微滴式數(shù)字PCR定量檢測杏仁露中杏仁、花生源性成分

郭楠楠，張 巖，李永波，張 濤，張雅倫，周 巍,*，王 紅,,*

（1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024；2.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050071）

植物蛋白飲料目前已成為飲料市場上不可或缺的產(chǎn)品，“天然、綠色、營養(yǎng)、健康”的特征使其越來越受消費者的喜愛，擁有廣闊的消費市場[1]。與此同時，一些不法商家為謀取利益在植物蛋白飲料中摻雜使假、以次充好，欺騙消費者，擾亂市場秩序等質(zhì)量安全問題受到了社會的廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的定性檢測方法難以準確甄別摻假程度，因此建立精準的定量分析檢測方法意義重大。

在食品安全檢測領(lǐng)域，應(yīng)用較為廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)和實時熒光PCR技術(shù)等。常規(guī)PCR技術(shù)靈敏度高、特異性好[2]，DNA條形碼技術(shù)成本低、快速可靠[3]，均被廣泛用于食品中進行定性檢測；實時熒光PCR技術(shù)不僅可用于定性檢測，還可測定循環(huán)閾值（Ct值）和初始DNA模板濃度進行相對定量[4-5]。但這些技術(shù)卻無法滿足精準定量分析的需求，微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）的出現(xiàn)為食品安全檢測帶來了新的方案。ddPCR是準確定量核酸的一門新興核酸擴增技術(shù)[6-7]，其利用有限稀釋分析和泊松分布分析來實現(xiàn)靶DNA拷貝數(shù)的絕對定量[8-10]，被稱為“第三代PCR”技術(shù)[11]。ddPCR不依賴標準曲線，對稀有事件檢測準確、靈敏，廣泛應(yīng)用于拷貝數(shù)變異檢測分析[12-13]、單核苷酸多態(tài)性分析[14]、產(chǎn)前診斷[15-17]、轉(zhuǎn)基因食品檢測[18-20]和微生物檢測[21-23]等。

ddPCR技術(shù)的興起為解決食品的摻雜使假問題提供了思路，目前，ddPCR技術(shù)在肉源性食品真?zhèn)舞b別領(lǐng)域研究較多，而在植物源性食品真?zhèn)舞b別領(lǐng)域應(yīng)用較少。在肉類摻假研究中，王珊等[24]建立了羊肉制品中羊肉和豬肉的定量檢測方法，完成了ddPCR技術(shù)和熒光PCR技術(shù)的比較；Cai Yicun[25]、苗麗[26-27]、陳晨[28]等分別研究豬肉和雞肉產(chǎn)品、肉及肉制品中豬牛源和羊源成分、羊肉和豬肉制品的定量分析方法。在植物源性食品真?zhèn)舞b別中，楊碩等[1]采用多重ddPCR技術(shù)，通過單位質(zhì)量下靶基因拷貝數(shù)之比換算植物源性成分投料比，完成了核桃露中核桃、大豆成分的定量檢測研究。

本研究在前人的基礎(chǔ)上探索植物及植物蛋白飲料（杏仁露）中杏仁和花生的定量檢測方法，基于ddPCR技術(shù)建立兩物種質(zhì)量與拷貝數(shù)之間的計算公式，進行特異性、人為摻假樣品和市售樣品的檢驗，確定該方法的準確性和適用性，達到定量分析和甄別摻假的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏仁、花生購自石家莊大型超市；10 個品牌12 個批次的杏仁露購自石家莊大型超市和農(nóng)貿(mào)市場。

深加工食品DNA提取試劑盒（非離心柱型） 天根生化科技（北京）有限公司；氯仿 北京酷來博科技有限公司；異丙醇、無水乙醇（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；分析研磨機 德國IKA公司；AdVantage Pro真空冷凍干燥機 美國VirTis公司；Milli-Q Integral 3純水/超純水一體化系統(tǒng) 美國Millipore公司；SHA-AD恒溫振蕩器 金壇市華城敏科實驗儀器廠；1-15PK冷凍離心機 德國Sigma公司；NanoDrop 2000微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司；QX200 ddPCR微滴生成儀、微滴讀取儀、S1000 thermal cycler基因擴增儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

杏仁、花生：用分析研磨機進行初步研磨于超低溫真空冷凍干燥機中凍干，用液氮進行破碎處理研磨成超細的粉末，此樣品用作本研究的模板樣品及摻假模型的制備。

市售杏仁露：分裝于玻璃容器內(nèi)于超低溫真空冷凍干燥機中凍干，用液氮進行破碎處理研磨成超細的粉末，此樣品用于實際檢測分析。

樣品制備過程中注意防止交叉污染。

1.3.2 DNA提取

梯度稱取10～100 mg杏仁、花生的模板樣品，采用優(yōu)化的深加工食品DNA提取試劑盒法進行DNA的提取：1）取梯度稱取的模板樣品至滅菌離心管中，加入500 μL的緩沖液GMO1和20 μL的Proteinase K（20 mg/mL），振蕩混勻；2）56 ℃孵育1 h，其間每隔15 min上下顛倒混勻一次；3）加入200 μL緩沖液GMO2和400 μL氯仿，振蕩混勻，靜置10 min；4）12 000 r/min離心5 min，小心吸取上清液；5）向上清液中加入0.7 倍體積的異丙醇，充分混勻后12 000 r/min離心3 min，小心棄上清液；6）加入700 μL 70%的乙醇溶液，渦旋振蕩5 s，12 000 r/min離心2 min，棄上清液；7）重復(fù)6）；8）于室溫開蓋放置，晾干殘留的乙醇；9）加入50 μL洗脫緩沖液TE，吹吸混勻，即可得到基因組DNA溶液，儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 特異性引物和探針

根據(jù)GenBank中公布的杏仁過敏源性成分Pru du1基因序列，通過軟件Primer 5.0和PRIMER設(shè)計杏仁源性的特異性引物和探針序列Almond1～5；花生源性和真核生物18S rRNA內(nèi)參照基因的引物和探針序列參考國家出入境檢驗檢疫行業(yè)標準[29-30]。本實驗所用引物和探針（表1）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物和探針序列Table 1 Sequences of primers and probes used in this study

1.3.4 微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)程序

20 μL反應(yīng)體系：ddPCRTMSupermix for Probes（no dUTP）10 μL，上下游引物各1.2 μL（900 nmol/L），探針0.4 μL（250 nmol/L），DNA模板4 μL，剩余用ddH2O補足。用微滴發(fā)生器生成微滴，進行普通PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、10 min；94 ℃、30 s，60 ℃、1 min，40 個循環(huán)；98 ℃ 10 min。最后用微滴分析器分析擴增產(chǎn)物。發(fā)生微滴過程中注意避免產(chǎn)生氣泡。

1.3.5 特異性分析

基于實時熒光PCR和數(shù)字PCR技術(shù)對特異性設(shè)計序列進行初步篩選，將初篩所得引物以無菌雙蒸水作為空白對照，分別選用植物源性物種杏仁、花生、核桃、大豆、榛果、芝麻、腰果、開心果、松子、葵花籽的DNA為模板進行數(shù)字PCR檢測，驗證引物的特異性。

1.3.6 杏仁和花生質(zhì)量與拷貝數(shù)計算公式的確定

1.3.6.1 兩物種質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系

分別準確稱取10 個質(zhì)量梯度的杏仁和花生（質(zhì)量依次從10～100 mg）樣品，提取植物基因組DNA，用NanoDrop 2000測定所提DNA的濃度。每個梯度實驗進行3 次重復(fù)。相關(guān)系數(shù)R2用Origin 9分析生成。

1.3.6.2 兩物種DNA含量與DNA拷貝數(shù)的關(guān)系

為摸索DNA含量與拷貝數(shù)的線性關(guān)系，將提取好的杏仁和花生DNA進行梯度稀釋，分別稀釋為5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ng/μL，以ddH2O為空白對照，取4 μL DNA進行ddPCR檢測。每個梯度實驗進行3 次重復(fù)。相關(guān)系數(shù)R2用Origin 9分析生成。

1.3.7 方法驗證實驗

為驗證所建立的ddPCR方法的準確性，在80 mg的質(zhì)量范圍內(nèi)建立杏仁和花生已知混合比例的摻假模型（杏仁和花生的最低質(zhì)量分數(shù)均為6.25%），按1.3.2節(jié)的方法提取各混合樣品的DNA，將提取的DNA進行30 倍稀釋，取4 μL進行ddPCR檢測，進行3 次重復(fù)。

1.3.8 檢測方法的實際應(yīng)用

10 個不同品牌12 個批次的杏仁露，按1.3.1節(jié)的方法進行前處理，按1.3.2節(jié)的方法提取DNA，用建立的ddPCR定量分析方法對杏仁露中杏仁和花生源性成分的質(zhì)量進行檢測分析，進行3 次重復(fù)，進一步驗證本研究所建方法的準確性和實際適用性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物源性分析

用真核生物18S rRNA通用引物分別對杏仁、花生模板樣品和12 個市售樣品的DNA進行普通PCR擴增，并進行2%瓊脂糖凝膠電泳。如圖1所示，空白對照、陰性對照均未出現(xiàn)擴增條帶，杏仁、花生和樣品DNA均出現(xiàn)大小140 bp左右的目的條帶，證明DNA提取成功，適宜進行后續(xù)PCR擴增反應(yīng)。

圖1 植物源性成分通用引物PCR結(jié)果Fig. 1 PCR results obtained with the 18S rRNA primers and probe

2.2 引物和探針的特異性檢測結(jié)果

基于實時熒光PCR技術(shù)對杏仁引物進行初步篩選，結(jié)果顯示引物Almond1、2 對杏仁模板DNA均有明顯擴增曲線；將這2 對引物以杏仁DNA為模板進行ddPCR檢測分析，結(jié)果顯示引物Almond1能更好地區(qū)分陰、陽性微滴，初步確定Almond1為杏仁的特異性引物。在此基礎(chǔ)上，選擇多種常見植物物種作為DNA模板對杏仁、花生引物進行進一步的特異性檢測分析，ddPCR結(jié)果（圖2、3）顯示本研究選用的杏仁和花生的引物和探針特異性良好，與其他植物物種均無交叉反應(yīng)，適用于杏仁和花生的定量檢測。

圖2 杏仁引物和探針的特異性檢測Fig. 2 Specificity evaluation of apricot kernel primer-probe system

圖3 花生引物和探針的特異性檢測Fig. 3 Specificity evaluation of peanut primer-probe system

2.3 DNA提取及含量的測定結(jié)果

為考察杏仁、花生質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系，各提取10 個質(zhì)量梯度（10～100 mg）杏仁和花生的DNA，測得DNA含量。每個梯度各重復(fù)測得DNA含量的變異系數(shù)最大為4.13%，差異較小。取3 次重復(fù)實驗的平均值進行線性擬合，結(jié)果顯示杏仁在10～100 mg的質(zhì)量范圍內(nèi)與DNA含量呈明顯的線性關(guān)系，花生在10～80 mg的質(zhì)量范圍內(nèi)與DNA含量呈明顯線性關(guān)系（圖4）。兩物種的質(zhì)量與其DNA含量呈明顯線性關(guān)系，杏仁和花生的相關(guān)性系數(shù)R2分別為0.997和0.994。

圖4 杏仁（A）和花生（B）質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系Fig. 4 Linear relationship between plant quantity and nucleic acid contents of apricot kernel (A) and peanut (B)

2.4 DNA含量和DNA拷貝數(shù)的關(guān)系

將提取的杏仁、花生DNA分別進行梯度稀釋，取4?μL稀釋后的DNA進行ddPCR檢測，每個梯度實驗進行3 次重復(fù)，擴增結(jié)果如圖5所示。每個梯度各重復(fù)所得DNA拷貝數(shù)的變異系數(shù)最大為4.72%，差異較小。取DNA拷貝數(shù)的平均值進行線性擬合，結(jié)果顯示杏仁稀釋質(zhì)量濃度在5～50 ng/μL范圍內(nèi)、花生稀釋質(zhì)量濃度在5～100 ng/μL范圍內(nèi)，隨著DNA含量的增加，DNA拷貝數(shù)相應(yīng)增加，兩者呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系（圖6），杏仁和花生線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.997和0.999。

圖5 梯度DNA含量條件下的杏仁（A）和花生（B）拷貝數(shù)Fig. 5 DNA copy numbers of apricot kernel (A) and peanut (B) at different nucleic acid contents

圖6 杏仁（A）和花生（B）DNA含量與DNA拷貝數(shù)的關(guān)系Fig. 6 Linear relationship between nucleic acid content and DNA copy number of apricot kernel (A) and peanut (B)

2.5 杏仁和花生質(zhì)量與拷貝數(shù)計算公式的建立

根據(jù)杏仁、花生質(zhì)量和DNA含量、DNA含量和DNA拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，分別以DNA含量為中間換算值，計算得出兩物種質(zhì)量與DNA拷貝數(shù)之間的公式，M杏仁=0.13C+1.24，M花生=0.081C-0.63，其中，M為植物源性成分的質(zhì)量（mg），C為DNA拷貝數(shù)（copies/μL）。

2.6 方法驗證實驗結(jié)果

分別提取已知比例混合樣品的基因組DNA，30 倍稀釋后，取4 μL進行ddPCR檢測，進行3 次重復(fù)測定，分析各重復(fù)間變異系數(shù)，將測得的拷貝數(shù)取平均值代入本研究建立的計算公式中得到測得杏仁和花生的質(zhì)量。結(jié)果顯示，各重復(fù)間變異系數(shù)均小于15%，混合樣品中杏仁、花生的測得值與實際值基本一致，最大相對誤差為-12.86%（表2），在統(tǒng)計學(xué)許可范圍內(nèi)。通過對已知摻假模型的檢測，驗證本研究所建立的ddPCR精準定量方法的準確性，表明該方法可有效應(yīng)用于對市售杏仁露樣品的檢測。

表2 已知比例摻假模型分析結(jié)果Table 2 Results of quantification of known samples

2.7 方法應(yīng)用結(jié)果

利用本研究建立的ddPCR方法，對12 個市售杏仁露中的杏仁和花生源性成分進行檢測分析，取3 次重復(fù)實驗平均值進行計算，各重復(fù)間差異較小，變異系數(shù)均小于15%。如表3所示，實驗測得杏仁露2的杏仁含量最高（90.93%），杏仁露3中未測得杏仁源性，杏仁露10、11中測得杏仁含量極少，杏仁露1、9中測得微量的花生，杏仁露12中測得杏仁含量較少（5.22%）而花生含量較多（47.61%）。這一系列的檢測結(jié)果表明市售杏仁露中存在不同程度的摻假現(xiàn)象。

表3 市售樣品檢測結(jié)果Table 3 Detection of commercial samples

3 結(jié)論與討論

本研究采用ddPCR技術(shù)探索杏仁露中杏仁和花生的定量檢測方法，通過建立質(zhì)量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，換算出杏仁、花生質(zhì)量與DNA拷貝數(shù)的計算公式，建立了可靠的定量分析方法。

本研究中將杏仁、花生原料和市售杏仁露進行凍干處理并研磨成粉，采用優(yōu)化的深加工食品DNA提取試劑盒法提取DNA，提高了提取效率，且多次重復(fù)實驗結(jié)果中杏仁、花生的質(zhì)量與DNA含量均呈明顯線性關(guān)系。該提取方法將原料與產(chǎn)品的提取方法一致化，保證了本研究所建立計算公式的適用性。

基于ddPCR技術(shù)建立了杏仁、花生的計算公式，通過已知比例摻假模型驗證了該方法體系的準確性。在摻假模型中，混合樣品的總質(zhì)量為80 mg，杏仁和花生的最低摻入量均為5 mg（6.25%），混合樣品中杏仁、花生的實驗測得含量與其真實含量相差不大，其中人為摻入量越小相對誤差值越大，最大誤差為-12.86%。表明該方法能對杏仁、花生源性進行準確定量，可有效應(yīng)用于市售杏仁露的定量檢測。

對市售的10 個品牌12 個批次的杏仁露樣品進行檢測分析，其中，杏仁露2測得杏仁質(zhì)量分數(shù)最高，占90.93%；杏仁露3中杏仁質(zhì)量分數(shù)最低，為0%且并未測得花生源性，判斷該樣品可能摻假其他物種；杏仁露9測得杏仁質(zhì)量分數(shù)不到10%；杏仁露10和11的杏仁質(zhì)量分數(shù)極少，占2%左右；杏仁露12中測得杏仁質(zhì)量分數(shù)為5.22%但花生質(zhì)量分數(shù)為47.61%，可判斷其為惡意摻假；杏仁露1和9中測得花生含量近乎為零，而實時熒光PCR檢測1、9的結(jié)果均為檢出花生源性成分，判斷可能是生產(chǎn)過程中的無意帶入而非惡意摻雜。檢測結(jié)果表明市售杏仁露中存在摻假現(xiàn)象，且摻假程度不一，本研究建立的定量分析方法可準確區(qū)分惡意摻假與無意摻雜，適宜推廣應(yīng)用。

ddPCR的每個反應(yīng)中，總微滴數(shù)均大于13 000，檢測有效，確保了本研究中定量方法的準確性。

本研究中定量方法的建立、驗證和實際應(yīng)用中各重復(fù)實驗之間差異較小，變異系數(shù)均小于15%，在統(tǒng)計學(xué)許可范圍內(nèi)。

本研究建立的ddPCR定量檢測體系準確可靠、靈敏度高、重復(fù)性好，可有效甄別市售杏仁露中的無意摻雜和惡意假冒偽劣問題，適合用于常規(guī)的量化檢測分析。該方法實現(xiàn)的精準定量檢測，可有效保護植物源性成分過敏人群，打擊制假摻假的不法商家，保護消費者權(quán)益，為植物蛋白飲料的市場監(jiān)管提供了新思路。

與此同時，該方法也可應(yīng)用于其他植物及植物蛋白飲料的定量檢測，并有望實現(xiàn)多種植物源性成分的同時定量，建立更健全的定量檢測體系，監(jiān)控植物蛋白飲料的摻假問題，維持市場秩序，為市場監(jiān)管提供技術(shù)保障。