亞基,分子質(zhì)量約為20 kDa)通過(guò)一個(gè)二硫鍵連接而成。

    由圖1可知,在非還原條件下,隨著MDA濃度的升高,170 kDa(β-伴大豆球蛋白7S,αβ2)、57 kDa(大豆球蛋白11S的AB亞基)及30 kDa(大豆球蛋白11S的A5B3亞基)的條帶濃度逐漸降低。同時(shí),高分子質(zhì)量聚集體在凝膠頂端的積聚逐漸加深,表明蛋白受氧化而產(chǎn)生聚集,且聚集程度隨著蛋白氧化的加深而不斷增加。進(jìn)一步分析在還原條件下SPI的電泳圖,研究發(fā)現(xiàn)大部分分離膠頂端的聚集體在β-巰基乙醇作用下消失,表明聚集/交聯(lián)的形成很大程度上由二硫鍵或類似機(jī)制誘導(dǎo)。同時(shí),聚集的11S組分解離形成的A、B亞基條帶在β-巰基乙醇作用下逐漸恢復(fù),且與空白樣品相比并無(wú)明顯差異,表明在MDA作用下11S組分間主要形成由二硫鍵主導(dǎo)的共聚物;然而,針對(duì)7S組分,其解離形成的α’、α和β亞基條帶僅得到部分恢復(fù),表明MDA可誘導(dǎo)7S組分同時(shí)形成二硫鍵和非二硫鍵誘導(dǎo)的聚集。此外,分離膠頂部高分子質(zhì)量區(qū)的彌散條帶強(qiáng)度仍隨著MDA濃度的升高而加深,表明高濃度MDA作用下非二硫鍵主導(dǎo)的聚集的增加。Huang Youru[23]及Wu Wei[24]等的研究也發(fā)現(xiàn)油脂氧化產(chǎn)物作用于SPI可導(dǎo)致非二硫鍵誘導(dǎo)的聚集產(chǎn)生,其中Huang Youru等[23]表明亞油酸氧化可通過(guò)增強(qiáng)蛋白分子間的疏水相互作用、氫鍵或靜電作用等非共價(jià)鍵增強(qiáng)蛋白聚集;而Wu Wei等[24]認(rèn)為這種聚集是由非二硫鍵的共價(jià)鍵引起的。結(jié)合羰基和席夫堿的結(jié)果(表1),MDA作用下非二硫鍵誘導(dǎo)的蛋白交聯(lián)很可能與形成的席夫堿有關(guān)。

    2.3 MDA氧化蛋白對(duì)乳液結(jié)構(gòu)的影響

    2.3.1 乳化活性及乳液表面電勢(shì)

    圖2 MDA氧化蛋白對(duì)乳液粒徑分布(A)和Zeta電位(B)的影響Fig. 2 Effect of MDA-induced protein oxidation on particle size distribution (A) and zeta-potential (B) of emulsion

    乳液粒徑大小可反映乳化劑的乳化活性[25]。由圖2A可知,經(jīng)MDA氧化處理的SPI制備的乳液粒徑分布差距不大,均呈現(xiàn)單峰分布;同時(shí)隨著MDA濃度的升高,各氧化樣品制備的乳液其粒徑亦無(wú)顯著差異,結(jié)果表明氧化對(duì)蛋白乳化活性影響不大。

    由蛋白穩(wěn)定的乳液油滴間的靜電排斥力與相互吸引力很大程度上由蛋白結(jié)構(gòu)決定,并與乳液穩(wěn)定性密切相關(guān)。油滴表面的電荷量決定了油滴間的排斥力大小,可通過(guò)測(cè)量表面電勢(shì)反映。MDA氧化蛋白對(duì)乳液Zeta電位的影響如圖2B所示。由于乳液pH值高于蛋白等電點(diǎn),所有乳液的Zeta電位均為負(fù)值。隨著MDA濃度的升高,蛋白乳液Zeta電位均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(絕對(duì)值升高),可能與氧化導(dǎo)致的蛋白結(jié)構(gòu)變化及其等電點(diǎn)的改變相關(guān)(表1)。尤其是高濃度MDA(5~10 mmol/L)處理后,蛋白乳液的Zeta電位顯著下降(P<0.05),與SPI的等電點(diǎn)在高濃度MDA作用下向低pH值偏移一致。

    2.3.2 界面蛋白含量分析

    圖3 MDA氧化蛋白對(duì)乳液界面蛋白含量的影響Fig. 3 Effect of MDA-induced protein oxidation on protein content at emuision interface

    由圖3可知,未氧化處理的SPI制備的乳液其界面蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為43%,而較低濃度MDA(0.1 mmol/L)處理SPI即可顯著降低其在界面上的吸附(-11.6%,P<0.05),可能與MDA誘導(dǎo)下蛋白聚集體的形成有關(guān)。已有研究表明,蛋白聚集體的形成可能通過(guò)位阻效應(yīng)降低其在界面的吸附[26],而氧化作用下增強(qiáng)的蛋白分子帶電性一定程度上可增加其移動(dòng)速率。隨著MDA氧化濃度的進(jìn)一步增加,界面蛋白含量變化平緩,雖整體上有降低趨勢(shì)但各氧化濃度之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

    2.3.3 MDA氧化蛋白對(duì)乳液非界面蛋白組成的影響

    圖4 SPI經(jīng)不同濃度MDA作用后乳液非界面蛋白組成的凝膠電泳圖Fig. 4 SDS-PAGE pattern of SPI after treatment with MDA at different concentrations

    比較氧化蛋白與乳液非界面蛋白的組分差異研究氧化蛋白對(duì)乳液界面組成的影響,由圖4可知,在非還原條件下,乳液非界面蛋白組成與氧化SPI組成(圖1)相似,但170 kDa組分條帶在2.5~10 mmol/L MDA作用下消失不見(jiàn),同時(shí)α’和α亞基在5~10 mmol/L MDA作用下也消失不見(jiàn),說(shuō)明在較高的氧化程度下,SPI的7S組分以及其α’和α亞基具有較好的吸附到乳液界面的能力;同時(shí)在還原條件下,和氧化SPI還原條件下的電泳圖相比,α’、α及β亞基恢復(fù)程度變小,其中α’較α及β更易受MDA影響,而且在MDA濃度為10 mmol/L時(shí),α’亞基條帶消失,說(shuō)明此時(shí)α’亞基全部吸附到了乳液界面上。上述結(jié)果表明,各濃度MDA處理SPI對(duì)乳液界面蛋白組分影響較大,在經(jīng)高濃度MDA氧化后更多7S組分以聚集狀態(tài)參與了界面蛋白組成,其中以α’組分吸附到乳液界面的能力最強(qiáng)。

    2.4 MDA氧化蛋白對(duì)乳液消化特性的影響

    2.4.1 乳液消化動(dòng)力學(xué)

    圖5 乳液消化動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 5 Digestion kinetic curve of emulsions stabilized by oxidized SPI

    通過(guò)比較游離脂肪酸釋放速率及程度可以分析乳液的脂質(zhì)消化特性。由圖5可知,未經(jīng)MDA氧化的SPI制備的乳液經(jīng)消化后釋放的游離脂肪酸程度最高,釋放率約為34.8%。經(jīng)0.1 mmol/L MDA處理的SPI制備的乳液釋放率顯著降低(P<0.05),但在0.1~2.5 mmol/L區(qū)間內(nèi)并無(wú)顯著變化(P>0.05)。隨著MDA濃度的進(jìn)一步升高,游離脂肪酸釋放率明顯降低并在10 mmol/L達(dá)到最低(約27%)。大量的研究表明,胃腸道中的脂肪酶必須吸附至乳滴表面才可展開(kāi)并暴露其作用位點(diǎn),進(jìn)而與油脂接觸啟動(dòng)水解過(guò)程。因而蛋白結(jié)構(gòu)的改變可通過(guò)改變?nèi)橐航Y(jié)構(gòu),影響界面蛋白吸附層與脂肪酶的交互作用,進(jìn)而改變油脂的消化進(jìn)程[27-28]。已有研究表明,7S組分可以形成高黏彈性的界面膜[29],從而阻止或減緩脂肪酶與油脂的接觸。MDA誘導(dǎo)的氧化作用下,7S組分間可形成以二硫鍵及席夫堿共誘導(dǎo)的強(qiáng)共價(jià)交聯(lián),結(jié)合乳液非界面蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果,隨著MDA濃度的升高,更多聚集狀態(tài)的7S組分參與界面組成,可增強(qiáng)界面剛性及致密性,一定程度上可減緩脂肪酶與油脂的接觸,進(jìn)而降低乳液脂質(zhì)釋放率。

    已有研究表明,膽鹽是脂質(zhì)消化中的關(guān)鍵性物質(zhì),它通過(guò)替代界面的表面活性物質(zhì)促進(jìn)脂肪酶和乳液界面層的結(jié)合,從而加快脂質(zhì)的消化[30]。研究進(jìn)一步對(duì)所獲得的消化動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行非線性擬合,以期通過(guò)對(duì)擬合曲線求導(dǎo)獲得各時(shí)間點(diǎn)的消化速率。由于脂質(zhì)的初始消化速率在很大程度上可以影響消化進(jìn)程,本實(shí)驗(yàn)主要探究蛋白結(jié)構(gòu)變化對(duì)乳液消化初始速率的改變。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述所有蛋白乳液的消化曲線經(jīng)擬合均符合下列方程:

    式中:y為游離脂肪酸釋放率;x為時(shí)間;a、b、c均為擬合參數(shù)。對(duì)上述方程求導(dǎo),其x=0點(diǎn)處的值即為乳液消化的起始速率,各MDA濃度作用SPI后制備的乳液的消化起始速率如圖6所示。乳液的起始消化速率隨著MDA濃度的升高而降低,并在0~10 mmol/L內(nèi)符合指數(shù)遞減方程(2.5 mmol/L MDA之后變化趨于平穩(wěn)):

    結(jié)果表明乳液界面上的蛋白交聯(lián)/聚集體減弱了膽鹽在脂質(zhì)消化中的作用,使得脂質(zhì)的初始消化速率降低。Maldonado-Valderrama等[31]研究發(fā)現(xiàn)高黏彈性的界面膜能夠阻礙膽鹽的替換行為。故MDA濃度的升高引起更多聚集狀態(tài)的7S組分參與界面組成,使得界面黏彈性增加,進(jìn)而阻礙膽鹽的替換行為,降低脂質(zhì)的初始消化速率。

    圖6 MDA氧化蛋白對(duì)乳液初始消化速率的影響Fig. 6 Effect of MDA-induced protein oxidation on the initial digestion rate of emulsion

    綜上結(jié)果表明,MDA氧化蛋白會(huì)改變蛋白的結(jié)構(gòu),進(jìn)而改變?nèi)橐航缑娴鞍捉Y(jié)構(gòu)及組分,氧化誘導(dǎo)的蛋白交聯(lián)/聚集可延緩或降低膽鹽在界面的替代,進(jìn)而減緩乳液消化并降低乳液脂質(zhì)釋放率。

    2.4.2 乳液消化穩(wěn)定性

    圖7 MDA氧化蛋白對(duì)乳液消化穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Effect of MDA-induced protein oxidation on the digestion stability of emulsion

    由圖7可知,與未消化樣品相比(圖2A),經(jīng)體外胃消化后,乳液的粒徑基本不變(圖7a)。Bellesi等[32]研究發(fā)現(xiàn),SPI在油水界面不易被胃蛋白酶水解,并且在模擬胃消化結(jié)束后乳液界面結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生明顯變化。經(jīng)小腸消化后,乳液的粒徑分布逐漸呈多峰分散狀態(tài)(圖7b)。乳液的消化主要在小腸中進(jìn)行,此階段發(fā)生的一系列復(fù)雜的變化,比如膽鹽吸附到界面、膽鹽和界面膜的相互作用、胰脂酶的吸附和脂質(zhì)水解、界面電勢(shì)的改變、消化產(chǎn)物的積累等,導(dǎo)致乳液狀態(tài)產(chǎn)生較大變化[32]。粒徑分布隨著MDA濃度的提高不斷右移,平均粒徑不斷增加,表明油滴在消化過(guò)程發(fā)生了一定程度的聚結(jié)。可能是由于消化過(guò)程油滴的聚結(jié)導(dǎo)致比表面積變小,使得與脂肪酶接觸的表面積變小,進(jìn)而一定程度上降低了乳液脂質(zhì)釋放率。

    3 結(jié) 論

    SPI在MDA的作用下會(huì)發(fā)生氧化交聯(lián)/聚集,且隨MDA濃度的提高,蛋白氧化程度加深。其中蛋白11S組分主要形成由二硫鍵主導(dǎo)的共聚物。7S組分同時(shí)形成由二硫鍵和非二硫鍵誘導(dǎo)的共聚物。

    不同濃度MDA氧化處理SPI對(duì)乳液的粒徑分布和界面蛋白含量影響不大,但對(duì)界面蛋白的組成影響較大,其中經(jīng)高濃度MDA氧化后,更多7S組分以聚集狀態(tài)參與了界面蛋白組成,使得界面層黏彈性和剛性增強(qiáng),阻止脂肪酶與油脂的接觸,并降低或延緩了膽鹽替代界面蛋白的程度,進(jìn)而降低了乳液的消化程度和起始消化速率。

    因此,大豆蛋白經(jīng)過(guò)脂質(zhì)次級(jí)氧化產(chǎn)物的氧化作用,結(jié)構(gòu)發(fā)生交聯(lián)聚集,使得乳液結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生改變,并使乳液具備了抗消化的特性。

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